水质粪大肠菌群的测定(共28张PPT)

7 适用范围
• 本标准适用于地表水，地下水及 废水中粪大肠菌群的测定。
8 原理
• 多管发酵法是以最可能数〔most probable number〕，简称MPN 来表示试验结果的。实际上 它是根据统计学理论，估计水体中的大肠杆菌密度 和卫生质量的一种方法。如果从理论上考虑，并且 进行大量的重复检定，可以发现这种估计有大于实 际数字的倾向。不过只要每一稀释度试管重复数目 增加，这种差异便会减少，对于细菌含量的估计值 ，大局部取决于那些既显示阳性又显示阴性的稀释 度。因此在实验设计上，水样检验所要求重复的数 目，要根据所要求数据的准确度而定。
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三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液： 按上述乳糖蛋白胨培养液的制备方法配制。
除蒸馏水外，各组分用量增加至三倍。〔 即按上述配方比例三倍〔除蒸馏水外〕， 配成三倍浓缩的乳糖蛋白胨培养液〕
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EC培养液： 成分： 胰胨 20克， 乳糖 5克， 胆盐三号
1.5克，磷酸氢二钾〔K2HPO4〕4克，磷酸 二氢钾〔KH2PO4〕1.5克，氯化钠5克，蒸 馏水1000毫升。 制法：将上述成分加热溶解，然后分装于含 有 玻璃倒管的试管中。置高压蒸气灭菌器 中，115℃高压灭菌器中灭菌20min，灭菌 后pH应为6.9。
28 填空题
1. 细菌采样玻璃瓶洗涤枯燥后，要在 0C干热灭菌 或高压蒸汽 0C灭菌 min。
2. 对受污染严重的水体，可选择 定其总大肠菌群数。
方法测
3. 总大肠菌群测定过程的复发酵试验中，接 种完菌落后，应将发酵管置于 0C温度 下培养 h。
4. 复发酵试验使用
培养基。
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• 计算题：
• 某水样接种10mL 的5 管中有4管为 阳性；接种1mL 的5 管中有3 管为 阳性；接种1：10 的水样1mL 的5 管中有1管为阳性。求1L 水样中的 总大肠菌群数为多少？
25 本卷须知
• 灭菌 • 初发酵后以有阴、有阳稀释效果最好。 • 水样一定要摇均。 • 每个稀释倍数要求做5管。 • 接种环要求用酒精灯灼烧消毒，复发酵接
种时每一管都要在酒精灯上灼烧消毒。
26 思考题
• 配制好的培养基保存多少时间？存放时应 注意哪些事项？
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• 答：配制好的培养基不宜保存过久，以少 量勤配为宜。已灭菌的培养基可在4—100C 接种环要求用酒精灯灼烧消毒，复发酵接种时每一管都要在酒精灯上灼烧消毒。
20 结果的计算
• 根据不同接种量的发酵管所出现阳性结果 的数目，从表2或表3中查得每升水样中的 粪大肠菌群。
• 接种水样为100ml 2份，10ml 10份，总量 300ml 时，查表2可得每升水样中粪大肠菌 群；
• 接种5份10ml 水样，5份1ml水样，5份 0.1ml水样时，查表3求得MPN指数，MPN 值再乘10，即为1升水样中的粪大肠菌群；
• 相对未受污染的水样接种量为10ml、1 ml 、0.1 ml。受污染水样接种量根据污染程度 接种1 ml、0.1 ml、0.01 ml、或0.1 ml、 0.01 ml、0.001 ml等。
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• 培养液的浓度和量的选择：
• 如接种体积为10 ml，那么试管内应装 有三倍浓度乳糖蛋白胨培养液5mL； 如接种量为1mL或少于1mL，那么可 接种普通浓度的乳糖蛋白胨培养液 10mL中。
• 如果接种的水样量不是10mL、1mL 和 0.1mL，而是较低或较高的三个浓度的水样 量，也可查表求得MPN 指数，再经下面公 式换算成每100mL 的MPN 值。
表2 大肠菌群检数表
接种水样总量300mL(100mL2份，10mL10份)
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பைடு நூலகம்38
〔即按上述配方比例三倍〔除蒸馏水外〕，配成三倍浓缩的乳糖蛋白胨培养液〕 根据不同接种量的发酵管所出现阳性结果的数目，从表2或表3中查得每升水样中的粪大肠菌群。 在密封瓶中的脱水培养基成品要存放在大气湿度低，温度低于30摄氏度的暗处，存放时应防止阳光直接照射，并且要防止杂菌倾入和液 体蒸发。 配制好的培养基保存多少时间？存放时应注意哪些事项？ 置高压蒸气灭菌器中，115℃高压灭菌器中灭菌20min，灭菌后pH应为6. 因此在实验设计上，水样检验所要求重复的数目，要根据所要求数据的准确度而定。 受污染水样接种量根据污染程度接种1 ml、0. 接种环要求用酒精灯灼烧消毒，复发酵接种时每一管都要在酒精灯上灼烧消毒。 6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充分混匀，分装于试管中，于115℃高压灭菌器中灭菌20min，贮存于冷暗处备用。 实验用水为新制备的去离子水。 将水样充分混匀后，根据水样污染的程度确定水样接种量。 当培养液颜色变化，或体积变化明显时应废弃不用。 5℃下培养24h±2h。 如果从理论上考虑，并且进行大量的重复检定，可以发现这种估计有大于实际数字的倾向。 接种水样为100ml 2份，10ml 10份，总量300ml 时，查表2可得每升水样中粪大肠菌群；
2 水中微生物简介
• 自然界的水可分为地下水和地面水，除了 地下深层水外，如湖泊，河流，海洋等各 种地面水中都存在着各种各样的微生物。 但它们所含的微生物种类，数量和分布都 不相同。其中有些是“土生土长〞的。另一 些水生细菌是外来的，它们来自土壤，空 气，垃圾，工厂废物或城市下水道污水。 而来自下水道的微生物中，很可能含有人 体肠道致病菌，例如霍乱，伤寒，副伤寒 和痢疾等病原菌。
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2. 初发酵试验
将水样分别接种到盛有乳糖蛋白 胨培养液的发酵管中。在 37℃±0.5℃下培养24h±2h。产 酸和产气的发酵管说明试验阳性 。入在倒管内产气不明显，可轻 拍试管，有小气泡升起的为阳性 。
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注意： 参加水样时，先将培养管管口用酒精灯消毒
一次，参加水样后再用酒精灯消毒一次， 封口。
13 培养基的存放
在密封瓶中的脱水培养基成品要存放在大 气湿度低，温度低于30摄氏度的暗处，存 放时应防止阳光直接照射，并且要防止杂 菌倾入和液体蒸发。当培养液颜色变化， 或体积变化明显时应废弃不用。
14 测定步骤
• 1. 水样接种量的选择
• 将水样充分混匀后，根据水样污染的程度 确定水样接种量。每个样品至少用三个不 同的水样量接种。同一接种水样量要有五 管。
4 污水的细菌学检验
• 水质的细菌学检验主要包括两个常规工程 ：细菌总数和总大肠菌群。
5 总大肠菌群测定的两种方法
• 多管发酵法 • 滤膜法
6 粪大肠菌群的定义
• 粪大肠菌群是总大肠菌群的一局部，主要 来自粪便。在44.5℃温度下能生长并发酵 乳糖产酸产气的大肠菌群称为粪大肠菌群 。用提高培养温度的方法，造成不利于来 自自然环境的大肠菌群生长的条件，使培 养出来的菌主要为来自粪便中的大肠菌群 ，从而更准确地反映出水质受粪便污染的 情况。
5℃下培养24h±2h。 每个稀释倍数要求做5管。
存放一个月。存放时应防止阳光直射，并 每个稀释倍数要求做5管。
按上述乳糖蛋白胨培养液的制备方法配制。 三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液：
且防止杂菌侵入和液体蒸发。 已灭菌的培养基可在4—100C存放一个月。
本标准适用于地表水，地下水及废水中粪大肠菌群的测定。 实验用水为新制备的去离子水。 根据不同接种量的发酵管所出现阳性结果的数目，从表2或表3中查得每升水样中的粪大肠菌群。 而来自下水道的微生物中，很可能含有人体肠道致病菌，例如霍乱，伤寒，副伤寒和痢疾等病原菌。 实际上它是根据统计学理论，估计水体中的大肠杆菌密度和卫生质量的一种方法。 6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充分混匀，分装于试管中，于115℃高压灭菌器中灭菌20min，贮存于冷暗处备用。 5 总大肠菌群测定的两种方法 总大肠菌群测定过程的复发酵试验中，接种完菌落后，应将发酵管置于 0C温度下培养 h。
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• 阳性的判别：既产酸又产气：
• 观察：24h小时后取出观察培养 管，颜色由紫色变为黄色和有 气泡产生两个方面才能判为阳性
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3. 复发酵试验 轻微震荡初发酵试验阳性结果的发酵管，用
3mm接种环或灭菌棒将培养物转移到EC培 养液中。在44.5℃±0.5℃下培养24h±2h 〔水浴箱的水面应高于试管中培养基液面 〕。接种后所有发酵管必须在30分钟内放 进水浴中。培养后立即观察，发酵管产气 那么证实为粪大肠菌群阳性。
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举例：
某水样接种10mL 的5 管均为阳性；接 种1mL 的5 管中有2 管为阳性；接种 1：10 的水样1mL 的5 管均为阴性。 从最可能数〔MPN〕表中查检验结果 5-2-0，得知100mL 水样中的总大肠 菌群数为49 个，故1L 水样中的总大 肠菌群数为49×10=490 个。
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9 培养基及试剂
• 本标准所用试剂除另有说明，均为符合国 家标准的分析纯化学试剂；实验用水为新 制备的去离子水。
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单倍乳糖蛋白胨培养液： 将10g 蛋白胨、3g 牛肉寖膏、5g 乳糖和5g
氯化钠加热溶解于1000mL 蒸馏水中，调节 溶液pH 为7.2—7.4，再参加1.6%溴甲酚紫 乙醇溶液1mL，充分混匀，分装于试管中， 于115℃高压灭菌器中灭菌20min，贮存于 冷暗处备用。