成纤维细胞激活蛋白_与肿瘤的靶向治疗

摘要 成纤维细胞激活蛋白 α( FAPα)是肿瘤相关成纤维细胞特异性表达的一种表面抗原 ,具有 二肽基肽酶和胶原酶活性 ,在肿瘤的生长 、浸润 、转移中发挥重要作用 。故以 FAPα作为肿瘤基质 标志物的病理诊断 、肿瘤基因治疗或免疫治疗将成为可能 。就近年来对 FAPα结构特点 、活性作 用及在肿瘤诊治中的研究进展进行综述 。 关键词 成纤维细胞激活蛋白 α 肿瘤相关成纤维细胞 肽链内切酶 靶向治疗 中图分类号 Q819
FAPα除自身形成同源二聚体外 ,还常与二肽基肽 酶家族成员 DPPⅣ形成复合物 ,二者具有 48%的氨基 酸序列同源性 ,在催化水解区的氨基酸同源性则高达 70% 。研究表明 [11 ] ,细胞向胶原底物迁移需要这种分 子复合物的形成 ,可能因为二者协同作用能够有效地 降解底物 ,并共同调节肿瘤细胞的生长 、分化 、粘附 、转 移过程 。 1. 2 FAPα的酶活性特征 FAPα具有胶原酶活性 ,可溶解明胶和胶原 (包括 Ⅰ型胶原 ) [12, 13 ] ,降解细胞外基质的组成成分 ,这对于 肿瘤基质的形成和维持起着重要作用 。 FAPα还具有 类似 DPPⅣ的二肽基肽酶活性 ,鉴于后者具有裂解 、改 变某些肽激素及化学因子受体特异性的作用 [14 ] ,推测 FAPα也可通过调节肿瘤基质中某些肽类生长因子 ,修 饰活性肽并改变其功能 ,从而促进肿瘤的发生发展 。 Aertgeerts等 [15 ]在比较 FAPα与 DPP IV 肽酶特性 时发现 ,二者均具有肽链外切酶活性 ,能特异性作用于 肽链 N 2末端第 2位由脯氨酸和其他氨基酸或小分子形 成的肽键 ( X2Pro2) ,而对于肽链 N 2末端被封闭的底物 ,
FAPα仍可迅速断裂之 , DPP IV 则无此活性 。由 此提 示 :具有 FAPα特异性水解结构的 N 末端被封闭的氨 基酸衍生物在体循环中不能被广泛存在的 DPP IV 等肽 链外切酶识别 ,而仅在 FAPα表达的特殊部位被水解 , 这一特性为 FAPα成为肿瘤治疗的靶点奠定了基础 。 为考察 FAPα对底物的选择性和水解效率 , Levy 等 [16 ] 将 荧 光 物 质 AFC 与 二 肽 A la2Pro, Gly2Pro 以 及 Lys2Pro偶联 , 发现 FAPα更倾向于快速水解 Gly2Pro2 AFC, 其 次 为 Lys2Pro2AFC 和 A la2Pro2AFC; Aoyama 等 [17 ]发现 FAPα在中性条件下催化活性最强 ,且可被 EDTA , DTT, SDS所增强 ,而半胱氨酸抑制剂如 HgCl2 , 苯甲基磺酰氟化物的存在可抑制其活性 ,表明 FAPα为 一中性的巯基敏感性蛋白酶 。 Hu等 [18 ]合成了一类 N 末端封闭基团为系列化环 烷基的 Gly2Pro 二 肽 衍 生 物 N 2alkyl Gly2boro2Pro 4210 (数字表示环上碳原子数目 ) , 经研究发现其对 FAPα 的酶解作用有较好的拮抗性 ,且烷基环的大小与作用 有关 ,环上碳原子为 4时抑制作用最弱 ,为 8时则最强 , 烷基增大时可能由于空间位阻等原因使得抑制作用再
性黑色素瘤发展的关系中发现 ,原发灶黑色素细胞瘤 中 FAPα有酶活性 ,且转移性黑色素瘤中 FAPα也有高 表达 [25 ] 。临床研究也表明 ,肿瘤间质高表达 FAPα的 结肠癌病人更容易出现病灶转移及复发的可能性 [26 ] , 说明 FAPα的高表达伴随着肿瘤的侵袭及转移过程 ,并 发挥重要的促进作用 。 上述的几个研究组以 FAPα的胶原酶和二肽酶活 性及其在肿瘤间质特异性表达为理论基础 ,利用原发 性肿瘤或 FAPα转染后的肿瘤细胞建立的异种移植瘤 来考 察 FAPα在 肿 瘤 发 生 发 展 中 的 作 用 , 初 步 得 出 FAPα可能与促进肿瘤的生长侵袭相关 。而实际上 , FA Pα在癌间质中 表 达 的 作 用 机 制 尚 未 得 到 充 分 的 研 究 ,目前科学界较为普遍接受的观点是 FAPα和膜结合 的信号传导分子协同作用 ,通过其蛋白酶活性对信号 分子或信号传导过程中的其他相关因子例如肽类生长 因子 、趋化因子等进行修饰 ,调节肿瘤生长兴奋性信号 的传导 。
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衍出 FAPα的结构模型 (图 1 ) 。该模型认为 FAPα的 胞外区有一个包含催化三联体的 αβ水解酶区域 (氨基 酸序列 500 ～761 ) ,其顶端的肽链形成一个具有 7 片 “桨叶 ”的 β螺旋结构区域 (氨基酸序列 99 ～499 ) 。该
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综 述
成纤维细胞激活蛋白 α与肿瘤的靶向治疗暨南大学药学院 广州 510632 2 中山大学药学院 广州 510275 3 广东药学院 广州 510006)
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次减弱 。 Edosada 等 [19 ]以 Gly2Pro 为基本骨架 , N 端连 接乙酸基 (Ac) 、甲酰基 、苄氧羰基 、生物素等基团 ,发现 其均为 FAPα的特异性水解底物 ,其中以 Ac2Gly2p ro亲 和力最强 。因此该组合成了一种具有 FAPα选择性抑 制作用的硼酸化 Ac2Gly2p ro (Ac2Gly2BoroPro) , 酶解动 力学研究显示其对 FAPα的抑制常数 Ki是对 DPP家族 蛋白酶的 1 /5424 ～1 /16,预示在 Ac2Gly2Pro2基础上进 行 FAPα选择性抑制剂的探索将有很好的科研价值 。
1 FA Pα的结构和生物学特性
1. 1 FAPα分子结构特点 FAPα最初被称为 F19 抗原 ,是由 Rettig等应用单
收稿日期 : 2007211216 修回日期 : 2008201222 3 国家自然科学基金资助项目 (30672510) 33 通讯作者 ,电子信箱 : csh5689@ sina. cn
区域中央可伸缩的空隙可能起到允许或限制某些蛋白 质到达催化区域的作用 。此外 ,β螺旋构型可能对于 FAPα和其他膜结合分子形成复合物有重要作用 。
图 1 FAPα结构模型图 ( a) , FAPα结构区域简图 ( b) F ig. 1 M odels of FAPα structure( a) , a schema tic d iagram of doma in structure of FAPα( b)
2 FA Pα在肿瘤发生发展中的作用
2. 1 FAPα在肿瘤微环境的特异性表达 FAPα选择性表达于 90%以上恶性上皮性肿瘤 (如 乳腺癌 、卵巢癌 、肺癌 、结肠癌 、胰腺癌 、皮肤黑色素瘤 等 )的基质 ,胚胎组织 、愈合创面及生理性重建的器官 中 [ 13, 20～22 ] ,而在正常成体组织中一般无表达 。提示它 是一个增生性成纤维细胞的表面标志物 ,可能在调控 成纤维细胞生长及胚胎发育 、组织修复和上皮性肿瘤 的演进过程中起一定作用 。 FA Pα在肿瘤 相 关 成 纤 维 细 胞上 的 表 达 对 于 形 成 有利于肿瘤生长的微环境十分重要 。它可通过发挥蛋 白酶水解作用 ,解离与基质蛋白结合的生长因子 ,使之 发挥促肿瘤生长和肿瘤微血管生成的作用 ; 或是溶解 与其相邻的细胞外基质或者激活某些蛋白酶原而间接 作用 ,从而协助癌细胞浸润 、侵袭 。 2. 2 促进肿瘤生长作用 Huang等 [23 ]用建立了表达 FAPα的小鼠乳腺肿瘤 移植模型 ,发现该模型肿瘤生长速度远远快于对照组 , 肿瘤微血管密度为正常的四倍 ; 同时他们也发现正常 乳腺 癌 细 胞 MDA 2MB 2231 和 转 染 了 FAPα 基 因 的 MDA 2MB 2231细胞在体外培养时生长速度没有差异 ,推 测 FAPα只有在体内乳房脂肪垫的微环境中才表现出 显著的乳腺肿瘤生长促进作用 。Cheng等 [10 ]也报道了 类似的 FAPα促肿瘤生长作用 ,他们还证实利用抑制 FAPα蛋白水解活性可以减缓动物模型中 FAPα表达 阳性的肿瘤的生长速度 。 2. 3 对肿瘤侵袭与转移的作用 基质降解是癌细胞侵袭和转移的必要条件之一 。 肿瘤细胞通过诱导基质 (尤其是成纤维细胞 )活化 ,使 其表 达 FAPα 等 一 些 蛋 白 酶 来 参 与 侵 袭 和 转 移 过 程 [24 ] 。 FAPα可以水解基质中二肽酶的许多底物 、明胶 及胶原 ,成功降解细胞外基质 ,从而有利于肿瘤细胞从 原发部位脱离 ,侵袭和远距离转移 。在研究 FAPα和恶
克隆抗体 F19 (用体外培养的人成纤维细胞免疫小鼠获 得 )从人恶性黑色素瘤细胞株 LOX当中识别的一种膜 抗原 。其属于丝氨酸蛋白酶类 ,由 761 个氨基酸组成 , 是一种 Ⅱ型穿膜糖蛋白 ,在不同哺乳动物细胞中的糖 基化水平不同 ,单体分子量有 88kDa, 95kDa, 97kDa 等 多种报道 , 二聚体分子量为 170kDa[6 ] 。 FAPα分子通 过一个疏水的跨膜片段固定在细胞膜上 ,该段有 19 个 氨基酸 ,可能是未被剪切的信号肽尾 。胞浆区是一个 由 6个氨基酸组成的短肽链 。其分子中绝大部分区域 (氨基酸序列 20～761)都暴露在胞外微环境中 ,包括 5 个 N 2糖基化位点 、13 个半胱氨酸残基和 3 个与高度保 守的丝氨酸蛋白激酶催化区 。该催化区域的关键结构 是由氨基酸序列第 624位的丝氨酸 ( Ser624) , 702 位的 天冬氨酸 (A sp702)和 734位的组氨酸 ( H is734 )构成的 催化三联体 [7 ] 。研究发现 ,尽管 FAPα基因编码完整的 催化区域 ,但是其转录翻译得到的蛋白必须形成大小 为 170kDa的二聚体才有催化活性 ,可能是二聚体的空 间结 构 才 能 提 供 完 整 的 丝 氨 酸 蛋 白 酶 活 性 位 点 。 Ser624对 FAPα活性发挥至关重要 ,若将其转变为丙氨 酸 , FAPα水解活性将消失 [8 ] 。此外 ,通过定点突变研 究发现 [9 ] A la657, A rg123, Glu203, Glu204, Tyr656 和 A sn704这 6个高度保守的活性位点残基对维持 FAPα 肽链内切酶活性也甚为重要 。 Cheng等 [10 ]依据由脯氨酰基寡肽酶的晶体结构推
越来越多的研究发现 ,肿瘤的发生发展与肿瘤 2宿 主界面微环境的平衡状态密切相关 。肿瘤基质的主要 成分 ———成纤维细胞与癌细胞相互作用而活化 ,成为 肿瘤相关成纤维细胞 ( carcinoma associated fibroblasts, CAFs) [1 ] 。相对于正常组织中的成纤维细胞 , CAFs在 表型 、活性功能等方面都产生相应变化 ,并对肿瘤的发 生发展起着必要的支持作用 。如 : 通过细胞 2细胞间接 触 、分泌基质成分 、释放生长因子等促进肿瘤生长 ; 表 达 VEGF, IL 28等血管生长相关因子促进肿瘤组织血管 增生 ;提供肿瘤细胞免疫隔离空间 ,协助其产生免疫逃 逸 ;表达细胞因子 、蛋白酶及粘附分子等促进肿瘤浸润 与转 移 [2～4 ] 。成 纤 维 细 胞 激 活 蛋 白 α ( fibroblast activation p roteinα, FAPα)就是特异性表达于 CAF 表 面的一种抗原分子 ,属于丝氨酸蛋白酶家族 [5 ] ,在肿瘤 2 宿主界面基质的降解和重建中发挥着重要作用 ,参与 肿瘤的生长 、浸润和转移 。近年来 , CAFs及 FAPα作为 一种适用于肿瘤靶向治疗的靶标正倍受关注 。