基因芯片技术及其在结核分枝杆菌检测中的应用

基因芯片技术及其在结核分枝杆菌检测中的应用
摘要：基因芯片技术，是指将已知核酸序列的DNA或RNA片段作为探针，在芯片上做成点阵，再与待测标本中的DNA或RN;片段，按照碱基互补配对原则进行杂交，经特定软件的分析处理，获取大量相关基因信息的技术。

本文对该技术及其在结核分枝杆菌检测中的应用进行综述。

关键词：基因芯片技术；结核分枝杆菌
结核病是由结核分枝杆菌引起的一种慢性传染病，主要侵犯肺脏。

在某些经济欠发达地区，许多结核病患者因为得不到全程，合理的救治而产生结核耐药，这使得控制结核病的发生发展成为世界性难题。

目前，临床实验室采用的检测结核分枝杆菌的方法主要有抗酸染色法和细菌培养法等 .2001 年康润田[1]等应用抗酸染色、细菌培养、荧光染色、PCRPCR反向探针膜杂交法，检测59例标本(其中，结合组 43例，对照组 16例)中的结核分支杆菌，比较分析后，阳性率( %) 结果如下图：
依上图，可以得出的结论为：抗酸染色法简便、实用、快捷 , 但非结核性分枝杆菌亦可出现阳性结果；细菌培养作为结核病诊断的金标准，虽优于抗酸染色法，但时间比较长，影响早期用药；荧光染色和PC是可供选择的检测方法，却可能出现假阳性和假阴性；而依赖于基因芯片的PC杂交梳法敏感性和特异性均高，是比较准确的检测方法[1]。

1.基因芯片
基因芯片 (gene chip) 技术是随着“人类基因组计划” (human genome project,HGP) 的进展而发展起来的 , 它是 21 世纪以来影响最深远的重大科技进展之一 , 是分子生物学、微电子学及物理学综合交叉形成的高新技术。

1.1基因芯片的概念
基因是指具有遗传效应的 DNA片段，位于细胞的染色体上。

我们将大
量的基因片段按一定的顺序固定在特定的载体上，即为基因芯片，它是专门应用于核酸检测的一种生物芯片。

在一块约1cm2大小的芯片上，可固定
数千甚至上万的基因片段，由此形成一个密集的基因方阵，方便对多个基因进行同步检测[2]。

1.2基因芯片的优点
基因芯片作为一种先进的、大规模、高通量的检测技术 , 正逐步成为疾病诊断的尖端技术之一[3]，其优点主要表现在 :一，灵敏性和准确性；二，快捷简便性；三，同步性。

在医学领域，医生针对多种相似病原菌进行鉴别诊断时 , 若能应用基因芯片技术 , 则在短时间内就能知道病人是哪种微生物感染，这对指导临床合理、及时、准确的用药提供了很大的方便。

1.3基因芯片的分类：[4]
基因芯片有多种分类方法：
1.3.1按基因芯片所用载体材料分为：玻璃芯片，硅芯片，陶瓷芯片；其中，
玻璃芯片因易得，荧光背景低，应用方便等优点，被广泛应用；
1.3.2按芯片点样方式的分为：原位合成芯片，微距阵芯片，电定位芯片；
1.3.3按基因芯片用途分为：表达谱芯片，诊断芯片，指纹图谱芯片，测序芯片和毒理芯片等；
134按照载体所点DNA种类分为：寡核苷酸芯片和cDNA芯片，前者主要用于基因组学及表达谱研究，后者主要用于表达谱研究[5]。

1.4基因芯片的用途
基因芯片技术的准确灵敏性，同步性，所需样本少，污染少的特点 , 使其不仅在疾病检测方面有广泛应用，在法医学鉴定，药物筛选方面及环境科学方面同样有重要的使用价值：
疾病检测诊断方面，基因芯片只需少量标本，在短时间内，即可对所需鉴别的疾病进行同步化检测，不仅能帮助医生尽早做出诊断，还能减轻病人的痛苦，一举两得。

法医学方面，基因芯片优于早先的 DNA旨纹鉴定⑹，将这些具有遗传效应的基因片段分析处理后，可以更准确的推断生命体的特征，常被应用于尸体鉴定及亲子鉴定。

药物筛选方面[7]，基因芯片通过分析用药前后机体基因表达谱的改变，来判断药物的疗效，省时、省力又准确。

环境科学方面，目前，基因芯片已经应用于土壤中微生物的检测，水中病原菌及毒物鉴定[8]，如果应用恰当的话，可以解决人类日常生活中不少问题，使人们的生活水平得到提高。

1.5基因芯片的原理
基因芯片是将已知核酸序列的 DNA固定在某种载体上，然后与待测样品中的DNA 或 RNA按照碱基互补配对原则进行杂交，再经过特定计算机软件的处理，获得待测样品的信息。

如果待测样本为RNA —般先经逆转录过程，形成RNA-DNA 杂交体，经RNA 酶的水解，变为单链DNA再与已知的探针进行杂交[9]。

1.6基因芯片技术的主要技术环节
基因芯片主要包括 4个基本技术环节[10,11]： 1.芯片制备；2.样品制备；3.分子之间杂交反应； 4. 反应结果的检测及分析。

1.6.1 芯片制备：目前，芯片的制备主要采用的载体有玻璃片或硅胶片 , 再将DNA RNA片段或蛋白质分子按一定顺序排列在载体上，形成芯片；
1.6.2样品制备：样品的制备和处理是该技术的第 2 个重要环节。

我们所接触的样品都是复杂的生物分子混合体 , 一般不能直接与基因芯片进行反应。

因此，需要将这些混合体进行特定的生物处理,以获取所需的DNARNA片段或蛋白质分子等，并加以标记 , 标记的方法有荧光标记法，生物素标记法、核素标记法，其中，最常用的是荧光标记法，标记后的样本可以提高检测的灵敏度；
1.6.3分子之间杂交反应：此反应是芯片检测的关键一步。

芯片的杂交原理与普
通的核酸分子之间的杂交相同，其优势在于基因芯片所需样本量少，杂交时间短。

为了使反应更加精确，通常需要人为地调节反应所需的最适环境，以减少错配率 , 从而获取最能反映生物本质的信号；
1.6.4反应结果的检测及分析：目前，芯片信号检测方法是应用芯片扫描仪 , 通过采集各反应点的荧光强弱和荧光位置 , 经过软件分析 , 即可以获得相关的基因信息。

1.7基因芯片的国内外研究现状[12] 鉴于基因芯片的诸多优点，世界上的许多国家和地区都已着手进行基因芯片的研制和开发 , 美国政府于 1998 年正式启动基因芯片计划 , 国立卫生研究院 (NIH) 、能源部、中央情报局等均参与了此项目。

同时斯坦福大学、麻省理工学院及部分国立实验室如 Argonne, Oakridge 也参与了该项目的研究和开发。

英国剑桥大学、欧亚公司也正在从事该领域的研究。

世界大型制药公司对基因芯片技术用于基因多态性、疾病相关性、基因药物开发和合成或天然药物筛选等领域感兴趣 , 也已研制或正在研制自己的芯片设备和技术设备。

我国人口众多，有着丰富的基因资源 , 由于所有疾病和遗传信息都与基因有着密切的联系 , 因此基因研究具有特别重要的价值 , 基因芯片技术的发展将大大促进我国的人类基因组计划的进程。

目前国内掀起基因芯片的研究热潮 , 联合基因科技集团有限公司成功地制作了国内第一块基因表达谱芯片和 HCV诊断芯片，并通过了由上海市科委组织的专家鉴定 ,标志着我国的芯片研究已跟上国际同行发展的步伐 ,走向产业化进程。

2．基因芯片在结核分枝杆菌检测中的应用
2.1. .基因芯片对结核分枝杆菌耐药性的研究基因芯片对结核分枝杆菌的研究一经报道，立即引起了国内外学者的高度重视，成为本世纪分子生物学的研究热点[13,14]。

在结核分枝杆菌耐药性检测方面，芯片技术可将所有突变的探针固定到一张芯片上，只须一次杂交，即可获得某一菌株对所有药物的敏感性结果，因而对指导医生合理用药非常有价值，并为控制疾病的传播提供了可能性，以下是近 12 年来各国科研人员利用结核分枝杆菌检测结核分枝杆菌所取得的成果[15]：
2.1.1 1998 年， Gingeras 等[13]利用结核分枝杆菌 rpoB 基因保守区 705bp 特异核苷酸序列探针与基因芯片进行杂交，对10 种，121 株分枝杆菌进行基因
分型与菌种的鉴定。

作者用 rpoB 寡核苷酸芯片技术与常规双脱氧核苷酸测序方法，对 10种分支杆菌种间与种内的序列多样性进行分析，并确证了几种特异性单碱基多
态性；
2.1.21999年Troesch等何设计的16S rRNA和rpoB基因序列芯片，鉴定出 70 株 27 种分枝杆菌临床分离株以及 15 株耐利福平菌株；
2.1.32002 年张万江等[17]报道应用基因芯片技术检测 1 株结核分枝杆菌药物敏感株和 4 株耐多药株结核分枝杆菌，基因芯片扫描结果经分析与传统药敏检测结果相符合。

2.1.42003年崔振玲等用［18］芯片检测耐异烟肼分离株katG、ahpC调节区域和inhA调节区域的基因突变。

同年，端木和运等［19］报道应用基因芯片检测 20 株耐INH、RFP结核分枝杆菌临床分离株的katG、rpoB基因突变；李胡渤等用 DNA0］芯片对59株耐药结核分枝杆菌进行耐异烟肼、耐利福平基因进行检测。

2.2基因芯片技术应用于耐多药结核病（MDR-TB检测的现状
至今为止，经过各国科研工作者的共同努力，已经鉴定出的结核分枝杆菌耐药相关基因如下表［21-25］
结核分枝杆菌耐药相关基因
抗结核药物耐药相关基因编码对象
rpoB RNA聚合酶B亚基利福平（RFP
katG
过氧化氢酶-过氧化物酶
in hA 烯酰基载体蛋白还原酶
ahpC 烷基过氧化氢酶异烟肼（INH）
kasA
B -酮酰基运载蛋白裂合酶
oxyR 氧化-应激应答反映调节
蛋白oxyR 吡嗪酰胺（PZA）pncA 吡嗪酰胺酶
乙胺丁醇（EMB embB 阿拉伯糖基转移酶链霉素（SM rpsL 核糖体30S亚基S12蛋白
rrs 核糖体30S亚基16SrRNA
gyrA DNA回旋酶A亚基氟喹诺酮类
gyrB DNA回旋酶B亚基
2.3应用基因芯片技术检测结核分枝杆菌的优势
基因芯片法对于结核分枝杆菌的检测，主要是针对其基因的保守片段，由于其具有较高灵敏度和特异性，且操作简便，完成一个检测周期只需6-8 h,所以对于结核病尤其是肺外结核病具有较高的诊断价值［26］o
3. 展望尽管基因芯片技术发展的时间还不长，在各个科学领域还未广泛深入，应用过程中还存在这样那样不可预知的问题，但由于其自身的诸多特性，使得这项技术有着巨大的潜能，相信随着科学工作者不断的追求和探索，基因芯片技术一定会在生命科学研究领域创造辉煌的成就。

参考文献：
1. 康润田 , 胡德华，等五种方法检测临床标本中结核分支杆菌的比较分析中国防
痨杂志 [J] 2001 ， 23 （1）60.
2.蔡玉梅，张素娟基因芯片概述中国科技信息 2005,12.
3.刘瑛 , 温来欣基因芯片技术在实验室中的应用 [J]. 职业与健康 2008 ，24
（14）：1448-1449.
4.裘敏燕，李瑶，等基因芯片技术及其应用第二军医大学报 2001 ，22（6）
5.张辉，杨小洁，等基因芯片技术及其在病原微生物检测和研究中的应用动物医
学进展 2009,30（12）:100-104.
6.袁建琴，高斌站，等基因芯片技术的研究和应用山西农业大学学报 2006,5
（5）.
7.江禾，王友群基因芯片技术与药物的研究和开发世界临床药物 [M] 2008，02.
8.范金坪生物芯片技术及其应用研究中国医学物理学杂志 [J] 2009 ,26
（2）： 1115-1117.
9.严春光，陈军辉，等基因芯片及其应用中国生化药物杂志 [J] 2006 ， 27
（5）：321.
10.陈忠斌生物芯片技术 [M] ，北京：化学工业出版社 .2005.
11.M.谢纳.生物芯片技术分析[M]，北京：科学出版社.2004.
12.孙国波董飚基因芯片技术研究进展及其应用上海畜牧兽医通讯
2009,6:27-29.
13.Gingeras T R ， Ghandour G， Wang E， etal ． Simultaneous genotyping and
speciesidentification using hybridization patternrecognition analysis of genericmycobacterium DNA arrays [J]．GenomeRe，s 1998，
8（ 5）： 435－448.
14.Talaat A M ， Hunter P ， Johnston S A,al ． Genome-directed primers for
selectivlabeling of bacterial transcripts for DNmicroarray
analysis[J ]．Nat Biotechnol 2000 ， 1 8（6）： 679－682 .
15.张俊仙，吴雪琼基因芯片技术及其在结核分枝杆菌菌种鉴定及耐药性检测方面的
研究进展实用医学杂志 [J],2000 ， 25（21）:3718-3719.
16.Troesch A， Nguyen H， Miyada C G， et al ． Mycobacterium species
identification and rifampin resistance testing with high density DNA
probe arrays [J]．J Clin Microbiol ， 1999， 37（ 1 ）： 49－55．
17.张万江，鲍朗，等. 利用基因芯片技术检测结核分枝杆菌耐药性的研究 [J]. 中
华检验医学杂志， 2002， 25（4）： 209.
18.崔振玲，景奉香，等•用DNA芯片快速检测结核分枝杆菌对异烟肼的耐药性
[J]. 中华检验医学杂志， 2003.
19.端木和运，张钢，等.DNA芯片法检测耐多药结核分支杆菌耐药性]J].临床医学，
2003， 23（5）： 25－26
20.李胡渤，张晨曦，等.59株耐药结核分枝杆菌DNA芯片检测结果分析]J ]. 医药论
坛杂志， 2003， 24（19）： 25－26.
21.Banerjee A， DubnauE， QuemardA， et al.inhA ， a gene encoding a target
for isoniazid and ethionamide in Mycobacterium
tuberculosis[J].Science ， 1994， 263（5144）：227-230.
22.Zhang Y， Heym B， Allen B ， et al.The catalase peroxidase gene and
isoniazid resistance of Mycobacterium tuberculosis[J].Nature ， 1992，358（2）：591-593.
23.Telenti A， Honor eN， Bernasconi C， et al.Genotypic assessmentof
isoniazid and rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis ：a blind study at reference laboratory level[J].J Clin Microbiol ， 1997，35（3）：719-723.
24.RamaswamSy， Musser JM.Molecular genetic basis of antimicrobial agent
resistance in Mycobacterium tuberculosis[J].Tuber Lung Dis ， 1998，79（1 ）：3-29.
25.张光铂，吴启秋，等主编 . 脊柱结核病学 [M]. 北京：人民军医出版社，
2007.142-156.
26.张立群，王云霞，等，高特异性基因芯片法检测结核分枝杆菌的临床应用评价中
华医院感染学杂志 2010， 20（11）：1505-1508.。