烟草叶片蛋白3种提取方法的比较研究

烟草叶片蛋白3种提取方法的比较研究
摘要:使用酚/SDS法､Tris-HCl法及TCA/丙酮沉淀法提取烟草(Nicotiana tabacum)叶片蛋白,从终产物形式､颜色､提取时间､蛋白产量､SDS-PAGE电泳图谱等方面对3种方法进行比较,对提取的烟草叶片蛋白进行Western Blotting检测来评价3种方法提取蛋白的效果｡结果表明,与2种常用方法相比,酚/SDS法具有快速､操作方便等特点,提取的蛋白纯度高､种类丰富,可用于Western Blotting检测,是一种合适的提取植物组织中蛋白的方法｡
关键词:烟草(Nicotiana tabacum)叶片;蛋白;Tris-HCl法;TCA/丙酮沉淀法;酚/SDS法
Comparison Study on Three Methods for Tobacco Leaf Protein Extraction Abstract: Protein was extracted from tobacco(Nicotiana tabacum) leaves by three methods, phenol/SDS method, Tris-HCl method and TCA/acetone precipitation method. The extracting efficiency of the three methods was evaluated through the color and form of product, extraction time, protein yield and SDS-PAGE. Furthermore, the extracted protein was detected by Western Blotting. The results showed that compared with the other two methods, phenol/SDS method was faster and more convenient, and the protein extracted was with high quality, rich in protein species, and suitable for Western Blotting, thus was an appropriate method for extracting protein from plant tissue.
Key words: tobacco(Nicotiana tabacum) leaf; protein; Tris-HCl extraction method; TCA/acetone precipitation; phenol/SDS extraction method
蛋白质组学(Proteomics)是随着基因组学发展而发展起来的､在整体水平上研究细胞内蛋白质的组成及其活动规律的学科｡由于其能够阐明基因表达产物——蛋白在生物体内的相对含量､修饰化信息,蛋白质与其他生物大分子的相互作用等诸多内容而日益成为现代生物学的研究热点｡在蛋白质组研究中,蛋白样品制备是分析的起始和基础,蛋白提取质量和效果对后续的研究分析有重要影响[1,2]｡
植物组织含有较厚的细胞壁,给组织中蛋白质的提取增加了一定的难度｡目前常用的植物蛋白的提取方法有两种,一种是普通Tris-HCl提取法,该方法通过选择适当的提取缓冲液pH,将植物中的可溶性蛋白尽可能地溶解;另一种是TCA/丙酮沉淀法,该方法中TCA作为蛋白质变性剂,能有效抑制丝氨酸蛋白酶和巯基蛋白酶的活性,减少蛋白损失,因此得到较为广泛的使用[3-6]｡但以上两种方法都不能有效地去除产物中的非蛋白物质,会对后续的研究产生不利的影响｡而酚/SDS蛋白提取法中,利用酚在SDS这种阴离子型表面活性剂的存在条件下能充分溶解蛋白的特点,可以取得在较短的时间内充分溶解植物组织中蛋白的效果,得到的蛋白
纯度更高[7,8]｡目前该方法在国内使用得较少,特别是在烟草样品中尚未见报道｡本研究同时使用酚/SDS法､Tris-HCl法及TCA/丙酮沉淀法3种方法从烟草叶片中提取蛋白质,从终产物形式､颜色､提取时间､蛋白产量､SDS-PAGE电泳结果等方面进行比较,并使用糖基转移酶抗体对提取的烟草叶片蛋白进行免疫学检测,以评价3种方法提取蛋白的效果,为植物蛋白的提取和蛋白组学研究提供参考｡
1 材料与方法
1.1 材料和试剂
烟草叶片(W38)来自中南民族大学生命科学学院国家民委生物技术重点实验室｡主要试剂:NC膜购自Whatman公司;ECL Western Blot System购自碧云天公司;Tris､三氯乙酸等化学试剂为国产分析纯;糖基转移酶多克隆抗体由北京华大蛋白技术有限公司制备｡
1.2 蛋白提取方法
1.2.1 Tris-HCl提取法准确称取0.5 g叶片,剪碎后加入0.25 mL Tris-HCl溶液冰浴研磨,再加入0.75 mL提取液(7 mol/L尿素､2 mol/L硫脲､0.4% CHAPS､10 mmol/L DTT),研磨至匀浆后,转移至1.5 mL离心管中,10 000 r/min离心10 min,上清液为所需的总蛋白｡
1.2.2 TCA/丙酮沉淀法取0.5 g叶片,用液氮研磨充分,加入5 mL预冷的TCA 提取液(含质量分数10%的TCA､20 mmol/L DTT､1 mmol/L PMSF的丙酮溶液)充分混合后,-20 ℃放置1 h;13 000 r/min､4 ℃离心15 min,取沉淀;再加入5 mL预冷的样品洗涤液(20 mmol/L DTT､1 mmol/L PMSF的丙酮溶液),充分混合后,-20 ℃放置1 h;13 000 r/min､4 ℃离心15 min,取沉淀;用密封膜封口,用针在膜上扎几个小洞,低温冷冻干燥｡置于-80 ℃保存或直接进行蛋白电泳｡
1.2.3 酚/SDS蛋白提取法取0.5 g烟草样品,液氮中研磨至粉末,快速转移至7 mL试管,加入5 mL预冷的质量分数为10%的TCA丙酮溶液,振荡混合均匀后,12 000 r/min､4 ℃离心3 min,弃上清;加入5 mL含有0.1 mol/L乙酸铵的体积分数为80%的乙醇溶液,振荡混合后12 000 r/min､4 ℃离心3 min,弃上清;再加入5 mL体积分数80%的丙酮,涡旋振荡直至沉淀充分分散,12 000 r/min､4 ℃离心3 min,弃上清,室温干燥10 min以除去剩余的丙酮,加入2.5 mL苯酚/SDS溶液,振荡混匀后,放置5 min,12 000 r/min､4 ℃离心3 min;转移上层苯酚相(约1~2 mL)至新的7 mL 管中,加入含有0.1 mol/L乙酸铵的乙醇溶液,置-20 ℃中10 min或过夜,12 000 r/min､4 ℃离心5 min,小心弃上清｡用无水乙醇洗沉淀,再用体积分数80%的丙酮洗沉淀｡最后让蛋白自然干燥,或根据实验需要用缓冲液溶解蛋白,保存在-80 ℃冰箱,或直接进行蛋白电泳｡
1.3 检测方法
考马斯亮兰G-250法测蛋白含量[9];SDS-PAGE电泳检测,按照文献[10,11]所述
方法进行;Western Blotting检测:取发育状况接近的烟草叶片,分别用3种方法提取总蛋白,进行SDS-PAGE电泳,然后通过蛋白转膜､丽春红染色检测､封闭､标记一抗､洗脱一抗､标记二抗和杂交､再洗脱､化学发光法显色检测结果等步骤进行分析[12,13]｡
2 结果与分析
2.1 3种方法提取的蛋白质质量和产量比较
对3种提取方法得到的烟草叶片蛋白形式､颜色､提取时间及蛋白产量进行比较(表1),可以看出,Tris-HCl提取法所得产物为绿色,这是由色素等杂质成分未能被完全去除而导致｡该方法虽提取速度快､产量高,但蛋白质量不高,所含杂质较多｡TCA/丙酮沉淀法用液氮充分研磨烟草叶片,同时加入蛋白酶抑制剂PMSF,降低了蛋白降解损失,故蛋白产量最高｡但是多次洗脱后样品颜色仍为淡黄色,这可能是因为烟草叶片中的一些物质能与蛋白共沉淀,导致终产物含有杂质｡此外,此方法操作耗时较长,会导致蛋白样品的损失和降解｡
使用酚/SDS法提取蛋白,酚能够有效溶解蛋白,并在SDS存在下,其溶解效果更好,可溶解的蛋白更多,且该方法能有效去除非蛋白物质,非蛋白类成分较其他两种方法都少,获得的产物为白色｡虽然该方法的蛋白产量较TCA/丙酮沉淀法低,提取所需时间长于Tris-HCl法,但蛋白较纯｡
2.2 SDS-PAGE检测结果
使用常规的SDS-PAGE对3种方法获得的烟草蛋白样品进行比较分析,在蛋白上样量为20 μg时,Tris-HCl法提取的蛋白中检测到10个条带,TCA/丙酮沉淀法提取的蛋白电泳检测出14条条带,酚/SDS法提取的蛋白有12条条带(图1)｡Tris-HCl 法提取的蛋白条带较少,说明只提取到了部分蛋白,可能是该方法采用冰浴研磨,细胞破碎不够充分,只能得到植物组织中的部分可溶性蛋白｡当蛋白上样量为40 μg时,酚/SDS法所得的蛋白条带最多(图2),说明该方法提取的蛋白种类最多,提取效果比较好｡
2.3 Western Blotting检测结果
使用Western Blotting,以烟草糖基转移酶抗体为探针检测3种方法获得的蛋白,结果显示普通Tris-HCl法和TCA/丙酮法提取的蛋白均未出现任何杂交信号,只有酚/SDS法提取的蛋白出现杂交信号(图3),这表明酚/SDS法提取的蛋白用于Western Blotting分析能得到较好的效果｡
3 结论
3.1 蛋白提取质量
在蛋白提取中,杂质的去除是一个主要问题[2],本研究中酚/SDS法提取的蛋白
颜色最浅,所含杂质少,有利于后续的蛋白质组分析｡另外,该方法步骤简单,提取时间较短,能在4~5 h内完成,具有操作方便､快速的特点｡其他两种方法提取的蛋白质均含有较多杂质,不利于后续实验的进行｡
3.2 电泳和Western Blotting检测
对3种方法提取的蛋白进行电泳检测,Tris-HCl法只提取到了部分蛋白｡TCA/丙酮沉淀法所得蛋白条带虽多,但是该方法需要的时间长,容易产生蛋白样品的降解,从而导致蛋白电泳结果不稳定｡而酚/SDS蛋白提取法所得条带较多,重复性好,能够得到良好的一维电泳图谱｡此外,本研究使用Western Blotting对烟草叶片蛋白中的糖基转移酶进行了检测｡结果显示酚/SDS法提取的烟草叶片蛋白表现良好,可用于后续分析｡
酚/SDS法提取植物蛋白,可获得高质量和较高产量的目标产物,为有效提取植物叶片蛋白提供了有力的依据,也为后续的蛋白分析实验打下了良好的基础｡
参考文献:
[1] WANG W, VIGNANI R, SCALI M, et al. A universal and rapid protocol for protein extraction from recalcitrant plant tissues for proteomic analysis[J]. Electrophoresis,2006,27(13):2782-2786.
[2] 兰彦,钱小红.蛋白质组分析中蛋白质分步提取方法的建立[J]. 生物化学与生物物理进展,2001,28(3):415-418.
[3] 曾亚. 水稻抗病基因介导的抗病反应中蛋白质表达谱的比较分析[D]. 武汉:华中农业大学,2008.
[4] 严顺平. 水稻响应盐胁迫和低温胁迫的蛋白质组研究[D]. 北京:中国科学院研究生院,2005.
[5] 赵敏. 水稻两优培九不同氮素处理叶片和籽粒蛋白质组学研究[D]. 福州:福建农林大学,2008.
[6] 汪家政,范明.蛋白质技术手册[M]. 北京:科学出版社,2000. [7] WANG W, SCALI M, VIGNANI R, et al. Protein extraction for two-dimensional electrophoresis from olive leaf, a plant tissue containing high levels of interfering compounds[J]. Electrophoresis,2003,24(14):2369-2375.
[8] FAUROBERT M, PELPOIR E, CHA B J. Phenol extraction of proteins for proteomic studies of recalcitrant plant tissues[J]. Methods in Molecular Biology,2006,355:9-14.
[9] LI F F,WANG Y Y,LIU G F, et al. Cloning and expression of wheat heat-shock
protein 60(HSP60) gere in E. coli[D]. Agricultural Science & Technology,2010,11(1):5-7.
[10] 郭尧君. 蛋白质电泳实验技术[M]. 北京:科学出版社,2005.
[11] 丁.萨姆布鲁克, D.W.拉塞尔. 分子克隆实验指南[M]. 第三版.黄培堂,王嘉玺,朱厚础,等译.北京:科学出版社,2002.
[12] 王卓. 一个新的烟草糖基转移酶的过表达及相关研究[D]. 武汉:中南民族大学,2008.
[13] 王雪,谭艳平,周杰,等. 一个烟草糖基转移酶启动子在转基因烟草植株中的表达分析[J]. 安徽农业科学,2010,38(18):9426-9428.。