实验二十五细胞中糖类化合物的提取及成分鉴定

实验二十五 细胞中糖类化合物的提取及成分鉴定
糖类是一类多羟基的醛或酮及其缩合物或衍生物的总称，可分为单糖、寡糖、多糖、复合糖及糖的衍生物如糖胺、糖酸等。

糖类是生物界分布极广，含量十分丰富的一类有机化合物，几乎所有的动物、植物、微生物体内都含有糖类，其功能也是多样的。

过去认为糖类在生物体内的作用主要是作为能量来源及结构物质，但近20年以来发现糖的复合物在细胞识别、细胞间物质的运输和免疫调节等方面有重要的作用。

糖复合物的信息量非常大，是生物的另一类重要生物大分子化合物。

因此糖的分离、纯化、结构测定、结构与功能的研究也受到科学家广泛的关注。

糖的提取分离方法很多，主要是依据不同糖分子的物理化学性质、溶解度的差异进行 分离提取。

近年也发展了许多新的分离、纯化方法，如薄层层析法、各种柱层析法、气相色 谱及高效液相色谱法等。

糖的定量分析方法也很多，有化学计量法如次亚碘酸法和非化学计量法如铜试剂法、 硝基试剂法等方法可供选择。

本实验主要介绍单糖、蔗糖及淀粉的分离提取、鉴定和测定的一般原理和方法。

实验原理
1．单糖及多糖的提取
单糖：凡不能水解为更小分子的糖即为单糖。

单糖种类很多，其中以葡萄糖分布最为广泛，存在于各种水果、谷类、蔬菜和动物血液中。

由于单糖分子中有多个羟基，增加了它的水溶性，尤其在热水中溶解度很大；在乙醇中也有很好溶解性，但不溶于乙醚、丙酮等有机溶剂中。

而蔗糖等双糖分子也易溶于水和乙醇中。

因此单糖和双糖一般可用热水或乙醇将之提取出来。

多糖是由多个单糖分子失水缩合而成的大分子化合物。

在自然界中分子结构复杂而多种多样，有不溶性的结构多糖如植物纤维素、半纤维素，动物的几丁质等；另有一些为贮存物质如淀粉、糖原等；还有一些多糖具有更复杂的生理功能，在动植物的生理活动中起重要作用。

多糖中的淀粉不溶于冷水及乙醇，但可溶于热水中形成胶体溶液。

因此可以用乙醇提取单糖及低聚糖，然后提取淀粉等多糖。

样品中的蛋白质、色素等杂质可通过加入醋酸铅、氢氧化钡、铁氰化钾等清洁剂将之除去。

2．单糖和寡糖的测定——Somogyi-Nelson法
单糖具有还原性，可将铜试剂还原生成氧化亚铜，在浓硫酸存在下与钼酸盐生成蓝色化合物，可在560nm下测出其光密度值，在一定浓度范围其光密度值与糖浓度呈比例关系。

其反应如下：
2Cu2++还原糖→Cu20
Cu2O+H2S04→2Cu+
2Cu++MoO42-+SO42-→2Cu2++蓝色化合物
3．硫酸一酚法测定糖含量
糖类物质与硫酸作用脱水，生成糖醛酸或糖醛酸衍生物。

糖醛酸及其衍生物可与苯酚反应，生成有色的物质，己糖在490 nm处，戊糖及糖醛酸在480nm处有最大吸收，吸收值与糖含量呈线性关系。

4．淀粉的测定
淀粉是由葡萄糖通过α (1→4)糖苷键及α (1→6)糖苷键连接而成的大分子化合物(支链
淀粉)，一般需要酸或淀粉酶将之水解为葡萄糖后，测定其葡萄糖含量，根据葡萄糖含量再换算为淀粉含量，其水解方程式如下：
(C6H1005)n+nH20一n(C6H1206)
因其水解时一个葡萄糖单位增加了一个H2O分子，故从葡萄糖含量换算为淀粉含量时，需乘上0．9的换算系数。

5．纸层析及薄层层析法分离、鉴定及定量测定糖类组分
在某些样品中或提取液中，糖的组分较为复杂，常常是一些单糖、寡糖的混合物。

为了进一步了解样品中糖的组成及含量，常可通过色谱法进一步分离、鉴定及定量测定其组成。

在糖的色谱分析中纸层析及薄层层析法由于其操作简便、快速，不需特殊分析设备而被广泛应用。

(1)纸层析法
纸层析是属于分配层析的范畴，其原理主要是各组分之间的分配系数存在差异。

纸层析是以滤纸为支持物，滤纸的纤维素与水牢固结合而形成固定相，与固定相不相混溶的有机溶剂为流动相。

如果有多种物质(如不同糖类组分)存在于两相中，则其随着流动相的移动而连续地、动态地不断在两相中进行分配，由于各种物质的分配系数不同，从而各组分以不同速度移动，结果不同组分彼此分离。

被分离的物质在滤纸上移动的速率可用比移值R f表示： R f=起点到层析点中心的距离/起点到溶剂前沿的距离
R f随被测物质的结构、固定相与流动相的性质、温度以及滤纸的质量等因素而变化。

当温度、滤纸等实验条件固定时，比移值就是一个特有的常数，因而可作为定性分析的依据。

几种糖的R f见下表。

表1-2-6 在不同溶剂条件下几种糖的R f(20℃)
一般说来，糖类的R f依次为单糖>二糖三糖；戊糖>己糖；在己糖中，酮糖>醛糖。

也有例外情况，如展开剂内含有酚时，果糖移动速度就较木糖要慢些。

二糖的R f中，α (1→4)键要比α (1→6)键的大一些；而α—D一葡萄糖苷的二糖则较β—D一葡萄糖苷的二糖要大一些。

层析展开剂常用的有机溶剂是酚、正丁醇、乙酸乙酯，也可采用与水互溶的溶剂，如丙 醇、丙酮、吡啶。

常用的展开剂有正丁醇：醋酸：水，酚：水(20℃饱和)等。

分离单糖及二糖常用的展开剂组成见下表。

表1-2-7 分离单糖和二糖用的展开剂
展开剂 体积比 被分离的混合物 乙酸乙酯:吡啶:水 2:1:2 木糖、阿拉伯糖、甘露糖、
半乳糖、葡萄糖 乙酸乙酯:乙酸:水 3:1:3 木糖、阿拉伯糖、甘露糖、
半乳糖、葡萄糖 苯甲醇:乙酸:水 3:1:3(用下层) 庚酮酸
正丁醇:吡啶:水 45:25:40 乳糖、半乳糖、葡萄糖
正丁醇:乙醇:水:NH340:10:49:1 从尿中分离葡萄糖
正丁醇:乙醇:水 10:1:2 蜜二糖、果糖、葡萄糖
正丁醇:乙酸:水 4:1:5（溶剂层） 葡萄糖、半乳糖、甘露糖等
六碳糖，阿拉伯糖、木
糖等五碳糖，乳糖等二
糖
正丁醇:吡啶:水 6:4:3 鼠李糖、岩藻糖、半乳糖、
甘露糖、葡萄糖等 乙酸丁酯:乙酸:水 3:2:1 用于分离中性糖
异戊醇:吡啶:0.1mol/L HCL 2:2:1 用于分离中性糖 正丁醇:乙醇:水 4:1:1 用于分离戊糖 乙酸乙酯:吡啶:水:乙酸 5:5:3:1 用于分离中性单糖
(2)薄层层析法
薄层层析是一种快速、简单的层析法，因固定相的不同可分为分配层析(如以纤维素为固定相)及吸附层析(如硅胶)。

分配层析是利用不同溶质分子在互不相溶的两相之间的分配系数(K)不同而达到分离的目的。

K=流动相中溶质的浓度/固定相中溶质的浓度
吸附层析(本实验使用的方法)则是根据吸附剂对所分离物质的吸附能力不同，而将它们分开。

但不论是分配层析或是吸附层析，被分离物质的R f是一个重要的分离参数, R f为溶质在固定相上移动的速率。

R f= 起点到层析点中心的距离/起点到溶剂前沿的距离
对于某一物质，在一定溶剂系统中，在一定温度下，R f是该物质的一个特征常数。

R f 差别愈大，则分离效果愈好。

因此可以根据分离物质的性质，配制不同配比的展开剂，以 扩大分离物质之间的R f差异，从而可以达到良好的分离效果。

根据同一块硅胶板中分离的糖组分的R f与已知标准糖的R f作比较，即可鉴定提取液中糖的组成。

需要定量测定某种糖时，可以从薄层板上，将该点刮下，用蒸馏水或甲醇将之浸提出来，然后用硫酸一酚法测定洗脱液中糖的含量。

实验材料与设备
1．用品与仪器
电热恒温水箱，离心机，离心管，分析天平，烘箱，容量瓶，三角烧瓶，大试管，试管架，722型分光光度计，25 mL比色管，层析缸，新华1号滤纸，硅胶层析板10 cm×20 cm，烧杯， 刻度吸量管，移液器，毛细管。

2．试剂
(1)铜试剂A：将25 g无水碳酸钠、25 g酒石酸钾钠、20 g碳酸氢钠和200 g无水硫
酸钠溶解在800 mL蒸馏水中，待完全溶解后，定容至1000 mL。

铜试剂B：配制15 g／100 mL CuS04·5 H20，每100 mL滴加1～2滴浓硫酸。

在应用前取25 mL A与l mL B混合，现配现用。

(2)砷钼酸盐显色剂：溶解25 g钼酸钠在450 mL蒸馏水中，在搅拌下加入21 mL浓硫 酸，加25 mL砷酸钠(3 g Na2HAs04·7H20溶解在25 mL蒸馏水中)，将此混合液在37℃水浴中保温24—48 h，或在55℃保温25 min后方可使用，贮存于棕色瓶中。

砷酸钠有毒，配制时要小心。

(3)标准葡萄糖液：准确称取100 mg无水葡萄糖，溶解后，定容至100 mL即为1 mg/mL 葡萄糖溶液。

(4)5 mol／L HCl。

(5)l％碘一碘化钾(I—KI)溶液：将碘化钾20 g及碘lO g溶于100 mL蒸馏水中，使用 前需稀释10倍。

(6)0．1％甲基红指示剂：取0．1 g甲基红溶于100 mL 80％乙醇中。

(7)l％酚酞指示剂：l g酚酞溶于100 mL 95％的乙醇中。

(8)5 mol／L NaOH：取20 g NaOH溶于蒸馏水，并定容至100 mL 70％~85％乙醇。

(9)80％苯酚：80 g重蒸分析纯苯酚，加水20 mL使之溶解，置冰箱中保存备用。

(10)6％苯酚溶液：取80％苯酚临时配制。

(11)浓硫酸：分析纯。

(12)苯胺一二苯胺显色剂：V(2％二苯胺丙酮溶液):V(2％苯胺溶液):V(85％磷酸)为5：5：1。

(13)5 g／100 mL硫酸锌溶液。

(14)0．3 mol／L Ba(OH)2溶液。

(15)10 g／100mL NaOH：取10 g NaOH溶解后，加H20至100 mL。

(16)乙酸乙酯，乙醇，葡萄糖，果糖，甘露糖，蔗糖。

实验操作程序
1．还原糖及蔗糖的提取及测定
(1)抽提：称取25 g葡萄(去核)或其他材料，将之磨碎后转入250 mL三角烧瓶中，加 入80％乙醇50 mL，放在50℃水浴箱中抽提30 min。

5 000 r／min离心10 min，收集上清液，沉淀用85％乙醇适量再提取l～2次(视样品不同而定反复抽提的次数)。

收集合并所有 上清液，沉淀部分烘干留待提取测定淀粉等多糖用。

(2)去色素及蛋白质等杂质：取25 mL乙醇提取液，在水浴锅上蒸干，用pH试纸检查，如溶液为酸性，可加少许固体碳酸钠中和，以免蔗糖被酸解。

蒸干后加入少量水，边搅拌边加入Ba(OH)2 2～10 mL，加入的量视色素深浅而定，色素深则多加(约7～8 mL)。

沉淀完全后，加入1滴酚酞指示剂，然后滴加ZnS04溶液，边加边搅拌，以沉淀钡盐，滴至红色褪去，再回滴Ba(OH)2溶液，使刚出现淡红色，即为终点。

过滤并用少量蒸馏水洗沉淀，将滤液倒入容量瓶中，并定容至刻度，便可留待测定还原糖及蔗糖。

(3)测定(somogyi_Nelson法)：吸取糖液1 mL(含糖25～50µg，如糖浓度太高，可适当 稀释)，加入到25 mL的比色管中，加入1 mL铜试剂(25 mL A+l mL B，现用现配)，用蒸馏 水作空白对照，充分混匀后，在沸水浴中加热20 min，用冷水冷却至室温。

加入1 mL砷钼 酸盐显色剂，用蒸馏水稀释至25 mL，在560 nm处测定光密度值，然后查标准曲线，即可知待测液中还原糖的含量。

(4)标准曲线的绘制：配制每mL含10、20、40、60、80、100µg的葡萄糖标准溶液各 10 mL。

将试管编号，依次向每管内加入1 mL上述葡萄糖标准溶液及1 mL铜试剂，充分混 匀后，在沸水浴中加热20min，用冷水冷却至室温。

加入1 mL砷钼酸盐显色剂，用蒸馏水
稀释至25 mL，在560 nm处测定光密度值。

以蒸馏水代替葡萄糖作为空白对照，以光密度值作纵坐标，糖的浓度作横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。

(5)计算结果：根据光密度值从标准曲线上查出相应的糖浓度，按下式算出样品含糖 量：
X=(A×B) ×100%/C(mg/100g)
X为样品中含糖量的百分数，A为样品待测液的稀释倍数，B为样品待测液中含糖的mg数，C为样品质量（g）。

2.蔗糖含量测定
如果需要测定样品中的蔗糖含量，则须先经盐酸水解糖的提取液后，测定样品中的总的糖含量，然后减去上述所测得的还原糖的含量，即为蔗糖含量：
HCl
C12H22011+H20→C6H1206(葡萄糖)+ C6H1206 (果糖)
吸取上述糖的提取液10 mL，放人50 mL三角烧瓶中，加入5 mol／L HCl 2 mL煮沸5 min，使之转化为还原糖后，用5 mol／L NaOH溶液中和(用酚酞为指示剂)。

中和后用水稀释至刻度，吸取5 mL水解液按上述Somogyi—Nelson法测定提取液中总糖含量。

从测得的光密度值查标准曲线后即可算出总糖含量。

蔗糖含量可按下式计算：
蔗糖含量=(总糖含量一还原糖含量)×0．95
式中系数0．95是由于蔗糖水解时增加了一个水分子的质量后的换算值。

3．淀粉的水解及测定
(1)提取：取乙醇提取后的沉淀物0．5 g，放入三角烧瓶中，加2％HCl 25 mL，盖上表面皿，在沸水浴锅中加热水解，并经常摇动，1．5～2 h后，取一滴水解液放在白瓷板上，加l滴1％I—KI溶液，检查淀粉是否水解完全，如为紫蓝色，则说明水解不完全，再继续水解0．5 h，直至水解液对I—KI不显色为止。

(2)转移和沉淀蛋白质：样品冷却后，小心将三角烧瓶中的水解液转移至100 mL的容量瓶中，并用蒸馏水冲洗三角烧瓶3次。

向溶液中加入1滴甲基红指示剂，用10 g／lOOmL NaOH 中和至微碱性(溶液由红色变为淡黄色)。

再慢慢加入 5 mL ZnS04溶液和5 mL 0.3 mol／L Ba(OH)2以沉淀蛋白质，振荡后静置，待上清液澄清后，再滴加几滴Ba(0H)2溶液，直至无白色沉淀产生为止，加水定容至100 mL，混匀后过滤或离心。

上清液即为淀粉的水解液。

(3)测定水解液中还原糖的含量：吸取水解液5 mL，稀释至25 mL(稀释度应视样品中 淀粉含量而定，要求在比色时，光密度值落在标准曲线上)。

取1 mL稀释液加入试管中， 然后加1 mL铜试剂，在试管口盖上玻璃球，放入沸水浴中煮沸20min(时间要准确)，取出 放入冷水中冷却5 min，随后加入l mL砷钼酸盐显色剂(有毒，小心操作，不能用嘴吸取)。

最后加7 mL蒸馏水稀释，摇匀，在分光光度计上560 nm处测定光密度值，然后求出葡萄 糖含量。

(4)结果计算：
淀粉含量％=(A×N×100)×0．9/(W×106)
A为标准曲线上查得的葡萄糖含量,N 为稀释倍数，W为样品质量(g)。

4．糖的纸层析及薄层层析
(1)糖类的纸层析鉴定及定量
1)鉴定：①滤纸的准备：纸层析法以滤纸为固定相的载体，因此需要选择适合供层析分离用的滤纸，裁成适宜大小，即可使用。

对纸的一般要求应是质地均一，厚薄均匀，纸应平整无折痕，否则会使流动相流速不匀，分离不规则。

②点样：分别用毛细管吸取各种标准糖溶液及糖类提取液在滤纸一端约1．5 cm处取约2 cm间距点上各样品溶液。

点样不宜过多或
过少，常用量为5～30µg，制备型的分离可点样到mg量，记录各样本在滤纸上的排列位置。

待溶剂蒸发后将滤纸置于盛有展开剂的标本缸中，点样一端在下(但样本不能浸没在展开剂中)，按上行方式进行展开(如图)。

③待展开剂上升至适当高度，将滤纸取出，热风吹干，喷洒新鲜配制的苯胺一二苯胺试剂，放置片刻或热风吹干后即见色斑显出。

④层析后糖的定性：苯胺一二苯胺试剂使大多数糖呈各种不同的颜色，从而帮助糖的鉴定。

2)定量：其测定方法可分为两大类，一类为洗脱测定法，将所需测定的斑点所在部位的纸剪下，用适当溶剂洗脱(常用的溶剂有甲醇、乙醚、氯仿、氯仿一甲醇、丙酮等)，再选用 适当方法定量；另一类为直接测定法，层析分离后，用仪器扫描斑点而测定其含量。

①标准曲线的制作：准确称取标准葡萄糖100mg于100 mL的容量瓶中，用蒸馏水定 容至100 mL(1 mg／mL)，然后稀释至100µg／mL供测定使用。

取6支试管，分别加入O．2、O．4、0．6、0．8、1．0、1．2 mL(100µg／mL)标准葡萄糖溶液，依次加水至总体积为1 mL，另取一支试管加1 mL蒸馏水作空白对照，向每一试管加入1 mL6％苯酚溶液摇匀，再加入5 mL浓硫酸，摇匀后煮沸20 min，在490 nm下测出各管的光密度值(OD)。

以OD值为纵座标，葡萄糖的含量为横座标绘制标准曲线。

②样品测定：把需要定量测定的层析点切下，同时在同一层析滤纸上剪下一块同样大小的空白滤纸作对照。

将滤纸片剪成小块，分别放入一大试管中，加入适量的蒸馏水，进行浸提，并不时轻轻振荡，10 min后以玻璃棉过滤，得到样品洗脱液，取1 mL洗脱液置一大试管中，加入l mL 6％苯酚溶液，再加入5 mL浓硫酸，摇匀。

煮沸20min后，以空白对照调零测出在490 nm处光密度值，然后从标准曲线上查出样品的糖含量。

(2)糖的薄层层析鉴定
1)上样：取一块硅胶G薄层玻板，在使用前先在110℃放置30 min，取出冷却后，距薄 板的一端2.5cm处画一直线，然后每隔1 cm用铅笔轻轻作一记号，但不要刺破硅胶薄层,共5个点。

取一管口平齐、内径约1 mm的毛细管，分别点上标准样(葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露糖)及糖的提取液。

每次点样后，原点扩散直径应不超过2 mm，可用吹风机吹干，重复点样3～4次，总体积5µL(约5µg左右)。

2)展开剂的选择原则：主要根据样品的极性和样品在溶剂中的溶解度。

常用溶剂的极性顺序是甲醇>乙醇>丙醇>正丁醇>乙酸乙酯>氯仿>乙醚>苯>石油醚。

在一般情况下先选用单一的溶剂如乙酸乙酯进行展开。

如果所分析的成分R f很大，可考虑选用一种极性较小的溶剂，或采用加进一种或二种极性较小的溶剂组成混合溶剂。

本实验采用乙酸乙酯：甲醇：乙酸：水(12：3：3：2)作为展开剂，展开剂使用前临时配制。

3)展层：展层需在密闭器皿中进行，为了加速玻璃器皿内蒸气的饱和，可用浸有展开剂的滤纸，贴在层析缸内壁上，这样会使R f更恒定。

按上行方式，将已点样的薄层层析板放入层析缸内，点样端浸入展开剂中，但要注意样品点勿浸入溶剂中(如图)。

待展开剂到达离层析板上沿l～2 cm时，取出层析板，置空气中自然干燥，或用吹风机吹干。

4)显色：显色一般可用纸层析的显色剂。

对于单糖可用茴香醛一硫酸试剂，喷雾后在100～105℃下烘烤至显色，最低检出量为0．05µg，不同的糖显出不同的颜色；另一种常 用的显色剂是苯胺一二苯胺显色剂，喷雾后在80℃加热10 min，不同的糖显不同的颜色。

图1.2.5 薄层层析装置
如果分离的是寡糖和多糖，则可使用下表的展开剂。

表1-2-8 用于寡糖和多糖分离的展开剂
展开剂系统 体积比 糖种类
正丁醇: 乙醇 : 水
正丁醇: 乙醇: 水
乙酸乙酯 : 吡啶: 水
杂醇油 : 吡啶: 水
正丁醇 : 吡啶: 水: 苯 25%丙醇溶液在0.067mol/L 磷酸盐缓冲液中
（PH6.4）75ml/100mL
异丙醇 : 乙醇
10: 1: 2
4 :1: 5
8 :2: 1
6: 4 :3
1: :1 1
50: 30 :30: 4.5
9 :1
寡糖
寡糖
寡糖
寡糖
寡糖
棉籽糖
粘多糖
支链淀粉
鉴定直链淀粉时可用苯胺一邻苯二甲酸试剂；还原性多糖用Somogyi试剂；粘多糖用 甲苯胺蓝试剂显色；鉴定淀粉用1％碘乙醇溶液；棉子糖可用α一苯酚试剂显色。

讨 论
1．自植物中提取糖类时，一般都是利用水和醇进行抽提。

因此能溶于水的色素、蛋白质、丹宁、果胶、有机酸等也会随同糖一起被提取出来，从而干扰糖的分析。

为了除去干扰物，常需使用澄清剂，如中性醋酸铅、碱性醋酸铅、氢氧化钡等，选用澄清剂时应注意选择那些使蛋白质等干扰物质沉淀而糖类不沉淀、不被吸附，也不会影响糖的物理化学性质和随后糖的鉴定和测定。

2．植物体内有许多能水解糖的酶，因此在分离糖时必须适当地破坏或抑制酶的活性，方能提取天然状态下的糖类。

比如采集的新鲜材料应迅速加热干燥或冷冻保存等，使用新鲜材料提取时，宜用沸水和提高乙醇的浓度至85％；如果材料的脂类和色素很高，可用石油醚浸提除去脂和色素。

3．淀粉测定采用酸水解方法时，如果样品含有半纤维素等多糖，也会被水解为具还原力的单糖，如木糖、阿拉伯糖等，因而影响分析结果。

用酶法水解则专一性强，可避免提取液中半纤维素等多糖的干扰。

4．Somogyi-Nelson方法测定还原糖时重复性较好，生成的蓝色络合物非常稳定，但用 该法测定还原糖时，不能用柠檬酸配制铜试剂，因为柠檬酸会抑制显色反应。

5．用比色法测定糖的含量时，需同时制作标准曲线，未知样品的浓度必须调节至其OD 值在标准曲线的范围以内。

6．硫酸一酚法除可测定单糖外，还能测定寡糖及多糖。

该方法简单、迅速、灵敏度高、
重复性好，用以测定从纸层析或薄层层析斑点上洗脱下的糖时，效果很好，但样品中含有色氨酸或色氨酸含量高的蛋白质时，对显色反应有一定干扰。

7．应用纸层析或薄层层析分离糖时，应用密封式展层时，其R f可作为鉴定糖的参考依据。

在层析时要同时点上已知标准的糖以作比较。

进行定性及定量时，要注意在相同条件下做重复实验，这样方能获得重复的结果。