一种纯化尿激酶的亲和层析填料及制备方法和应用[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010794252.1
(22)申请日 2020.08.10
(71)申请人 武汉人福药业有限责任公司
地址 430206 湖北省武汉市东湖新技术开
发区生物园路8号
(72)发明人 田瀚　付贞　唐维　熊心磊　郭芬　
(74)专利代理机构 北京精金石知识产权代理有
限公司 11470
代理人 尉月丽
(51)Int.Cl.
B01D 15/38(2006.01)
C12N 9/72(2006.01)
(54)发明名称
一种纯化尿激酶的亲和层析填料及制备方
法和应用
(57)摘要
本发明提供了一种纯化尿激酶的亲和层析
填料及制备方法和应用，本发明属于生物化学纯
化领域，本发明在实施过程中使用氨甲苯酸和4‑
氨基苯甲脒二盐酸盐对Sepharose
CL ‑6B进行修饰，得到一种Sepharose CL ‑6B ‑氨甲苯酸‑p ‑AB
填料，该填料可以更好地纯化分离高分子尿激酶
和低分子尿激酶，活性回收率高，均在95％以上，
回收效果好。

权利要求书2页 说明书7页CN 111957073 A 2020.11.20
C N 111957073
A
1.一种纯化尿激酶的亲和层析填料的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)氨甲苯酸-Sepharose CL-6B的制备
a、将Sepharose CL-6B依次用水、20％二恶烷水溶液、60％二恶烷水溶液和100％二恶烷洗涤，得到洗涤后的Sepharose CL-6B；
b、将洗涤后的Sepharose CL-6B置于100％二恶烷中，得到Sepharose CL-6B溶液，并向Sepharose CL-6B溶液加入N，N'-羰基二咪唑，得到悬浮液；
c、将悬浮液在室温下搅拌30分钟，然后依次用100％二恶烷、60％二恶烷水溶液、20％二恶烷水溶液和水洗涤，得到活化的Sepharose CL-6B；
d、在室温下，将活化的Sepharose CL-6B与氨甲苯酸置于40mL pH＝10的水中反应10小时，然后依次用水、NaOH、HCl和水洗涤，即得到氨甲苯酸-Sepharose CL-6B；
(2)Sepharose CL-6B-氨甲苯酸-p-AB的制备
将制备的氨甲苯酸-Sepharose CL-6B置于水中制成溶液，向溶液中加入4-氨基苯甲脒二盐酸盐和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，得到悬浮液，使用HCl和NaOH 将悬浮液的pH调节至4.5，并在此pH条件下保持10小时；然后依次用水、NaOH、HCl和水洗涤，即得到目标产物Sepharose CL-6B-氨甲苯酸-p-AB。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤b中所述的Sepharose CL-6B与N，N'-羰基二咪唑的加入量之比为40mL：2.0-
3.0g。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤d中所述的Sepharose CL-6B和氨甲苯酸添加量之比为40mL：20-24g。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的氨甲苯酸-Sepharose CL-6B、4-氨基苯甲脒二盐酸盐和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的添加量之比为40mL：0.40-0.50g：2.4-3.2g。

5.根据权利要求1-4任一项所述的亲和层析填料在分离提纯高分子尿激酶和低分子尿激酶中的应用。

6.根据权利要求1-4任一项所述的亲和层析填料用于分离纯化尿激酶的方法，其特征在于：包括以下步骤：
A、称取尿激酶原料，使用含氯化钠的磷酸盐缓冲液溶解，得上样液，备用；
B、取20mL制备的Sepharose CL-6B-氨甲苯酸-p-AB，装入柱子中，然后使用平衡缓冲液平衡；
C、将步骤A中得到的上样液进样至步骤B平衡好的柱子中，分别使用缓冲液A和缓冲液B 洗涤柱子，至穿透液pH稳定，且在280nm的吸光度小于5mAU，停止洗涤；
D、然后使用缓冲液C进行洗脱，得到低分子尿激酶，收集完毕；使用缓冲液D进行洗脱，得到高分子尿激酶。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤A中所述的上样液的电导值为18.5-24.5ms/cm，pH值为7.0。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤C中所述的缓冲液A为含有0.1M NaCl 的0.1M磷酸盐缓冲液，pH＝7.0；所述的缓冲液B为含有1M NaCl的0.1M磷酸盐缓冲液，pH＝7.0。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤D中所述的缓冲液C为含1M NaCl的
0.1M磷酸盐缓冲液，pH＝4.0；所述的缓冲液D为含0.1M NaCl的0.1M磷酸盐缓冲液，pH＝4.0。

10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤D中所述的洗脱步骤具体为：首先，使用含1M NaCl的0.1M磷酸盐缓冲液，pH＝4.0进行洗脱，待pH降至4.0，并且280nm的吸光度小于5mAU后停止收集，得到低分子尿激酶；然后将1M NaCl浓度降低为0.1M，使用含0.1M NaCl 的0.1M磷酸盐缓冲液，pH＝4.0进行洗脱，待280nm的吸光度小于5mAU后停止收集，得到高分子尿激酶。

一种纯化尿激酶的亲和层析填料及制备方法和应用
技术领域
[0001]本发明属于生物化学纯化领域，具体涉及一种纯化尿激酶的亲和层析填料及制备方法和应用。

背景技术
[0002]组织型纤溶酶原激活剂是治疗急性心肌梗塞最具代表性的溶栓剂。

然而，组织型纤溶酶原激活剂的副作用是显著的，例如出血和再闭塞。

有研究表明组织型纤溶酶原激活剂和尿激酶联合治疗可降低这些副作用，因此，尿激酶也被广泛用作治疗急性心肌梗塞的有效溶栓剂。

[0003]人尿源尿激酶主要有天然高分子量尿激酶(HUK,54000Dal)和低分子量尿激酶(LUK,33000Dal)两种，而高分子尿激酶(HUK)是尿液中尿激酶的主要成分，低分子尿激酶(LUK)被认为是通过蛋白水解降解和/或自溶切割从高分子尿激酶(HUK)衍生而来的。

尽管体外血浆存在时，高分子尿激酶(HUK)和低分子尿激酶(LUK)的酶活性几乎相同，基于高分子尿激酶(HUK)对原生动物体内的Glu-纤溶酶原的亲和力更高，因此高分子尿激酶(HUK)的活性被认为比低分子尿激酶(LUK)更为重要。

Abaza、Koopman、Shetty和西拉伯等人报道了高分子尿激酶(HUK)对增殖、转移和细胞迁移的生物学重要性的证据，与高分子尿激酶(HUK)受体在各种肿瘤细胞(如人脑恶性AA细胞系，人黑色素瘤细胞M14和IF6，间皮瘤细胞MS-1和人肥大细胞)上的表达有关。

他们还提出，低分子尿激酶(LUK)在癌症转移中的生物学作用可能比高分子尿激酶(HUK)要小，这是因为所有肿瘤细胞上缺乏低分子尿激酶(LUK)受体。

基于这些观察，高分子尿激酶(HUK)的生物学作用引起了广泛的关注。

[0004]尿激酶制备方法目前主要有离子交换层析法、凝胶分子筛法、免疫亲和层析和对氨基苯甲脒-Sepharose亲和层析等，如陈祥胜等报道了采用苯甲脒琼脂糖凝胶亲和层析从尿激酶粗品中精制尿激酶，比活27938IU/mg·pr，活性回收率62.96％，纯化倍数4.03倍；祝一锋报道了采用Sephadex G-50凝胶过滤、CM-Sephadex C-50、硫酸铵沉淀以及Bio-Gel P-30凝胶过滤等制备尿激酶精品，比活34080IU/mg·pr，活性回收率60％左右，纯化倍数50倍；沈金玉等报道了采用免疫亲和层析从尿激酶粗品精制尿激酶。

离子交换和凝胶过滤纯化效率低下，难以获得高纯度的尿激酶精品；免疫亲和层析纯化尿激酶可获得较高纯度的尿激酶精品，但由于免疫亲和层析需使用生物配基，价格昂贵，很难获得工业化生产使用的配基；对氨基苯甲脒-Sepharose作为一种较好的尿激酶精品精制方法，但也必须同其他方法一起使用，而且必须在提取过程中多次使用才能获得高质量的尿激酶，多次使用造成生产成本极高、收率低，生产周期长。

[0005]中国专利申请200910186246.1中公开了一种特异性纯化高分子尿激酶层析介质，其结构特征是：HOOC-(CH2)4(NH)C-O-R-O-C(NH)NH(CH2)4-CO-X，X＝NHC6H5C(NH)NH2，R代表交联琼脂糖基质。

该发明的优点是：制备过程简单，反应条件温和，是适用于高效分离高分子尿激酶(HUK)和低分子尿激酶(LUK)的介质，能够实施高纯度高分子尿激酶(HUK)的工业生产。

但是该申请主要用于纯化高分子尿激酶(HUK)，其纯度和活性仍不能满足需求。

[0006]目前也有很多关于尿激酶亲和层析文献，但是从人尿中将高分子尿激酶(HUK)和低分子尿激酶(LUK)分离的分离纯化方法文献几乎没有报道，因此需要开发一种能够将高分子尿激酶(HUK)和低分子尿激酶(LUK)分离的分离纯化方法。

发明内容
[0007]基于现有技术中的不足，本发明旨在提供一种新型亲和填料，所述填料是将氨甲苯酸固定在Sepharose CL-6B上，然后通过部分氨甲苯酸的羧基与4-氨基苯甲脒(p-AB)进行耦合制成，该填料可以进行人尿中高分子尿激酶(HUK)和低分子尿激酶(LUK)的分离纯化。

[0008]本发明提供的亲和填料同时具有亲和位点和疏水位点，因此命名为疏水介导的亲和层析填料。

此外，本发明还提供了通过疏水介导的亲和层析填料从尿激酶原料中大规模分离纯化高分子尿激酶(HUK)和低分子尿激酶(LUK)的方法，该方法分离时间短，收率高，分离效果好，生产成本低。

[0009]所述的疏水介导的亲和层析填料Sepharose CL-6B-氨甲苯酸-p-AB的结构式如下所示：
[0010]
[0011]本发明是这样来实现的：一种纯化尿激酶的亲和层析填料的制备方法，包括以下步骤：
[0012](1)氨甲苯酸-Sepharose CL-6B的制备
[0013]a、将Sepharose CL-6B依次用水、20％二恶烷水溶液、60％二恶烷水溶液和100％二恶烷洗涤，得到洗涤后的Sepharose CL-6B；
[0014]b、将洗涤后的Sepharose CL-6B置于100％二恶烷中，得到Sepharose CL-6B溶液，并向Sepharose CL-6B溶液加入N，N'-羰基二咪唑(CDI)，得到悬浮液；
[0015]c、将悬浮液在室温下搅拌30分钟，然后依次用100％二恶烷、60％二恶烷水溶液、20％二恶烷水溶液和水洗涤，得到活化的Sepharose CL-6B；
[0016]d、在室温下，将活化的Sepharose CL-6B与氨甲苯酸置于40mL，pH＝10的水中反应10小时，然后依次用水、NaOH、HCl和水洗涤，即得到氨甲苯酸-Sepharose CL-6B；
[0017](2)Sepharose CL-6B-氨甲苯酸-p-AB的制备
[0018]将制备的氨甲苯酸-Sepharose CL-6B置于水中制成溶液，向溶液中加入4-氨基苯甲脒二盐酸盐(p-AB·2HCl)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)，得到悬浮液，使用HCl和NaOH将悬浮液的pH调节至4.5，并在此pH条件下保持10小时；
然后依次用水、NaOH、HCl和水洗涤，即得到目标产物Sepharose CL-6B-氨甲苯酸-p-AB。

[0019]上述步骤a中所述的Sepharose CL-6B、水，20％二恶烷水溶液，60％二恶烷水溶液和100％二恶烷的体积比为40mL：400-600mL：400-600mL：400-600mL：400-600mL。

[0020]优选地，上述步骤a中所述的Sepharose CL-6B、水，20％二恶烷水溶液，60％二恶烷水溶液和100％二恶烷的体积比为40mL：500mL：500mL：500mL：500mL。

[0021]上述步骤b中所述的Sepharose CL-6B和100％二恶烷的体积比为40mL：30-50mL；[0022]优选为，上述步骤b中所述的Sepharose CL-6B和100％二恶烷的体积比为40mL：40mL。

[0023]上述步骤b中所述的Sepharose CL-6B与N，N'-羰基二咪唑(CDI)的加入量之比为40mL：2.0-3.0g。

[0024]优选地，上述步骤b中所述的Sepharose CL-6B与N，N'-羰基二咪唑(CDI)的加入量之比为40mL：2.4g。

[0025]上述步骤c中所述的悬浮液与100％二恶烷、60％二恶烷水溶液、20％二恶烷水溶液和水的体积比为40mL：400-600mL：400-600mL：400-600mL：400-600mL。

[0026]优选地，上述步骤c中所述的悬浮液与100％二恶烷、60％二恶烷水溶液、20％二恶烷水溶液和水的体积比为40mL：500mL：500mL：500mL：500mL。

[0027]上述步骤d中所述的Sepharose CL-6B和氨甲苯酸添加量之比为40mL:20-24g；[0028]优选地，上述步骤d中所述的Sepharose CL-6B和氨甲苯酸添加量之比为40mL: 21.6g。

[0029]上述步骤d中所述的NaOH和HCl的浓度为0.1M。

[0030]上述步骤(2)中所述的氨甲苯酸-Sepharose CL-6B、4-氨基苯甲脒二盐酸盐(p-AB·2HCl)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)的添加量之比为40mL：0.40-0.50g：2.4-3.2g。

[0031]优选地，步骤(2)中所述的氨甲苯酸-Sepharose CL-6B、苯甲脒二盐酸盐(p-AB·2HCl)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)的添加量之比为40mL：0.44g：2.8g。

[0032]一种新型亲和填料的制备方法，具体包括以下步骤：
[0033](1)氨甲苯酸-Sepharose CL-6B的制备
[0034]a、将40mL的Sepharose CL-6B依次用400-600mL水、400-600mL20％二恶烷水溶液、400-600mL60％二恶烷水溶液和400-600mL100％二恶烷洗涤，得到洗涤后的Sepharose CL-6B；
[0035]b、将洗涤后的40mLSepharose CL-6B置于30-50mL100％二恶烷，得到Sepharose CL-6B溶液，并向Sepharose CL-6B溶液加入2.0-3.0gN,N'-羰基二咪唑(CDI)，得到悬浮液；[0036]c、将悬浮液在室温下搅拌30分钟，然后依次用400-600mL100％二恶烷、400-600mL60％二恶烷水溶液、400-600mL20％二恶烷水溶液和400-600mL水洗涤，得到活化的Sepharose CL-6B；
[0037]d、在室温下，将活化的40mLSepharose CL-6B与20-24g氨甲苯酸置于水中反应，然后依次用400-600mL水、400-600mL 0.1M NaOH、400-600mL 0.1M HCl和400-600mL水洗涤，即得到氨甲苯酸-Sepharose CL-6B；
[0038](2)Sepharose CL-6B-氨甲苯酸-p-AB的制备
[0039]取40mL氨甲苯酸-Sepharose CL-6B悬浮于40mL的水中，然后加入0.40-0.50g 4-氨基苯甲脒二盐酸盐(p-AB·2HCl)和2.4-3.2g1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)，使用3M HCl和3M NaOH调节悬浮液的pH值为4.5，并在室温下搅拌10小时，将反应产物依次用400-600mL水、400-600mL0.1M NaOH、400-600mL 0.1M HCl和400-600mL 水洗涤，即得到目标产物Sepharose CL-6B-氨甲苯酸-p-AB。

[0040]为了保证亲和填料的再现性，这些过程应该在严格控制的条件下进行。

当填料对酶的分辨率和亲和力丧失时，用含0.1-0.5％SDS的0.05M NaOH和0.05M HCl反复洗涤。

[0041]本发明还提供了上述疏水介导的亲和层析填料在分离提纯高分子尿激酶(HUK)和低分子尿激酶(LUK)中的应用。

[0042]本发明还提供了使用上述疏水介导的亲和层析填料分离纯化尿激酶的方法，包括以下步骤：
[0043]A、称取尿激酶原料，使用含氯化钠的磷酸盐缓冲液溶解，得上样液，备用；[0044]B、取20mL制备的Sepharose CL-6B-氨甲苯酸-p-AB，装入柱子中，然后使用平衡缓冲液平衡；
[0045]C、将步骤A中得到的上样液进样至步骤B平衡好的柱子中，分别使用缓冲液A和缓冲液B洗涤柱子，至穿透液pH稳定，且在280nm的吸光度小于5mAU，停止洗涤；
[0046]D、然后使用缓冲液C进行洗脱，得到低分子尿激酶(LUK)，收集完毕；使用缓冲液D 进行洗脱，得到高分子尿激酶(HUK)。

[0047]上述步骤A中所述的含氯化钠的磷酸盐缓冲液为含0.1M NaCl的0.1M磷酸盐缓冲液，pH＝7.0。

[0048]上述步骤A中所述的上样液的电导值为18.5-24.5ms/cm，pH值为7.0。

[0049]上述步骤B中所述的平衡缓冲液为含0.1M NaCl的0.1M磷酸盐缓冲液，pH＝7.0。

[0050]上述步骤C中所述的缓冲液A为含有0.1M NaCl的0.1M磷酸盐缓冲液，pH＝7.0；所述的缓冲液B为含有1M NaCl的0.1M磷酸盐缓冲液，pH＝7.0。

[0051]上述步骤D中所述的缓冲液C为含1M NaCl的0.1M磷酸盐缓冲液，pH＝4.0；所述的缓冲液D为含0.1M NaCl的0.1M磷酸盐缓冲液，pH＝4.0。

[0052]上述步骤D中所述的洗脱步骤具体为：首先，使用含1M NaCl的0.1M磷酸盐缓冲液，pH＝4.0进行洗脱，待pH降至4.0，并且280nm的吸光度小于5mAU后停止收集，得到低分子尿激酶(LUK)；然后将1M NaCl浓度降低为0.1M，使用含0.1M NaCl的0.1M磷酸盐缓冲液，pH＝4.0进行洗脱，待280nm的吸光度小于5mAU后停止收集，得到高分子尿激酶(HUK)。

[0053]本发明相对于现有技术的有益效果在于：
[0054]本发明提供了一种亲和填料，可以更好地纯化分离高分子尿激酶(HUK)和低分子尿激酶(LUK)，活性回收率高，均在95％以上，回收效果好。

具体实施方式
[0055]基础实施例1一种新型亲和填料的制备方法
[0056]具体包括以下步骤：
[0057](1)氨甲苯酸-Sepharose CL-6B的制备
[0058]a、将40mL的Sepharose CL-6B依次用400mL水、400mL20％二恶烷水溶液、400mL60％二恶烷水溶液和400mL100％二恶烷洗涤，得到洗涤后的Sepharose CL-6B；[0059]b、将洗涤后的40mLSepharose CL-6B置于30mL100％二恶烷，得到Sephar ose CL-6B溶液，并向Sepharose CL-6B溶液加入2.0gN,N'-羰基二咪唑(CDI)，得到悬浮液；[0060]c、将悬浮液在室温下搅拌30分钟，然后依次用400mL100％二恶烷、400mL60％二恶烷水溶液、400mL20％二恶烷水溶液和400mL水洗涤，得到活化的Sepharose CL-6B；[0061]d、在室温下，将活化的40mLSepharose CL-6B与20g氨甲苯酸置于水中反应，然后依次用400mL水、400mL 0.1M NaOH、400mL 0.1M HCl和400mL水洗涤，即得到氨甲苯酸-Sepharose CL-6B；
[0062](2)Sepharose CL-6B-氨甲苯酸-p-AB的制备
[0063]取40mL氨甲苯酸-Sepharose CL-6B悬浮于40mL的水中，然后加入0.4g 4-氨基苯甲脒二盐酸盐(p-AB·2HCl)和2.4g1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)，使用3M HCl和3M NaOH调节悬浮液的pH值为4.5，并在室温下搅拌10小时，将反应产物依次用400mL水、400mL 0.1M NaOH、400mL 0.1M HCl和400mL水洗涤，即得到目标产物Sepharose CL-6B-氨甲苯酸-p-AB。

[0064]基础实施例2一种新型亲和填料的制备方法
[0065]具体包括以下步骤：
[0066](1)氨甲苯酸-Sepharose CL-6B的制备
[0067]a、将40mL的Sepharose CL-6B依次用600mL水、600mL20％二恶烷水溶液、600mL60％二恶烷水溶液和600mL100％二恶烷洗涤，得到洗涤后的Sepharose CL-6B；[0068]b、将洗涤后的40mLSepharose CL-6B置于50mL100％二恶烷，得到Sephar ose CL-6B溶液，并向Sepharose CL-6B溶液加入3.0gN,N'-羰基二咪唑(CDI)，得到悬浮液；[0069]c、将悬浮液在室温下搅拌30分钟，然后依次用600mL100％二恶烷、600mL60％二恶烷水溶液、600mL20％二恶烷水溶液和600mL水洗涤，得到活化的Sepharose CL-6B；[0070]d、在室温下，将活化的40mLSepharose CL-6B与24g氨甲苯酸置于水中反应，然后依次用600mL水、600mL 0.1M NaOH、600mL 0.1M HCl和600mL水洗涤，即得到氨甲苯酸-Sepharose CL-6B；
[0071](2)Sepharose CL-6B-氨甲苯酸-p-AB的制备
[0072]取40mL氨甲苯酸-Sepharose CL-6B悬浮于40mL的水中，然后加入0.5g 4-氨基苯甲脒二盐酸盐(p-AB·2HCl)和3.2g1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)，使用3M HCl和3M NaOH调节悬浮液的pH值为4.5，并在室温下搅拌10小时，将反应产物依次用600mL水、600mL 0.1M NaOH、600mL 0.1M HCl和600mL水洗涤，即得到目标产物Sepharose CL-6B-氨甲苯酸-p-AB。

[0073]基础实施例3一种新型亲和填料的制备方法，具体包括以下步骤：
[0074](1)氨甲苯酸-Sepharose CL-6B的制备
[0075]a、将40mL的Sepharose CL-6B依次用500mL水、500mL20％二恶烷水溶液、500mL60％二恶烷水溶液和500mL100％二恶烷洗涤，得到洗涤后的Sepharose CL-6B；[0076]b、将洗涤后的40mLSepharose CL-6B置于40mL100％二恶烷，得到Sephar ose CL-6B溶液，并向Sepharose CL-6B溶液加入2.4gN,N'-羰基二咪唑(CDI)，得到悬浮液；
[0077]c、将悬浮液在室温下搅拌30分钟，然后依次用500mL100％二恶烷、500mL60％二恶烷水溶液、500mL20％二恶烷水溶液和500mL水洗涤，得到活化的Sepharose CL-6B；[0078]d、在室温下，将活化的40mLSepharose CL-6B与21.6g氨甲苯酸置于水中反应，然后依次用500mL水、500mL 0.1M NaOH、500mL 0.1M HCl和500mL水洗涤，即得到氨甲苯酸-Sepharose CL-6B；
[0079](2)Sepharose CL-6B-氨甲苯酸-p-AB的制备
[0080]取40mL氨甲苯酸-Sepharose CL-6B悬浮于40mL的水中，然后加入0.44g 4-氨基苯甲脒二盐酸盐(p-AB·2HCl)和2.8g1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)，使用3M HCl和3M NaOH调节悬浮液的pH值为4.5，并在室温下搅拌10小时，将反应产物依次用500mL水、500mL 0.1M NaOH、500mL 0.1M HCl和500mL水洗涤，即得到目标产物Sepharose CL-6B-氨甲苯酸-p-AB。

[0081]实施例1使用Sepharose CL-6B-氨甲苯酸-p-AB填料分离纯化尿激酶的方法包括以下步骤：
[0082]A、称取1000.3mg(6998.75IU/mg)的尿激酶原料，使用含0.1M NaCl的0.1M磷酸盐缓冲液，pH＝7.0溶解，得上样液，备用；
[0083]B、取基础实施例1中制备的20mL Sepharose CL-6B-氨甲苯酸-p-AB填料，装入柱子中，然后使用含0.1M NaCl的0.1M磷酸盐缓冲液，pH＝7.0平衡；
[0084]C、将步骤A中得到的上样液进样至步骤B平衡好的柱子中，分别使用含有0.1M NaCl的0.1M磷酸盐缓冲液，pH＝7.0和含有1M NaCl的0.1M磷酸盐缓冲液，pH＝7.0洗涤柱子，至穿透液在280nm的吸光度小于5mAU，停止洗涤；
[0085]D、使用含1M NaCl的0.1M磷酸盐缓冲液，pH＝4.0进行洗脱，待pH降至4.0，并且280nm的吸光度小于5mAU后停止收集，得到低分子尿激酶(LUK)；然后将1M NaCl浓度降低为0.1M，使用含0.1M NaCl的0.1M磷酸盐缓冲液，pH＝4.0进行洗脱，待280nm的吸光度小于5mAU后停止收集，得到高分子尿激酶(HUK)。

[0086]最终洗脱收集液为213.57ml，高分子尿激酶(HUK)纯度为98.46％，活性回收率为95.01％。

[0087]实施例2使用Sepharose CL-6B-氨甲苯酸-p-AB填料分离纯化尿激酶的方法[0088]包括以下步骤：
[0089]A、称取200mg(61182IU/mg)的尿激酶原料，使用含0.1M NaCl的0.1M磷酸盐缓冲液，pH＝7.0溶解，得上样液，备用；
[0090]B、取基础实施例2中制备的20mL Sepharose CL-6B-氨甲苯酸-p-AB填料，装入柱子中，然后使用含0.1M NaCl的0.1M磷酸盐缓冲液，pH＝7.0平衡；
[0091]C、将步骤A中得到的上样液进样至步骤B平衡好的柱子中，分别使用含有0.1M NaCl的0.1M磷酸盐缓冲液，pH＝7.0和含有1M NaCl的0.1M磷酸盐缓冲液，pH＝7.0洗涤柱子，至穿透液在280nm的吸光度小于5mAU，停止洗涤；
[0092]D、使用含1M NaCl的0.1M磷酸盐缓冲液，pH＝4.0进行洗脱，待pH降至4.0，并且280nm的吸光度小于5mAU后停止收集，得到低分子尿激酶(LUK)；然后将1M NaCl浓度降低为0.1M，使用含0.1M NaCl的0.1M磷酸盐缓冲液，pH＝4.0进行洗脱，待280nm的吸光度小于5mAU后停止收集，得到高分子尿激酶(HUK)。

[0093]最终洗脱收集液为62.00ml，高分子尿激酶(HUK)纯度94.70％，活性回收率为100.56％。

[0094]实施例3使用Sepharose CL-6B-氨甲苯酸-p-AB填料分离纯化尿激酶的方法包括以下步骤：
[0095]A、称取542mg(16564IU/mg)的尿激酶原料，使用含0.1M NaCl的0.1M磷酸盐缓冲液，pH＝7.0溶解，得上样液，备用；
[0096]B、取基础实施例3中制备的20mL Sepharose CL-6B-氨甲苯酸-p-AB填料，装入柱子中，然后使用含0.1M NaCl的0.1M磷酸盐缓冲液，pH＝7.0平衡；
[0097]C、将步骤A中得到的上样液进样至步骤B平衡好的柱子中，分别使用含有0.1M NaCl的0.1M磷酸盐缓冲液，pH＝7.0和含有1M NaCl的0.1M磷酸盐缓冲液，pH＝7.0洗涤柱子，至穿透液在280nm的吸光度小于5mAU，停止洗涤；
[0098]D、使用含1M NaCl的0.1M磷酸盐缓冲液，pH＝4.0进行洗脱，待pH降至4.0，并且280nm的吸光度小于5mAU后停止收集，得到低分子尿激酶(LUK)；然后将1M NaCl浓度降低为0.1M，使用含0.1M NaCl的0.1M磷酸盐缓冲液，pH＝4.0进行洗脱，待280nm的吸光度小于5mAU后停止收集，得到高分子尿激酶(HUK)。

[0099]最终洗脱收集液为208ml，高分子尿激酶(HUK)纯度100％，活性回收率为99.80％。

[0100]对比例1
[0101]与实施例3的区别在于所使用的填料种类不同，该实施例中使用的填料为Sepharose CL-6B-6-ACA-p-AB，其制备方法与基础实施例3的区别仅在于将原料氨甲苯酸替换成6-ACA，其他操作和步骤相同。

[0102]最终洗脱收集液为225ml，HUK纯度85.4％，活性回收率为86.20％。

[0103]根据以上比较可以看出，本发明制备的填料能够更好的分离高分子尿激酶(HUK)和低分子尿激酶(LUK)，得到的高分子尿激酶(HUK)纯度和收率都比较高，活性回收率均在95％以上，回收效果较好。

[0104]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。