食品、口腔来源乳酸菌分离鉴定、抗菌特性研究

食品、口腔来源乳酸菌分离鉴定、抗
菌特性研究
食品、口腔来源乳酸菌分离鉴定、抗菌特性研究「篇一」
酸奶菌种的分离及鉴定
乳酸菌是指一群通过发酵糖类，产生大量乳酸的细菌总称。

乳酸从形态上可分为球菌和杆菌，并且均为革兰氏染色阳性、在缺少氧气的环境中生长良好的兼性厌氧性或厌氧性细菌。

目前，对乳酸菌的应用研究，着重于食品（如发酵乳制品、发酵肉制品和泡菜）和医药工业等人类生活密切相关的领域。

目前市售的各种酸奶制品中, 作为发酵剂的乳酸菌, 通常为保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌这两株菌。

用嗜热链球菌和保加利亚乳酸杆菌混合培养发酵的乳酸饮品能补充人体肠道内的有益菌，维持肠道的微生态平衡，且含有易于吸收的营养素，具有抑制腐败菌、提高消化率、防癌及预防一些传染病等功效，并能为食品提供芳香风味，使食品拥有良好的质地。

保加利亚乳杆菌（L.Bulgarius）:长杆形，直径1-3mm左右,能产生大量的乳酸。

酸碱度方面,为耐酸或嗜酸性,因低 pH能防止一些微生物的生长;温度方面,为嗜温至少许嗜热,最适生长温度在37-45℃之间,对低温非常敏感。

嗜热链球菌（S.thermophilus）：卵圆形，直径0.7－0.9微米，呈对或链状排列，无运动性。

为健康人肠道正常菌群，可在人体肠道中生长、繁殖。

可直接补充人体正常生理细菌，调整肠道菌群平衡，抑制并清除肠道中对人具有潜在危害的细菌。

本研究对市售主要品牌酸奶中（河南花花乳业生产的酸奶）乳酸菌进行了分离鉴定，并进一步探讨制备酸奶条件（温度、时间等），以达到最佳的天然酸奶质量效果。

一、实验内容
（1）乳酸菌的分离纯化
1．无菌操作倒平板、十倍稀释、划线分离，恒温培养
2．菌落观察与镜检 3．筛选生产用菌株（2）优化酸奶制作条件
1．制备发酵液
2．不同条件下，接种发酵菌剂并发酵生产 3．观察发酵情况
4．品尝发酵产品，进行质量评价 5．记录结果
二、实验器材
1）菌种：新鲜乳酸饮料（标记只含有保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌）
2）试剂：脱脂奶粉、蔗糖、1.6%溴甲酚绿乙醇溶液(溴甲酚绿、无水乙醇)、酵母膏、琼脂、革兰氏染液（结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、沙黄）、75%乙醇、香柏油、1mol/L NaOH、1mol/L HCl、碳酸钙；
0.4gNaOH固体、4.2ml浓HCL(分析纯)、20gCaCO3固体、酵母膏20g、琼脂30g
香柏油、脱脂奶粉100g、蔗糖10g；
3）仪器：高压蒸汽灭菌锅、恒压干热灭菌箱、超净工作台、光学显微镜、培养箱、pH试纸、酸乳瓶、培养皿（φ9或φ12）、试管、300ml三角瓶（带玻珠）、移液管、天平、牛角匙、电炉、量筒、漏斗、漏斗架、玻璃棒、棉塞、吸管、线绳、标签、500ml锥形瓶、250ml锥形瓶、250ml烧杯、酒精灯、石棉网、接种针（环）、擦镜纸
四、实验方法
4.1乳酸菌的分离纯化 4.1.1分离
(1)配制BCG牛乳培养基，分装三角瓶，包扎，灭菌备用。

BCG牛乳培养基配制
A溶液：脱脂乳粉100g,水500ml，加入1.6%溴甲苯酚绿（BCG）乙醇溶液
1ml，80℃灭菌20min。

（1.6%溴甲苯酚绿（BCG）乙醇溶液用1.6g溴甲酚绿加入20ml无水乙醇中，再加水至100ml制成）
B溶液：酵母膏10g，水500ml，琼脂20g，PH6.8，121℃湿热灭菌20min。

以灭菌操作趁热将A溶液和B溶液混合均匀后倒平板。

（2）样品的处理
按照无菌操作要求，从市售新鲜酸乳中吸取10ml检样，放入装有90ml无菌水的三角瓶内，振摇混匀。

（3）分离方法①倒培养基
在无菌室，先用紫外线照射半小时把表面菌灭了，在通风10min后，每培养皿倾注约15ml左右已溶化的BCG牛乳培养基，立即放在桌上摇匀，冷却凝固后即成平板。

②十倍稀释法
将检样充分摇匀后，用十倍稀释法稀释成10-
1、10-
2、10-
3、10-
4、10-5各种稀释度的样品液。

目的是为了确定哪个稀释度最适宜。

一般在培养基上长处50-300个菌落的稀释度为最佳。

③分离
在BCG牛乳培养基琼脂平板上划线分离，每稀释度做两个平皿。

置40℃培养箱中培养48h。

如出现圆形稍扁平的黄色菌落及周围培养基变为黄色者初步定为乳酸菌。

4.1.2鉴别
（1）配制脱脂乳试管培养基，分装试管，包扎，灭菌备用。

脱脂乳试管培养基成分：20g脱脂奶粉，285ml灭菌水。

配制好的脱脂乳培养基分装到15支试管中。

（2）选取经初步鉴定的乳酸菌典型菌落，用接种环挑取转至脱脂乳试管中，40℃培养箱中培养8～24h。

若牛乳出现凝固，无汽泡，呈酸性，涂片镜检细胞为杆状或链球状（两种形状的菌种分别选入），革兰氏染色显阳性，则可将其连续传代4～6次，最终选择出在3～6h能凝固的牛乳管，作菌种待用 4.2优化酸奶制作条件（1）乳酸菌培养基的制作
将脱脂乳和水以1:7（W/V）的比例，同时加入6%的蔗糖，充分混合，于80～85℃灭菌10～15min，冷却至35～40℃，作为制作饮料的培养基质。

即脱脂乳14.3g，无菌水100ml，蔗糖6g。

（2）接种
将纯种嗜热乳酸链球菌、保加利亚乳酸杆菌及两种等量混合菌液作为发酵菌剂，均以2～5%的接种量分别接入培养基质中即为饮料发酵液。

接种后摇匀，分装到已灭菌的酸乳瓶中，每一种菌的发酵液重复分装12瓶，将瓶盖拧紧密封。

（3）发酵
将接种后的酸乳瓶置30℃，36℃和42℃培养箱中培养2或4h时。

培养时注意观察，出现凝乳后停止培养。

然后转入4～5℃冰箱中冷藏24h以上。

经此后熟阶段，达到酸度适中（pH4～4.5）,凝块均匀致密,无乳清晰出,无汽泡,获得较好口感和特有风味。

（4）发酵产物鉴定——纸层析法将分离的纯菌种接种到乳酸菌葡萄糖发酵培养基上，40℃培养48h。

取产酸不产气的液体试管中发酵液做纸层析。

展开剂：水30mL、苯甲醇150mL、正丁醇150mL、甲酸3.3mL。

显色剂：将1.6%的溴酚蓝酒精溶液用0.1 mol／L的 NaOH调pH到6.7。

显色后，分别测定发酵液与2%标准乳酸的Rf值，确定发酵产物中是否有乳酸
五、预期结果
1．分离鉴定获得嗜热乳酸链球菌、保加利亚乳酸杆菌
2．获得酸奶制作的最佳条件
六、实验进度
食品、口腔来源乳酸菌分离鉴定、抗菌特性研究「篇二」
乳酸菌菌种的分离筛选方法
乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。

为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。

营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。

在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。

通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。

乳杆菌常用MRS琼脂作半选择培养基。

当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类时，SL培养基常用作为选择性培养基。

对于芽孢乳杆菌常用GYP培养基，链球菌有TYC培养基、MS培养基。

M17培养基被用作乳球菌的分离培养基。

嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属的一个种。

其特性为：杆菌，两端圆，不运动，无鞭毛。

粪肠球菌为革兰氏阳性，圆形或椭圆形。

乳酸片球菌细胞呈球状，直径0.6~1.0μm，在直角两个平面交替形成四联状，一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。

革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。

在MRS培养基上菌落小，呈白色。

沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。

乳酸菌在一般琼脂培养基上形成微小菌落，不易观察，所以分离时先富集培养并选择合适的培养基。

分离培养基一般添加西红柿、酵母膏、吐温-80等物质，也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。

培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据，通过对生成的乳酸量进行性能鉴定。

乳酸菌生长繁殖时需要多种氨基酸，维生素及微氧，一般菌落比较小。

分离培养基一般可添加西红柿酵母膏油酸吐温等物质，均具有促进生长作用。

也常常添加醋酸盐抑制有些细菌的生长，对乳酸菌无害。

一.筛选方法： 1.溶钙圈法：
利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。

其中培养基中加入CaCO3的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以维持培养基的PH。

筛选过程：样品预处理→梯度稀释至10-6→选择合适的稀释度涂布→37℃培养48h→挑选产生溶钙圈的菌落反复在MRS培养基上划线→挑起单菌落染色，经镜检确认为纯种→挑选革兰氏阳性单菌落→试管穿刺4℃冰箱保存。

2.溴甲酚绿指示剂法：
培养基：MRS培养基（含溴甲酚绿酒精溶液）
筛选过程：同上，不同之处是稀释涂布后长出菌落，挑取使溴甲酚绿变色的菌落。

二.菌种的分离筛选 1.培养基：
★1.1麦芽汁碳酸钙培养基：麦芽汁（10BX）1L 预先灭菌碳酸钙5-10g/L PH 自然（分离用）
★★1.2牛肉膏 10g/L 蛋白胨 10g/L 酵母膏 10g/L 番茄汁200g/L 葡萄糖10g/L 吐温0.05% CaCO315-20g/L 溴甲酚绿 0.01% PH6.0-6.5（分离用）★1.3番茄汁碳酸钙培养基：酵母膏 7.5 g/L 葡萄糖 10 g/L 番茄汁100mL 蛋白胨
7.5g/L KH2PO4 2.0 g/L 吐温 0.5 mL PH 6.0-6.5（分离用）1.4葡萄糖 20g/L 酵母膏 10g/L PH 6.0-6.5 1.5蛋白胨 8-10 g/L 酵母膏 3-5g/L 葡萄糖 13-
15g/L KH2PO4 1.5-2.0g/L MgSO4 0.3-0.5 g/L MnSO4 0.2-0.25g/L NaAC 3.0-5.0g/L PH 5.5-6.5 1.6蛋白胨 0.8-1.0g/L 糖蜜 3.0-5.0g/L 酵母膏 3-5g/L 玉米浆0.5-1.0g/L KH2PO4 0.1-0.3g/L MgSO4 0.3-0.5g/L NaC13-5g/L 葡萄糖 8-10g/L PH5.5-6.5（发酵或种子培养基）★★1.7 MRS培养基（分离培养计数用）
蛋白胨 10.0g、牛肉膏 10.0g、酵母膏 5.0g、柠檬酸氢二铵 2.0g、葡萄糖20.0g、吐温 80 1.0mL、乙酸钠 5.0g、磷酸氢二钾 2.0g、硫酸镁 0.58g、硫酸锰0.25g、琼脂 18.0g、蒸馏水1L, pH 6.5。

（分离培养基），当MRS培养基冷却至
45～50℃时,加入已灭菌的碳酸钙, 充分混匀,倒平板。

1.8 BCP培养基（溴甲酚紫培养基）
乳糖5.0g 蛋白胨 5.0g 酵母膏3.0g 0.5℅溴甲酚紫10ml 自来水1000ml
pH6.5-7.0（分离用）
1.9 BCG牛乳营养琼脂：脱脂奶粉10g，溶于50ml水中，加入1.6℅溴甲酚绿酒精溶液0.07ml，0.075Mpa 20min。

另取琼脂
2.0g，溶于50ml水中，加酵母膏1.0g 溶解后调pH6.5-6.8，0.1 Mpa 20min.趁热在无菌操作下两者混合均匀，倒平板，37℃培养24h，检查是否有杂菌。

2.分离筛选：
2.1富集培养：取1.0g（1.0ml）于无菌细口瓶中，加入无菌麦芽汁液体培养液于瓶口处，密闭，25-32℃培养48h。

若培养基表内出现绢丝波纹物，镜检杆状，革兰氏阳性，初步定为乳酸菌。

以同样方法转接2-3次，接种量3-5℅.2.2菌种分离纯化：溶钙圈法：
富集菌液或样品适当稀释至10-7，混菌法分离，先加入10-12ml MRS培养基或麦芽汁培养基，凝固后再注入4-5ml水琼脂培养基，制成厌氧环境，30℃或37℃培养2-3天（温度低时间稍长），可出现针头状或圆形稍扁菌落，周围形成透明圈。

挑取透明圈大，培养基变黄的菌落，反复划线纯化2-3次，所得单菌落编号，经镜检后，疑似乳酸菌落接种于MRS培养基培养后保存备用。

或接入液体培养基中，25-32℃培养24-48h，然后穿刺于MRS培养基或麦芽汁碳酸钙半固体培养基中，25-32℃培养48h保存备用。

2.3性能测定：乳酸菌定性试验：
不同条件下的产酸速率试验：将分离菌种接种于MRS液体培养基中25℃ 37℃温度下培养测不同菌株不同温度的pH。

方法1.吸取发酵液10ml，注入空试管中，加入10℅硫酸1.0ml，在加入2.0 ℅高锰酸钾约1.0ml，此时乳酸转化成乙醛。

取滤纸一条，在含氨的硝酸银
溶液中浸湿，横搭在试管口上，将试管徐徐加热至沸腾，使乙醛挥发，若管口滤纸变黑，证明有乳酸生成。

方法2.纸层析法：展开剂为正丁醇：甲醇：水=80：15：5，毛细血管吸取发酵液，多次点样于新华滤纸上，1.5℅标准乳酸为对照，平衡2小时后进行层析，3℅溴甲酚蓝显色计算Rf值。

产酸量测定：5.0ml发酵液于150ml三角瓶中，加中性蒸馏水10-20ml，酚酞指示剂2滴，用0.1mol/l氢氧化钠滴定至微红色。

醋酸量（g/100mL）= 氢氧化钠摩尔浓度.Vx90.08x10-3 /样品毫升数 x100 同时，进行单因素试验，分别考察醋酸速度，耐高温，耐酒精度，耐低酸度等主要生产性能，选择优势菌株。

3.菌株鉴定： 3.1菌落形态：
3.2菌体形态：（革兰氏染色观察）染色镜检：杆状阳性。

3.3乳酸菌运动性检测：半固体穿刺法 3.4生理生化：
3.3.1生化试验：产过氧化氢，产硫化氢，葡萄糖产生，硝酸盐还原，产生吲哚，甲基红，明胶液化，需氧，精氨酸，糖发酵试验。

3.3.2生理试验：
乳酸菌产酸能力曲线：将筛选的乳酸菌接种于MRS液体培养基中，25-32℃培养48h，间隔4-6h测定发酵液pH。

食盐对乳酸菌的影响：在MRS液体培养基中，添加0.0℅ 2.0℅ 4.0℅ 6.0℅氯化钠，菌种分别接种于培养基中，32℃培养48h，测定OD值。

溴甲酚绿指示剂法：
原理：溴甲酚绿指示剂在酸性环境中呈黄色，碱性环境呈蓝色，分离培养基配制后PH为6.8，加入溴甲酚绿指示剂呈蓝绿色，产酸后菌落周围变成黄色，较容易鉴别。

培养基：BCG牛乳营养琼脂
初筛：将样品富集液梯度稀释，适温培养，平板上出现扁平的黄色菌落及周围培养基也为黄色初定为乳酸菌。

复筛：将典型菌落转接脱脂乳发酵管，若凝固，无气泡，呈酸性，镜检细胞杆状或链球状，革兰氏染色阳性，连续传代若干次培养，挑选出3-4h能凝固的乳管保存备用。

注：1.乳酸菌筛选常在几种培养基同时进行：
分别在麦芽汁碳酸钙培养基，番茄汁碳酸钙培养基，BCP培养基（溴甲酚紫培养基）同时进行混菌划线或涂布培养（放厌氧袋），分别25℃ 37℃培养48h。

菌落观察：平板表面形成浅色（黄色或白色）小菌落。

麦芽汁碳酸钙培养基表面，菌落周围形成透明圈，BCP培养基（溴甲酚紫培养基）周围使紫色的培养基形成黄色包围圈。

触酶反应：厌氧菌一般无触酶（过氧化氢酶），用滴管滴加3.0℅过氧化氢于菌落上，若无气泡产生，证明该菌为触酶阴性。

将各种特征菌落分别接入斜面，培养后保存，进一步生理生化试验，以鉴定分别何种乳酸菌。

2.菌落鉴定：半固体或双平板琼脂利于乳酸菌的生长，菌落出现早。

2.1菌落形态观察：乳白色边缘不整齐，稍呈半球状凸起，实心菌落。

个体形态：半透明细杆状链状排列，大量时呈发丝状堆积。

初步认为乳杆菌。

2.2生化鉴定：在吲哚试验中，加入菌种试管无任何变化，为阴性反应。

说明该菌不具有分解色氨酸产生吲哚的能力。

明胶液化淀粉水解氢氧化钾试验均为阴性，说明此菌为乳酸菌。

（过氧化氢酶还原硝酸盐）
糖发酵试验：发酵果糖半乳糖葡萄糖乳糖产酸为阳性反应，其余麦芽糖蔗糖棉子糖鼠李糖产酸为阴性反应。

根据手册第九版判断此种乳酸菌为德氏乳杆菌保加利亚亚种。

（纤维二糖甘露醇山梨醇七叶苷水杨苷）2.3乳酸菌生长曲线pH-t测定结果：
三.几种乳酸菌筛选举例
1.嗜热链球菌：样品来源：市售酸奶培养基：M17改良培养基，培养温度：42℃，需氧情况：兼性厌氧，筛选方法：常规的稀释涂布和划线分离
2.保加利亚乳杆菌：样品来源：市售酸奶，培养基：牛肉浸膏 1.5％，酵母浸膏 0.5％，葡萄糖
3.0％，柠檬酸三铵 0.2％，七水硫酸镁 0.02％，琼脂
1.5％，pH 5.1。

培养温度：42℃，需氧情况：兼性厌氧，筛选方法：常规的稀释涂布和划线分离法。

3.双歧杆菌：样品来源：婴儿新鲜粪便，培养基：MRS培养基、NPNL培养基、TYP培养基、PTYG培养基，培养温度：37℃，需氧情况：严格厌氧，筛选方法：常规的稀释涂布和划线分离法。

读书的好处
1、行万里路，读万卷书。

2、书山有路勤为径，学海无涯苦作舟。

3、读书破万卷，下笔如有神。

4、我所学到的任何有价值的知识都是由自学中得来的。

——达尔文
5、少壮不努力，老大徒悲伤。

6、黑发不知勤学早，白首方悔读书迟。

——颜真卿
7、宝剑锋从磨砺出，梅花香自苦寒来。

8、读书要三到：心到、眼到、口到
9、玉不琢、不成器，人不学、不知义。

10、一日无书，百事荒废。

——陈寿
11、书是人类进步的阶梯。

12、一日不读口生，一日不写手生。

13、我扑在书上，就像饥饿的人扑在面包上。

——高尔基
14、书到用时方恨少、事非经过不知难。

——陆游
15、读一本好书，就如同和一个高尚的人在交谈——歌德
16、读一切好书，就是和许多高尚的人谈话。

——笛卡儿
17、学习永远不晚。

——高尔基
18、少而好学，如日出之阳；壮而好学，如日中之光；志而好学，如炳烛之光。

——刘向
19、学而不思则惘，思而不学则殆。

——孔子
20、读书给人以快乐、给人以光彩、给人以才干。

——培根。