脱氮菌剂的构建及最优脱氮条件

脱氮菌剂的构建及最优脱氮条件
吴敏;欧阳超毅;刘雷
【摘要】将实验室筛选得到的3株脱氮性能较好的异养硝化-好氧反硝化菌WN1、WN3以及DN02,通过混料设计考察各菌株的最佳复配比,以最佳复配比构建脱氮
菌剂,并以碳源、pH、温度、ρCOD/ρTN以及转速为单因素探究菌剂的最优脱氮
条件,验证菌剂在最优条件下的脱氮性能.结果表明:菌剂的最佳复配比
φWN1=0.935%,φWN3=0.965%,φDN02=1.100%,在此复配比下,氨氮的去除率
达到90.37%.在30 ℃,碳源为琥珀酸钠,pH为7,ρCOD/ρTN为12,转速为150 r·min-1的菌剂最优脱氮条件下,菌剂的氨氮去除率为91.18%.%The laboratory screened three strains of WN1,WN3 and DN02,which were heterotrophic nitrifica-tion-aerobic denitrification strains and had good performance of nitrogen removal.The optimum mixture ratio of each strain was investigated using mixture design.In order to study the optimum conditions of nitrogen removal,some fac-tors such as carbon
source,pH,temperature,ρCOD/ρTNand speed,were investigated by the experiment of single fac-tor.The results indicated that the optimum mixture ratio of φWN1was 0.935%,φWN3was 0.965%,and φDN02was
1.100%,the removal rate of ammonia nitrogen reached 90.37%.The optimum conditions were as follows:the pH of 7.0,the carbon source of sodium succinate,the temperat ure of 30 ℃,the ρCOD/ρTNof 12 and the speed of 150 r· min-1.Under this condition,the removal rate of ammonia nitrogen reached 91.18%.
【期刊名称】《南昌大学学报（工科版）》
【年(卷),期】2017(039)003
【总页数】6页(P231-235,240)
【关键词】异养硝化-好氧反硝化菌;混料设计;脱氮
【作者】吴敏;欧阳超毅;刘雷
【作者单位】南昌大学资源环境与化工学院,江西南昌330031;南昌大学资源环境
与化工学院,江西南昌330031;南昌大学资源环境与化工学院,江西南昌330031【正文语种】中文
【中图分类】X172
目前，我国已有超过66%的湖泊和水库存在不同程度的富营养化现象，其中重富
营养和超富营养占到了22%[1]。

未经处理或未达标的氨氮污、废水排放的增加是导致水体(特别是封闭水体)富营养化的重要原因[2]，由于这些含氨氮的污废水具有排放量大、毒性强、成分复杂、处理难度大的特点，使得氨氮污废水的处理研究成为国内外的热点[3]。

传统的生物脱氮由硝化过程和反硝化2个过程组成，而这2
个过程由于硝化菌以及反硝化菌对环境的需求有差异，使得这2个过程必须分开
完成，导致了传统生物处理存在反应时间长和占地面积大等缺点[4]。

随着一些异
养硝化-好氧反硝化菌的发现，如Alcaligenes faecalis No.4[5]、Bacillus subtilis A1[6]、Acinetobacter junii YB[7]以及Acinetobacter calcoaceticus HNR[8]等，克服了传统生物脱氮时间和空间不统一的弊端，提高了生物脱氮效率[9]。

但是，
近年来污水水质变得更加复杂，用单一菌种很难将其彻底降解，致使研究人员将目光转向微生物菌剂。

微生物菌剂在环境治理中主要有以下几个方面的应用：污泥减
量[10]、难降解有机物的降解[11]、含氮污水处理[12]。

本研究利用异养硝化-好氧反硝化菌株进行菌剂复配，研究了混合异养硝化-好氧反硝化菌株的最佳复配比，
并考察最佳复配比时氨氮去除的最优条件。

1.1 材料
1.1.1 菌株来源
实验所用菌株为本实验室自行筛选的3株脱氮性能好的异养硝化-好氧反硝化菌,编号为WN1、 WN3以及DN02。

1.1.2 培养基
异养硝化富集培养基[13]：(NH4)2SO4 0.472 g，琥珀酸钠4.052 g，50 mL维
氏盐溶液，补充蒸馏水定容至1 000 mL，pH 7.0～7.5，固体培养基加20 g琼脂。

其中维氏盐溶液：K2HPO4 5.0 g·L-1，FeSO4·7H2O 0.05 g·L-1，NaCl 2.5 g·L-1，MgSO4·7H2O 2.5 g·L-1，MnSO4·4H2O 0.05 g·L-1。

异养硝化分离培养基：(NH4)2SO4 0.24 g，其余同异养硝化富集培养基。

1.1.3 分析方法
采用纳氏试剂光度法；采用紫外分光光度法；氮采用N-( 1-萘基) -乙二胺光度法。

1.2 方法
1.2.1 3种菌株混合培养初探
先将3株菌制备成种子液。

在已加入300 mL异养硝化富集培养基的500 mL的
三角烧瓶中分别加入WN1+WN3菌悬液各1.5 mL、WN1+DN02菌悬液各1.5 mL、WN3+DN02菌悬液各1.5 mL、WN1+WN3+DN02菌悬液各1 mL，
30 ℃、170 r·min-1摇床培养48 h，每隔4 h取样测定培养基中的质量浓度。

1.2.2 混料设计确定菌剂复配比
应用Design Expert 8.0.5实验设计软件，以WN1(A)、WN3(B)和DN02(C) 3株菌的菌悬液体积为自变量，以氨氮的去除率为响应值，3株菌的边界值均设定为0
到3，并且3株菌总接种体积分数为3%。

通过软件随机得到实验设计表。

将各菌株的菌悬液以实验设计表的比例接种到异养硝化富集培养基，置于30 ℃，170 r·min-1摇床培养，每隔4 h测定培养基的质量浓度(ρ)，确定各复配比氨氮的最大去除率。

1.2.3 菌剂最优脱氮条件研究
将在不同碳源(琥珀酸钠、蔗糖、葡萄糖、酒石酸钾钠)、不同温度、不同pH、不同ρCOD/ρTN以及不同转速下进行单因素实验，摇床培养，定期测定培养基中的质量浓度。

2.1 3种菌株混合培养初探
3株菌在30 ℃，170 r·min-1摇床培养过程中，培养基的质量浓度变化如图1所示。

可知：与单菌相比，混菌的最大去除效率都有所提升，WN1+DN02组合为75.48%，WN3+DN02组合为80.68%，WN1+WN3组合为84.4%，去除率(η)最大的是WN1+WN3+DN02组合，达到89.76%。

除WN1+WN3组合达最大去除率的时间较长外，其他组合的去除时间有明显的减少，都在28 h内达到最大去除率，其中WN1+WN3+DN02组合在16 h达到最大去除率，表现出很好的脱氮性能，也说明了3株菌能够进行共生培养。

2.2 混料设计结果分析
2.2.1 混料设计模型分析
测定3种菌株在不同组合下的氨氮去除率，利用Design Expert 8.0.5软件对所得的结果进行拟合，得到了氨氮去除率(η)的回归方程，结果如下：
对回归方程进行方差分析，结果如表1，本实验模型极显著(P<0.001)，都在0.01水平上极显著，失拟项P>0.05，说明该回归方程拟合度好。

通过对回归方程的方差进行分析表明，R2(回归方程的校正决定系数)=0.999 1，表明结果的变异有回归方程的校正决定系数)=0.997 7，皆可以说明该模型有效。

2.2.2 结果分析
通过对混料设计的结果分析，可以分析得到各菌株比例的变化对氨氮去除率(η)的
影响情况。

从图2中的三元等高线图可以看出3 种菌株对氨氮去除率的影响均起
着主导作用，3D响应面曲线图越靠近中心越呈现球面，说明WN1、WN3和
DN02 3种菌对氨氮去除率的影响具有交互作用，3种菌共存的情况氨氮的去除效果比较好，而且在3种菌比例相近的情况下氨氮去除效果最好，3株菌的接种体积分数(φ)均为1%时，氨氮去除率达到90.02%。

2.2.3 复配比优化
通过上述分析可以看出，3株菌的比例相近的情况下氨氮的去除率(η)较好，所以
通过设定各菌株投加量的范围，3株菌的接种体积分数均设定为0.9%～1.1%这个范围内，氨氮去除率取最大值，上限100%。

最终软件给出了1组组合，并给出了优化后的预测值如表2所示。

2.2.4 优化复配比的验证
将各菌株按照上述得到的最优复配比，接种到已灭菌的异养硝化富集培养基中，置于30 ℃，170 r·min-1摇床培养，定期取样检测培养基中的质量浓度。

结果显示，氨氮的去除率为的最大累积量为7.58 mg·L-1，没有检测到所以，φWN1为
0.935%，φWN3为0.965%，φDN02为1.100%是菌剂的最佳复配比。

2.3 菌剂脱氮的最优条件选择
2.3.1 碳源对菌剂脱氮效果的影响分析
由图3可知，在以琥珀酸钠为唯一碳源的培养基中，在30 ℃，170 r·min-1摇床培养48 h，菌剂的氨氮去除率最高，达到89.72%。

研究发现，结构越简单，分
子量越小的碳源，越容易促进菌株的生长，更好地保证反硝化的顺利进行，此外琥珀酸直接参与三羧酸循环，相比其他碳源产能路径更短[14]。

在以葡萄糖、蔗糖为碳源的培养基中，氨氮去除率则较低，分别为61.77%、46.96%。

而在以酒石酸
钾钠为唯一碳源的培养基中，氨氮的去除率最低，仅为24.97%，可能是由于酒石酸钾钠不属于生物易降解，菌株对其生物降解性小，导致其不能很好地满足菌株的生长，进而影响菌剂的脱氮效果。

2.3.2 pH不同对菌剂脱氮效果的影响分析
由图4可知，在氨氮质量浓度相同，以琥珀酸钠为碳源条件下，pH为5～7时，
菌剂的脱氮效率随pH的升高逐渐增大，氨氮去除率从59.41%上升到89.09%，pH为7～8时，氨氮的去除率基本保持不变，而随着pH的继续上升，当pH为9时，菌剂对脱氮效率有一定的下降，氨氮去除率为81.31%。

由此可知，菌剂脱氮的最佳pH范围为7～8，这是可能由于比游离氨更容易利用AMO，因此游离氨
质量浓度越高越容易进行异养硝化作用[15]。

许多研究也表明，异养硝化-好氧反
硝化菌的适宜pH为中性或弱碱性[16]。

2.3.3 温度高低对菌剂脱氮效果的影响分析
如图5所示，在氨氮初始质量浓度相同的条件下，以琥珀酸钠为碳源，pH为7.2时，菌剂对氨氮的去除效果随温度的升高呈现先增大后减少的趋势，温度从5 ℃
升高到30 ℃，是显现逐渐增大的趋势，氨氮的去除率从0.012%上升到89.67%。

而从30 ℃上升到37 ℃时，温度对菌剂的脱氮性能影响不大，氨氮降解率从89.7%下降到85.05%，仅下降了4.65%。

随着温度的继续上升，当温度达到42 ℃时，氨氮的去除率下降到56.51%，下降比较明显，由此可以看出菌剂脱氮的最佳温度范围为30～37 ℃。

2.3.4 ρCOD/ρTN不同对菌剂脱氮效果的影响分析
如图6所示，在氨氮初始质量浓度相同的条件下，以琥珀酸钠为碳源，pH为7.2，温度为30 ℃条件下，菌剂的脱氮性能随着ρCOD/ρTN的升高呈现先上升后下降的趋势，ρCOD/ρTN从2升高到12，菌剂的脱氮性能不断上升，氨氮的去除率
从46.63%上升到88.94%，在ρCOD/ρTN为12时菌剂脱氮效果达到最好，再继
续增大ρCOD/ρTN，当ρCOD/ρTN为16时，菌剂的脱氮效果下降，从88.94%下降到了77.49%。

由此可见，ρCOD/ρTN过低的话会影响到菌剂的脱氮性能，
当ρCOD/ρTN逐渐调高到合适的值时，菌剂的脱氮性能得到加强，直至达到最大，继续增大ρCOD/ρTN，反而会影响菌剂的脱氮的性能。

综上所述，菌剂脱氮最佳ρCOD/ρTN为12。

已经报道的大部分异养硝化-好氧反硝化菌的最佳
ρCOD/ρTN一般为6～10[17]，说明菌剂对碳源的需求略高。

2.3.5 转速不同对菌剂脱氮效果的影响分析
如图7所示，在氨氮初始质量浓度相同的条件下，以琥珀酸钠为碳源，pH为7.2，温度为30 ℃，ρCOD/ρTN比为12的条件下，菌剂的脱氮性能随着转速(R)的升
高呈现先上升后下降的趋势，当转速从50 r·min-1增加到150 r·min-1时，氨氮
的去除率从37.19%上升到90.41%，随着转速的继续增加，氨氮的去除率开始下降，当转速达到190 r·min-1时，氨氮的去除率下降为72.82%。

研究表明，培养基中DO质量浓度与摇床转速呈现正相关性[5]。

因此低转速时，体系的DO质量
浓度较低供氧不足，直接影响菌株的生长代谢，而DO质量浓度的差异也会影响
微生物的硝化作用，甚至可以控制硝化代谢产物[19]。

而当转速过高时，可能损伤菌体细胞，甚至造成细胞死亡，使得菌株氨氮降解率低。

2.4 最优条件下菌剂的脱氮情况
菌株以表2最优组合的体积接种至，以琥珀酸钠为碳源，pH为7，ρCOD/ρTN
为12的异养硝化富集培养基中，置于30 ℃，150 r·min-1摇床培养24 h后的质量浓度随时间变化如图8所示。

可知：从0～16 h这个时间段，随着时间的增加，氨氮的质量浓度逐渐降低，去
除率也逐渐增大，到16 h氨氮的质量浓度降到最低，为12.03 mg·L-1，氨氮的
去除率达到最大，为91.18%，16～24 h这个时间段里，氨氮的质量浓度基本保
持不变，略微有小幅的上升。

而体系的硝态氮仅在16 h有少量的积累，质量浓度
分别为3.58 mg·L-1和3.89 mg·L-1，整个过程中都没有检测到亚硝态氮的存在。

本研究通过混料设计得到的3株异养硝化好氧反硝化菌株构成菌剂的最佳复配比，探究了该复配比下菌剂的脱氮性能，得到以下结果：
1) 3株菌具有良好的共生关系，3株菌等比例混合培养时氨氮的去除率达到
89.76%，降解时间也缩短为16 h。

2) 通过混料设计得出3株菌的最优复配比为WN1为0.935%，WN3为0.965%，DN02为1.100%，氨氮的去除率达到90.37%。

3) 通过单因素实验得出菌剂的最优脱氮条件，培养基的碳源为琥珀酸钠，pH为7，ρCOD/ρTN为12，培养条件为30 ℃，150 r·min-1摇床培养。

4) 菌剂在最优条件下氨氮的去除率最大能达到91.18%，硝态氮累积量最大为
3.58 mg·L-1，整个过程中都没有检测到亚硝态氮的存在。

【相关文献】
[1] HUANG Y P.Contamination and control of aquatic environment in Lake
Taihu[M].Beijing:Science Press,2001.
[2] PAERL H W,HALL N S,CALANDRINO E S.Controlling harmful cyanobacterial blooms in
a world experiencing anthropogenic and climatic-induced change[J].Science of the Total Environment,2011,409(10):1739-1745.
[3] 钟金松,闵育顺,肖贤明.浅谈高浓度氨氮废水处理的可持续发展方向[J].环境科学与技
术,2008,31(2):92-94.
[4] 方士,李筱焕.氨氮味精废水的亚硝化/反亚硝化脱氮研究[J].环境科学学报,2001,21(1):79-83.
[5] JOO H S,HIRAI M,SHODA M.Characteristics of ammonium removal by heterotrophic nitrification-aerobic denitrification by Alcaligenes faecalis No.4[J].Journal of Bioscience & Bioengineering,2005,100(2):184-191.
[6] YANG X P,WANG S M,ZHANG D W,et al.Isolation and nitrogen removal characteristics of an aerobic heterotrophic nitrifying-denitrifying bacterium,Bacillus subtilis
A1[J].Bioresour Technol,2011,102(2):854-862.
[7] REN Y X,YANG L,LIANG X.The characteristics of a novel heterotrophic nitrifying and aerobic denitrifying bacterium Acinetobacter junii YB[J].Bioresource
Technology,2014,171:1-9.
[8] ZHAO B,HE Y L,HUGHES J,et al.Heterotrophic nitrogen removal by a newly isolated Acinetobacter calcoaceticus HNR[J].Bioresource Technology,2010,101(14):5194-5200.
[9] 苏婉昀,高俊发,赵红梅.异养硝化-好氧反硝化菌的研究进展[J].工业水处理,2013,33(12):1-5.
[10] 汪顺丽,查君茹,张宏才等.污泥减量菌剂及其水解污泥条件优化[J].环境化学,2016,35(4):817-825.
[11] BAO M T,WANG L N,SUN P Y,et al.Biodegradation of crude oil using an efficient microbial consortium in a simulated marine environment[J].Marine Pollution
Bulletin,2012,64(6):1177-1185.
[12] 肖晶晶.固定化脱氮菌群处理含氮污水的研究[D].北京：中国农业科学院,2011.
[13] ZHANG J,WU P,HAO B,et al.Heterotrophic nitrification and aerobic denitrification by the bacterium Pseudomonas stutzeri YZN-001 [J].Bioresource
Technology,2011,102(21):9866-9869.
[14] HER J J,HUANG J S.Influences of carbon source and C/N ratio on nitrate/nitrite denitrification and carbon breakthrough [J].Bioresource Technology,1995,54(1):45-51. [15] MÉVEL G,PRIEUR D.Heterotrophic nitrification by a thermophilic Bacillus species as influenced by different culture conditions[J].Canadian Journal of
Microbiology,2000,46(5):465-473.
[16] 高喜燕,刘鹰,郑海燕,等.一株海洋好氧反硝化细菌的鉴定及其好氧反硝化特性[J].微生物学报,2010,50(9):1164-1171.
[17] ZHAO B,AN Q,HE Y L,et al.N2O and N2,production during heterotrophic nitrification by Alcaligenes faecalis strain NR[J].Bioresource Technology,2012,116(4):379-385. [18] PEDERSE H,DUNKIN K A,FIRESTONE M K.The relative importance of autotrophic and heterotrophic nitrification in a conifer forest soil as measured by 15N tracer and pool dilution techniques[J].Biogeochemistry,1999,44(2):135-150.。