微藻中二酰基甘油酰基转移酶基因(DGAT)结构及进化分析

第３７卷第６期２０１８年㊀１１月
华㊀中㊀农㊀业㊀大㊀学㊀学㊀报
J o u r n a l o fH u a z h o n g A g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y
V o l ．３７㊀N o ．６
N o v ．２０１８,３０~３９
收稿日期:２０１８Ｇ０１Ｇ１４
基金项目:国家自然科学基金项目(３１７７０３９３
)杨㊀晓,硕士研究生．研究方向:藻类生物学．E Ｇm a i l :５１１６５３２２４＠q q
．c o m 通信作者:梁成伟,博士,副教授．研究方向:藻类生物学．E Ｇm a i l :z p y a n g
x i a o １９９３＠１６３．c o m 微藻中二酰基甘油酰基转移酶基因(DGAT )
结构及进化分析
杨㊀晓㊀梁成伟
青岛科技大学海洋科学与生物工程学院,青岛２６６０４２
摘要㊀从数据库中获取微藻及高等植物中的二酰基甘油酰基转移酶基因(D G A T )
,对４种酶通过基因和蛋白质结构的比较及系统发育树的构建进行多样性和进化程度分析.为了进一步分析微藻中D G A T 的进化过程,对其进行正选择位点的检验,推测其在进化过程中受到的选择压力.结果显示:微藻中不同类型D G A T 的基因结构及蛋白质结构差异较大,微藻与其他高等植物相比,同一种类型的D G A T 的蛋白质结构和基因结构也有较大差别.同时发现微藻中D G A T 同其他高等植物中的D G A T 有不同的进化过程.选择压力分析结果显示,微藻及高等植物的D G A T ２和W S /D G A T 存在可信度较高的正选择位点,D G A T １和D G A T ３未发现正选择位点.对微藻中D G A T 的进化研究有助于破译其在油脂积累中的作用,
推动可再生能源的研究.关键词㊀微藻;二酰基甘油酰基转移酶;基因结构;正选择位点;系统发育
中图分类号㊀Q９３９．９㊀㊀文献标识码㊀A㊀㊀文章编号㊀１０００Ｇ２４２１(２０１８)０６Ｇ００３０Ｇ０１０
㊀㊀能源是人类生存与发展的生物基础,
传统的能源有水㊁木材㊁石油㊁天然气和煤炭等[１
].但是随着经济迅速发展,石油㊁煤炭等过度消耗,能源面临枯竭的危机,许多国家把研究的重点转移到可再生生
物能源的开发利用上,以此替代化石能源[
２
].微藻是第３代生物能源的潜在资源,它们有着以自养方式生产㊁不占用农业土地资源㊁可以在海水或废水中
培养等优点,与陆地高等植物相比,微藻光合能力强,许多微藻脂质含量超过其干质量的５０％,因此,被看作当今最具有开发前途的能源之一[
３]
.小球藻含油率８％~３２％,三角褐指藻含油率为２０％~
３０％,微拟球藻含油率３１％~６８％[４Ｇ６]
,莱茵衣藻也是开发可再生柴油的重点研究对象.X i a o 等[７]
发
现N a n n o c h l o r o p
s i s o c e a n i c I M E T １通过半连续培养油脂含量高达自身干质量的６９％.M o h e i m a n i 等[８]
通过跑道池长期半连续培养颗石藻(P l e u r o Ｇc h r y s i s c a r t e r a e )后测得生物质产率为０．１９g /(L d ),含油率占３０％.C h i u 等[９]
通过柱式反应器培养微拟球藻(N a n n o c h l o r o p
s i so c e a n i Ｇc a )同样得到较高的产油率.在微藻及高等植物的T A G 生物合成途径中,D G A T 是二脂酰甘油向三
脂酰甘油转换的关键酶,是植物油脂储存积累的关键限速酶.一些研究已经证明植物中D G A T 在控制脂肪酸转变为甘油三酯的质量和数量上扮演着重要的角色.微拟球藻高产油藻D G A T 基因转录本
的绝对丰度明显高于其他低产油微藻[
１０]
.张晓舟[１１
]通过诱变使得莱茵衣藻突变菌株油脂含量显
著提高,实时荧光定量P C R 结果显示突变菌株的
D G A T １㊁D G A T ２㊁D G A T ３基因转录水平极显著提
高.最近,在对欧洲油菜(B r a s s i c an a p
u s )D G A T １的研究中证明抑制D G A T １基因的表达可以减少种子中油含量并且抑制发芽率,还会导致严重的发育
异常[１２]
.此外,大豆(G l y
c i n e m a x )中D G A T ２不同程度的表达使种子油含量不同程度地增加[
１３]
.正反向基因研究结果揭示了在一些植物中D G A T
的突变将直接影响油含量.根据细胞㊁
结构和亚细胞定位可将D G A T 分为４种不同的类型:D G A T １㊁
D G A T ２㊁D G A T ３(C y t o D G A T )和W S /D G A T .一些高等植物中的D
G A T １和D G A T ２已得到广泛的研究.T u r c h e t t o ＧZ o l e t 等[１４]
通过系统发育树㊁基因结构和表达分析揭示高等植物D G A T 的多样性和
进化过程,发现D G A T １㊁D G A T ２㊁D G A T ３和W S
/
㊀第６期
杨㊀晓等:微藻中二酰基甘油酰基转移酶基因(D G A T )
结构及进化分析㊀D G A T 是有很大差异的基因并在植物中有不同的来源,它们在不同器官和组织中有不同的表达模式.F e i 等[１５
]
发现绿藻的D G A T ３对低温和磷缺乏有着
显著的反应,并通过诱变研究D G A T ３的启动子原
件.W e i 等[１６]
研究发现微拟球藻D G A T １中的N o D G A T １A 可以通过过表达而促进T A G 的积累,推动了微藻遗传工程的研究.尽管D G A T 被认为是油脂合成途径中重要的
限速酶,但是其在微藻中的研究还不是很广泛,本研究选取几种具有代表性的高产油脂微藻,从微观的角度,分析微藻中D G A T 蛋白质结构㊁基因结构及进化关系,并同高等植物的D G A T 进行比较,旨在为探明D G A T 在微藻高产油脂方面的作用提供理论依据.
1㊀材料与方法
以T u r c h e t t o ＧZ o l e t 等[１４]报道的来自玉米(Z e a m a y s ,N P _００１２８８５５３．１)㊁麻风树(J a t r o p
h ac u r Ｇc a s ,N P _００１２９２９７３．１)㊁黏红酵母(R h o d o t o r u l a g l u t i n i s ,A B C ４１５４６．１)及拟南芥(A r a b i d o p
s i s t h a l i a n a ,A E D ９６３４６．２)中的D G A T 为目标序列;
在N C B I 和P h y
t o z o m e 数据库中通过同源性搜索,获得微拟球藻(N a n n o c h l o r o p
s i s o c e a n i c a )㊁莱茵衣藻(C h l a m y
d o m o n a sr
e i n h a r d t i i )㊁团藻(V o l v o x c a r t e r i
f ．n a
g a r i e n s i s )㊁三角褐指藻(P
h a e o d a c t y Ｇl u mt r
i c o r n u t u m )及小球藻(C h l o r e l l av a r i a b i l i s )
这５种微藻和２７种高等植物的D G A T 编码区序列和蛋白质序列,并得到相应的D G A T 的基因组序列,在微藻中未找到W S /D G A T 序列,
同时原始单细胞微藻如蓝藻中迄今为止未发现D G A T ,故不纳入研究范围.本研究中所用到的D G A T 序列所属的物种名㊁基因I D ㊁序列号及蛋白质长度见表１.1.1㊀序列比对和进化分析
微藻及高等植物中D G A T 的编码区序列和蛋
白质序列在分子进化遗传分析软件中通过C l u s t Ｇ
a l W 采用默认设置进行比对(M E G A v e r s i o n ７．
０)[１７],多重比对需要在最后的分析中手动对齐,采用M E G A７．０软件中的最大似然法(m a x i m u m l
i k e l i h o o d ,M L )进行蛋白质序列比对后进化模型的构建.表１㊀本研究中所用到的D G A T 序列所属物种名㊁基因I D ㊁
序列号及蛋白质长度T a b l e １㊀S p e c i e s ,g e n e n a m e ,a c c e s s i o nn u m b e r s a n d p r o t e i n l e n g t ho fD G A T s e q u e n c e s r e t r i e v e d i n t h i s s t u d y
物种
S p e c i e s 分类术语
T a x a t e r m i n o l o g
i e s 基因I D
G e n e I D
数据库
D a t a b a s e
序列号
A c c e s s
长度(a a )L e n g
t h C h l o r e l l av u l g
a r i s C v u
D G A T １N C B I A L P １３８６５．１４６０D G A T １N C B I A L P １３８６３．１４６０C h l o r e l l av a r i a b i l i s
C v a
D G A T １N C B I X P _００５８４２８０９．１４４５S o l a n u m p e n n e l l i i S p e D G A T １N C B I X P _０１５０５９２８９．１５１６S o l a n u ml y c o p e r s i c u m S l y D G A T ２N C B I X P _０１０３１７０５８．１３０４W S /D G A T P h y t o z o m e S o l y c ０１g ０１１４３０．２．１５０６M e d i c a g
o t r u n c a t u l a M t r D G A T １N C B I X P _００３５９５２３１．２
５３９D G A T ２N C B I X P _００３６１２４３６．１３２１D G A T ３N C B I X P _００３６０９８９０．１３４１W S /D G A T P h y t o z o m e M t r _X P _００３５８８５２２．１４８３Z e am a y s Z m a
D G A T １N C B I N P _００１２８８５５３．１４９４P e r i l l a f r u t e s c e n s P f r D G A T １N C B I A A G ２３６９６．１５３４X a n t h o c e r a s s o r b i f o l i u m X s o D G A T １N C B I A G O ３２０４８．１５１８D G A T ２N C B I A G O ３２０４９．１３３３S e s a m u mi n d i c u m S i n D G A T １N C B I N P _００１２９１３３４．１５４３D G A T ２N C B I X P _０１１０９８００９．１３３５O l e a e u r o p a e a O e u D G A T １N C B I A A S ０１６０６．１５３２N i c o t i a n a t a b a c u m N t a D G A T １N C B I N P _００１３１３０１４．１５３２D G A T ２N C B I N P _００１３１２２１９．１３３２L o t u s j a p o n i c u s L j a D G A T １N C B I A AW ５１４５６．１５１１J a t r o p h a c u r c a s J c u D G A T １N C B I N P _００１２９２９７３．１３５２P u n i c a g r a n a t u m P g r D G A T １N C B I A F X ７１９２４．１５４０V o l v o xc a r t e r i
V c a
D G A T １N C B I X P _００２９５７４１８．１４６４D G A T ２N C B I X P _００２９４７２１５．１３２５D G A T ３N C B I X P _００２９４６８０８．１３７０C h l a m y d o m o n a s r e i n h a r d t C r e
D G A T １N C B I X P _００１６９２５９３．１３８７D G A T ２N C B I X P _００１６９４９０４．１３２４D G A T ２N C B I X P _００１６９１４４７．１３４６D G A T ３N C B I X P _００１６９１３４２．１
３４６
１
３
㊀㊀华中农业大学学报
第３７卷㊀
续表１C o n t i n u e dT a b l e １物种
S p e c i e s 分类术语
T a x a t e r m i n o l o g
i e s 基因I D
G e n e I D
数据库
D a t a b a s e
序列号
A c c e s s
长度(a a )L e n g
t h G o n i u m p e c t o r a l e
G p
e D G A T １N C B I K X Z ５３６５１．１２７７D G A T ３N C B I K X Z ５４５０５．１３１４V e r n i c i a
f o r d i i
V f o D G A T ３N C B I A G L ８１３０９．１２７８R i c i n u s c o mm u n i s R c o D G A T ２N C B I N P _００１３１０６１６．１３４０W S /D G A T P h y t o z o m e S c o _２９７４２．m ００１４２０５０６S o l a n u mt u b e r o s u m S t u D G A T ２N C B I X P _００６３６５０１５．１３３３N a n n o c h l o r o p s i s o c e a n i c a N o c D G A T ２N C B I A Q T １９７０９．１３６３D G A T ２N C B I E WM ２３１８７．１３６０P h a e o d a c t y l u mt r i c o r n u t u P t r D G A T ２N C B I A F M ３７３１４．１３２９D G A T ２N C B I A F Q ２３６５９．１３５９E m i l i a n i ah u x l e y i E h u D G A T ２N C B I X P _００５７６０７０２．１３３４C a m e l i n a s a t i v a C s a D G A T ３N C B I A QM ５２３７２．１２８５W S /D G A T N C B I X P _０１９０９１４５０．１４６９R h o d o t o r u l a g l u t i n i s R g l D G A T ３N C B I A B C ４１５４６．１２２１G l y c i n em a x G m a D G A T ３N C B I X P _００３５４２４０３．１３２７W S /D G A T P h y t o z o m e G l y m a ．０９G １９６４００．１４８０C i c e r a r i e t i n u m C a r D G A T ３N C B I X P _０１２５７３３４６．１３１５V i g n aa n g u l a r i s V a n D G A T ３N C B I X P _０１７４２３０００．１３３０P h a s e o l u s v u l g a r i s P v u D G A T ３N C B I X P _００７１５４４８７．１３２８V i t i s v i n i f e r a V v i D G A T ３N C B I X P _００２２６９５８２．１３６２A r a b i d o p
s i s t h a l i a n a A t h
D G A T ３P h y t o z o m e A T １G ４８３００．１２８５W S /D G A T P h y t o z o m e A
E D ９１８０７．１４８０W S /D G A T P h y t o z o m e A E D ９２２８２．１４８８W S /D G A T P h y t o z o m e A A U ９００６６．１４８１W S /D G A T P h y t o z o m e A A T ６９１５６．１２０６W S /D G A T P h y t o z o m e A E E ３５２７５．１４７０R a p h a n u s s a t i v u s R s a
W S /D G A T N C B I X P _０１８４７５４０６．１４８１N o c c a e a c a e r u l e s c e n s N c a W S /D G A T N C B I J A U ６５１５７．１４８３B r a s s i c an a p u s B n a W S /D G A T N C B I X P _０１３６７４５３１．１４７６B r a s s i c a r a p a B r a W S /D G A T N C B I X P _００９１３１２８２．１４７９M a n i h o t e s c u l e n t a M e s W S /D G A T P h y t o z o m e M e s _O A Y ４９０１５．１５１５A r a b i d o p s i s l y
r a t a A l y
W S /D G A T
P h y t o z o m e A L ７G ４５９００．t １
５００
1.2㊀基因和蛋白质结构分析
对D G A T １㊁D G A T ２㊁D G A T ３及W S /D G A T
基因结构的比较,主要通过G S D S ２．０[１
８]
服务器分析D G A T 编码区序列及对应基因组序列.除此之外,还通过跨膜预测服务器T MHMM Ｇ２．０和S M A R T [１
９]
数据库对D G A T 蛋白质序列进行跨膜结构预测.
1.3㊀正选择位点检验
采用P AM L 软件包估算微藻及高等植物的
D G A T 在进化中受到的选择压力[２
０].在蛋白质水平上,可以用d N 和d S 的比值ω来表示选择压力,进而判断自然选择对同义突变的固定是起推动作用还是阻碍作用[
２１]
.如果ω＝１即同义替换率与非同义替换率相等,则被认为是中性进化.如果ω＜１,即d N ＜d S ,则代表净化选择;与之相反,若ω＞１,即d N ＞d S ,代表正选择.ω＞１的显著性可被当作蛋白质发生适应性进化的证据[２２]
.采用位点模型㊁分支模型进行分析.
１)位点特异性模型.通过位点模型(s i t em o d Ｇe l
)研究位点特异性选择情况,采用以下６个最大似然模型:M ０(单一ω)㊁M １a (近中性)㊁M ２a
(正选择)㊁M ３(离散)㊁M ７(β)和M ８(β&ω)[２３]
.２)分支特异性模型.在D G A T １㊁D G A T ２及
D G A T ３的树文件中单独标出藻类分支依次为a ㊁b ㊁c .通过分支位点模型研究藻类与高等植物选择压力的不同,由于未找到微藻的W S /D G A T 序列,故在此对其不作分析.设置m o d e l ＝０,N s i t e ＝０与
M ０模型进行比较,并通过L R T s 是否显著判断可
信度[１８]
,后验概率通过P AM L 中贝叶斯检验(
B E B )计算得到[２４
].2㊀结果与分析
2.1㊀序列比对和进化分析
为研究微藻中４种D G A T 类型的系统发育关系,分析微藻与其他高等植物D G A T 的进化关系,
通过N C B I 及P h y
t o z o m e 数据库以T u r c h e t t o ＧZ o Ｇl e t 等[１
４]
报道的部分序列作为目标序列进行同源性搜索,获得了５种微藻及２７种高等植物的D G A T 序列,通过M L 法构建系统发育树,结果如图１所２
３
㊀第６期杨㊀晓等:微藻中二酰基甘油酰基转移酶基因(D G A T)结构及进化分析㊀
示.从树的拓扑结构可以看出４种D G A T基本单独成支,且在D G A T１㊁D G A T２及D G A T３分支中均观察到藻类属于单独的分支.值得注意的是,小球藻的D G A T１单独成支,与玉米㊁蒺藜状苜蓿(M e d i c a g o t r u n c a t u l a)等其他高等植物的D G A T１有共同的起源,相较于其他高等植物D G A T１,团藻与莱茵衣藻的D G A T１与其自身D G A T２亲缘关系更近,与其他微藻及高等植物D G A T１有共同起源.三角褐指藻㊁微拟球藻㊁团藻及莱茵衣藻的D G A T２有明显的独立分支,这与T u r c h e t t oＧZ o l e t[１４]等观察到的结果相符.莱茵衣藻和小球藻的D G A T３也有单独的分支,与拟南芥㊁大豆等高等植物有共同的起源,结果与D G A T２相似.W S/D G A T序列,不仅与D G A T１序列关系相近,且有共同的起源.通过分析系统发育树可知,不仅微藻与其他高等植物的D G A T１进化路线不同,不同微藻中的D G A T１进化路线也不同.此外,D G A T３在D G A T１㊁D G A T２及W S/D G A T进化之前就已经存在了,提示我们微藻及高等植物的D G A T在进化过程中可能首先进化出了D G A T３,随着时间推移再相继进化出W S/ D G A T㊁D G A T１及D G A T２.系统发育树所表现出来的微藻单独成支,说明在漫长的进化过程中,微藻可能由于环境等因素形成独立进化路线,因此,微藻中D G A T的生物功能与高等植物中D G A T的功能可能存在差别.
2.2㊀基因和蛋白质结构分析
１)蛋白质跨膜域分析.从N C B I及P h y t oＧz o m e数据库中得到５种微藻和２７种高等植物的蛋白质序列,通过跨膜预测服务器T MHMMＧ２．０和S MA R T数据库来分析其蛋白质结构,结果如图２所示.可以看出不同D G A T类型有明显的结构模式的区分.其中,大部分高等植物的D G A T１都有８~９个跨膜域,而团藻和莱茵衣藻的D G A T１跨膜域只有５个和３个,系统发育分析中团藻和莱茵衣藻的D G A T１与D G A T２亲缘关系较近,而大多数植物的D G A T２的跨膜域数量在１~４个,与系统发育树结果一致.三角褐指藻的D G A T２有２~４个跨膜域,莱茵衣藻有２~３个跨膜域,微拟球藻及团藻的D G A T２的跨膜域数量分别为１个和２个,与其他高等植物跨膜域数量相差不大,系统发育树提示的这４种微藻与其他高等植物进化路线不同这一点没有从跨膜域数量上体现出来.微藻及高等植物的D G A T３均未检测到跨膜域.有趣的是,一些与拟南芥同源的W S/D G A T蛋白质序列有２到３个跨膜区,其他则没有.微藻中D G A T跨膜域的分析结果与系统发育树得到的结果基本一致,显示出微藻与其他高等植物相比经历了不同的进化过程,而４种D G A T类型也经历了不同的进化过程.２)基因结构分析.将从N C B I及P h y t o z o m e数据库中得到的４种D G A T类型的编码区序列及对应的基因组序列,通过G S D S服务器分析微藻及其他高等植物D G A T的基因结构,结果如图３所示,分析可知不同D G A T的基因结构有明显的区别.微藻及高等植物的D G A T１的内含子较多,数量在７~１５个,其中变异型小球藻㊁团藻及莱茵衣藻的内含子为７~８个,明显低于其他高等植物,这也与我们通过系统发育树所得到的微藻有独立分支的结果相符.团藻的D G A T２有６个内含子,莱茵衣藻２个不同种的D G A T２分别有８个和１２个内含子,大多数高等植物的内含子为８个.提示我们不仅微藻的内含子与其他高等植物不同,同一种微藻的D G A T也有不同的内含子数量.本研究中除了团藻含有３个内含子,大多物种的D G A T３基因含有１个内含子,表明在植物进化过程中内含子发生了获得/缺失事件.大多数物种的W S/D G A T基因有６个内含子.４种D G A T中微藻与其他高等植物内含子差异较大,提示我们在进化过程中微藻及高等植物发生了不同程度的分化.内含子的缺失和获得是D G A T基因进化的模式,通过分析４种D G A T 的内含子数量似乎进一步验证了系统发育树得出的结果,随着微藻及高等植物分化的进行,先分化出的D G A T３内含子数量最少,W S/D G A T其次,
D G A T１和D G A T２数量差距不大.
2.3㊀正选择位点检验
１)位点特异模型.通过P AM L软件包,采用M０(单一ω)㊁M１a(近中性)㊁M２a(正选择)㊁M３(离散)㊁M７(β)㊁及M８(β&ω)６个模型分析的结果如表２所示.４种D G A T类型中只有D G A T２和W S/D G A T的M８模型中发现ω＞１的正选择位点,大部分位点在进化过程中受到负选择作用.其中,D G A T２中M８模型的４M及５A检测到可能存在正选择位点,经过L R T检验对M８与M７进行比
３３
㊀㊀华中农业大学学报第３７卷
㊀
㊀a,b,c分别为微藻在D G A T１㊁D G A T２及D G A T３的分支.a,b,c a r e t h eb r a n c h e so fD G A T１,D G A T２,a n dD G A T３o fm i c r o a l g a e, r e s p e c t i v e l y．
图１㊀植物中D G A T１㊁D G A T２㊁D G A T３及W S/D G A T蛋白质序列的进化树
F i g．１㊀P h y l o g e n e t i c r e l a t i o n s h i p a m o n gp l a n t D
G A T１,D G A T２,D G A T３,W S/D G A T p r o t e i n s e q u e n c e
４３
㊀第６期杨㊀晓等:微藻中二酰基甘油酰基转移酶基因(D G A T)结构及进化分析
㊀
图２㊀植物中D G A T１㊁D G A T２㊁D G A T３及W S/D G A T跨膜域的预测
F i g．２㊀P r e d i c t e d t r a n s m e m b r a n c ed o m a i n f o rD
G A T１,D G A T２,D G A T３a n dW S/D G A T f r o m p l a n t s
５３
㊀㊀华中农业大学学报第３７卷
㊀
图３㊀植物中D G A T１㊁D G A T２㊁D G A T３㊁W S/D G A T基因结构的分析
F i g．３㊀T h ea n a l y s i s o f g e n es t r u c t u r e i n D
G A T１,D G A T２,D G A T３,W S/D G A T f r o m p l a n t s
较发现前者显著优于后者,故结果具有一定的可信度.同样,在W S/D G A T中的M８模型中,可能存在５个正选择位点,经过M８与M７的比较得到的结果具有显著性,同样具有较高的可信度.综合D G A T１㊁D G A T２㊁D G A T３及W S/D G A T来看,负选择对D G A T基因的进化起到了重要的作用.２)分支特异模型.在系统发育树(图１)中单独标注微藻分支依次为a㊁b㊁c,由于未找到微藻的W S/D G A T序列,故不对其进行分支特异模型的分析.根据分支特异模型,设置m o d e l＝０,N s i t e＝０与M０模型进行比较,并通过L R T s显著性判断结果的可信度,结果如表３所示,微藻分支用方框单独标注.
由于分支模型中参数较多,所以有可能会导致ω值不精确.然而,该模型的优势在于,缺少序列信息时,估测ω值时不会受到影响.分支特异模型对
６３
㊀第６期杨㊀晓等:微藻中二酰基甘油酰基转移酶基因(D G A T)结构及进化分析㊀
微藻中３种D G A T类型的参数估计如表３所示, D G A T１中微藻分支ω＝０．０８６２６,而其他高等植物分支ω＝０．２７７０４,M０模型总体的ω＝０．０８７０２.
D G A T２中微藻分支和高等植物分支ω分别为０．００５２２和０．１６５５０,M０模型ω＝０．１６３４９.
D G A T３中微藻分支ω＝０．０１１５７,高等植物分支ω＝０．２４５４０,m e d e l＝０时ω＝０．２３８０４.藻类分支与高等植物分支有不同的ω值,且ω＜１,提示我们藻类与其他高等植物有不同的进化过程.通过分析进化过程中的选择压力,微藻与其他高等植物有不同的选择压力,但又差别不大,可以以此来进一步分析D G A T在微藻中的生物功能.
3㊀讨㊀论
本研究通过N C B I和P h y t o z o m e数据库同源性搜索获得微藻中的３种D G A T类型,未发现微藻的W S/D G A T序列,采用最大似然性算法对微藻及高等植物的D G A T构建进化树,得到分支较为明显的
表２㊀位点特异模型对４种D G A T基因的参数估计
T a b l e２㊀P a r a m e t e r e s t i m a t e s f o r t h e f o u r D G A T s g e n e s u n d e r s i t eＧs p e c i f i cm o d e l
基因类型T y p e
模型
M o d e l l n L
参数估计值
E s t i m a t e s o f p a r a m e t e r s
P值
P v a l u e
正向选择位点
P o s i t i v e s i t e s
D G A T１M３－１１５４５．７７９７１０P０＝０．２８０８３P１＝０．６０３９２P２＝０．１１５２６[]
ω０＝０．０４１５０ω１＝０．１７８６９ω２＝０．５１２９５
M０－１１７００．０４０９００N o t a l l o w e d M２a－１１６５０．１７７６７０P０＝０．９０６０９P１＝０．００３６３P２＝０．０９０２８[]
ω０＝０．１４８３５ω１＝１．０００００ω２＝１．０００００
M１a－１１６５０．１７７６７０P０＝０．９０６０９P１＝０．０９３９１N o t a l l o w e d
ω０＝０．１４８３５ω１＝１．０００００
M８－１１５４８．４３５２９０P０＝０．９９３２１P＝１．１４３１５q＝５．２６３９７４M∗∗,５A∗∗
(P１＝０．００６７９)ω＝３．２７８９０
M７－１１５５２．９５４３００P＝１．１１３４３q＝４．８７２２９０．００２６４５N o t a l l o w e d
D G A T２M３－３７９５．０９９４９６P０＝０．３３８２２P１＝０．５３９４７P２＝０．１２２３０[]
ω０＝０．０４３５８ω１＝０．３４６８２ω２＝０．７３５１３
M０－３８５４．７７４４５９ω０＝０．２３８０４N o t a l l o w e d M２a－３８２２．９９０５５４P０＝０．５３７８７P１＝０．０４５８４P２＝０．４１６２９[]
ω０＝０．１３９９６ω１＝１．０００００ω２＝１．０００００
M１a－３８２２．９９０５５４P０＝０．５３７８７P１＝０．４６２１３N o t a l l o w e d
ω０＝０．１３９９６ω１＝１．０００００
M８－３７９６．４３５１９９P０＝０．９９９９９P＝０．６９６９４q＝１．５８３０４
(P１＝０．００００１)ω＝１９．６４８６３
M７－３７９６．４３４０７P＝０．６９６９４q＝１．５８３０４N o t a l l o w e d
D G A T３M３－３７９５．０９９４９６P０＝０．３３８２２P１＝０．５３９４７P２＝０．１２２３０[]
ω０＝０．０４３５８ω１＝０．３４６８２ω２＝０．７３５１３
M０－３８５４．７７４４５９ω０＝０．２３８０４N o t a l l o w e d M２a－３８２２．９９０５５４P０＝０．５３７８７P１＝０．０４５８４P２＝０．４１６２９[]
ω０＝０．１３９９６ω１＝１．０００００ω２＝１．０００００
M１a－３８２２．９９０５５４P０＝０．５３７８７P１＝０．４６２１３N o t a l l o w e d
ω０＝０．１３９９６ω１＝１．０００００
M８－３７９６．４３５１９９P０＝０．９９９９９P＝０．６９６９４q＝１．５８３０４
(P１＝０．００００１)ω＝１９．６４８６３
M７－３７９６．４３４０７０P＝０．６９６９４q＝１．５８３０４N o t a l l o w e d
W S/D G A T M３－１３４５８．５８２２７９P０＝０．５２４７８P１＝０．４７５２２P２＝０．０００００[]
ω０＝０．０９７７５ω１＝０．４２４６０ω２＝７１．０５７０４
M０－１３６１９．２０３９７７ω０＝０．２２８３２N o t a l l o w e d M２a－１３５１０．０１７４１９P０＝０．８２２０８P１＝０．１６１１５P２＝０．０１６７７[]
ω０＝０．１８８８９ω１＝１．０００００ω２＝１．０００００
M１a－１３５１０．０１７４１９P０＝０．８２２０８P１＝０．１７７９２N o t a l l o w e d
ω０＝０．１８８８９ω１＝１．０００００
M８－１３４４３．１３３３３１P０＝０．９５１７４P＝１．０７７０７q＝３．４４０９２
２E∗∗,１６６E∗∗,
１９７S∗∗,２６４T∗∗,
４１５A∗∗
(P１＝０．０４８２６)ω＝１．００００００．００８３７４
M７－１３４４６．６０９１９８P＝０．９３２７０q＝２．５１７８７N o t a l l o w e d
㊀注:在９５％和９９％后验概率下推测出的正选择位点分别用∗和∗∗标出.N o t e:T h e p o s i t i v e l y s e l e c t e ds i t e sw e r e i n∗a n d∗∗u n d e r ９５％a n d９９％p o s t e r i o r p r o b a b i l i t y v a l u e s,r e s p e c t i v e l y．
７３
㊀㊀华中农业大学学报
第３７卷㊀
表３㊀分支特异模型对４种D G A T 类型的参数估计
T a b l e ３㊀P a r a m e t e r e s t i m a t e s f o r t h e D G A T g e n e s u n d e r b r a n c h Ｇs p
e c i
f i cm o d e l 类型
T y p e 模型
M o d e l l n L 参数估计值
E s t i m a t e s o f p a r a m e t e r s
P 值
P v a l u e
D G A T １M o d e l ２－７４３３．８００７５６ω１＝０．０８６２６
ω２＝０．２７７０４
０．３９２５５９２４２M o d e l ０－７４３４．１６６２５６
ω＝０．０８７０２
D G A T ２M o d e l ２－１１６９８．０４４０７０ω１＝０．１６５５０ω２＝０．００５２２０．０４５６７２０８１M o d e l ０－１１７００．０４０９００ω＝０．１６３４９
D G A T ３
M o d e l ２－３８５２．０４０８１８ω１＝０．２４５４０ω２＝０．０１１５７
０．０１９３７５７３６
M o d e l ０
－３８５４．７７４４５９ω＝０．２３８０４㊀注:黑框内为微藻分支数据.N o t e :T h em i c r o a l g a e b r a n c hd a t am a r k e db y b
l a c kb o x ．拓扑结构.小球藻的D G A T １单独成支,
与其他高等植物的D G A T １有共同起源,与T u r c h e t t o －Z o Ｇl e t 等[１
４]
研究结果一致.团藻及莱茵衣藻的D G A T １与D G A T ２亲缘关系较近.团藻㊁
莱茵衣藻㊁微拟球藻及三角褐指藻的D G A T ２亲缘关系较近且有独立的分支,与其他高等植物有共同起源,郝
敬云等[２５]
通过构建系统发育树对莱茵衣藻D G A T
蛋白进行鉴定和分析,莱茵衣藻D G A T ２与三角褐指藻D G A T ２亲缘关系非常近且与其他高等植物有共同起源,与本研究结果一致.团藻和莱茵衣藻的D G A T ３同样观察到独立分支,提示我们微藻与高等植物有独立的进化路线.
在微藻的D G A T 的蛋白质结构分析中,
除了D G A T ３中未发现跨膜域外,其他３种D G A T 的蛋
白质结构均呈现出与系统发育分析一致的结果,即团藻㊁莱茵衣藻㊁微拟球藻㊁小球藻及三角褐指藻的跨膜域数量与其他高等植物有较大差别.在基因结构分析中,微藻中不同D G A T 类型内含子数目有较大差异,同时微藻与其他高等植物同一种D G A T 类
型中内含子数目也有一定差异.郭宁等[２６]在对棉
花与模式植物D G A T １基因的聚类与基因结构分析中发现,莱茵衣藻的D G A T １内含子数量与棉花等高等植物内含子数量有较大差距.通过系统发育树得知的最先分化出的D G A T ３的内含子数量最少,随着分化的进行,内含子数量逐渐增多.
在利用不同模型分析D G A T 不同位点及不同
分支的选择压力中,通过位点模型观察到D G A T ２及W S /D G A T 均在M ８模型下发现较少的正选择位点,且通过L R T 检验发现结果可信度较高,提示我们４种D G A T 类型在进化过程中受到较强的负选择作用.通过分支模型发现藻类与其他高等植物的ω值不同,
说明微藻和高等植物有不同的进化过程.通过环境选择等因素造就了微藻与其他高等植物不同的D G A T 结构和进化,而D G A T 又是合成
三酰基甘油的最后一步,这为后续微藻产油脂基因工程改造提供了理论依据,为陶高微藻油脂提供了可能的策略.
参考文献
[１]㊀翟映雪,梁成伟,张伟,等．微藻油脂的研究进展[J ]．食品工业科技,２０１４,３５(１７):３７０Ｇ３７４．
[２]㊀S H A RMAKK ,S C HUHMA N N H ,S C H E N KP M ,e t a l ．H i g
h l i p i d i n d u c t i o n i nm i c r o a l g a e f o r b i o d i e s e l p r o d u c t i o n [J ]．E n g
e r Ｇg
i e s ,２０１２,５(５):１５３２Ｇ１５５３．[３]㊀W L J F F E L SR H ,B A R B O S A M J ．A no u t l o o ko n m i c r o a l g a l b i o f u e l s [J ]．S c i e n c e ,２０１０,３２９(５９９３):７９６Ｇ７９９．
[４]㊀C H I S T I Y．B i o d i e s e l f r o m m i c r o a l g a e [J ]．B i o t e c h n o l o g y a d Ｇv a n c e s ,２００７,２５(３):２９４Ｇ３０６．
[５]㊀T R A N N H ,B A R T L E T TJR ,K A N N A N G A R A GSK ,e t a l ．
C a t a l y t i c u p g r a d i n g o f b i o r e f i n e r y o i l f r o m m i c r o a l g a e [J ]．F u e l ,２０１０,８９(２):２６５Ｇ２７４．
[６]㊀B R OW NAC ,K N I G H T SBA ,C O NW A Y E ．H y
d r o c a r b o n c o n t
e n t a n d i t s r e l a t i o n s h i p t o p h y s i o l o g i c a l s t a t e i n g r e e n a l g a e B o t r y
o c o c Ｇc u s b r a u n i i [J ]．P h y t o c h e m i s t r y
,１９６９,８(３):５４３Ｇ５４７．[７]㊀X I A O Y ,Z H A N GJ ,C U I J ,e t a l．M e t a b o l i c p r o f i l e s o f N a n n o Ｇ
c h l o r o p
s i s o c e a n i c I M E T １u n d e r n i t r o g e n Ｇd e f i c i e n c y s t r e s s [J ]．B i o r e s o u r c eT e c h n o l ,２０１３,１３０:７３１Ｇ７３８．
[８]㊀MO H E I MA N IN ,R B O R OW I T Z K A M A．T h e l o n g
Ｇt e r mc u l Ｇt u r eo f t h e c o c c o l i t h o p h o r e P l e u r o c h r y s i s c a r t e r a e (H a p t o p h y Ｇt a )i n o u t d o o r r a c e w a y p o n d s [J ]．J o u r n a l o f a p p l i e d p h y c o l o g y ,２００６,１８(６):７０３Ｇ７１２．
[９]㊀C H I USY ,K A OCY ,T S A IM T ,e t a l ．L i p
i d a c c u m u l a t i o n a n d C O ２u t i l i z a t i o no f N a n n c h l o r o p
s i s o c u l a t a i nr e s p o n s e t oC O ２a e r a t i o n [J ]．B i o r e s o u r c e t e c h n o l o g y ,２００９,１００:８３３Ｇ８３８．[１０]WA N GD M ,N I N GK ,L I J ,e t a l ．N a n n o c h l o r o p
s i s g e n o m e s r e Ｇv e a l e v o l u t i o no fm i c r o a l g a l o l e a g
i n o u s t r a i t s [J ]．P L o S g e n e t Ｇi c s ,２０１４,１０(１):２Ｇ１３．
[１１
]张晓舟．莱茵衣藻高产油脂藻株的诱变筛选及其油脂代谢关键酶基因的转录分析[D ]．青岛:中国海洋大学,２０１３．
[１２]L O C K Y Y ,S N Y D E R CL ,Z HU W ,e t a l ．A n t i s e n s es u p p
r e s Ｇs i o no f t y p e１d i a c y l g l y c e r o la c y l t r a n s f e r a s ea d v e r s e l y a f f e c t s p l a n t d e v e l o p m e n t i n B r a s s i c an a p
u s [J ]．P h y s i o lP l a n t ,２００９,１３７(１):６１Ｇ７１．
[１３]L A R D I Z A B A L K ,E F F E R T ZR ,L E V E R I N G C ,e t a l ．E x p
r e s Ｇ８
３
㊀第６期杨㊀晓等:微藻中二酰基甘油酰基转移酶基因(D G A T)结构及进化分析㊀
s i o no f Um b e l o p s i s r a m a n n i a n aD G A T２Ai n s e e d i n c r e a s e s o i l
i ns o y b e a n[J]．P l a n tP h y s i o l,１４８(１):８９Ｇ９６．
[１４]T U R C H E T T OＧZ O L E TAC,MA R A S C H I NFS,D E MO R A I S GL,e ta l．E v o l u t i o n a r y v i e w o fa c y lＧC o A d i a c y l g l y c e r o la c y lＧt r a n s f e r a s e(D G A T),ak e y e n z y m e i nn e u t r a l l i p i db i o s y n t h eＧs i s[J]．B i o M e d c e n t r a l a c a d e m i c e v o l u t i o n a r y b i o l o g y,２０１１,１１:
h t t p://w w w．b i o m e d c e n t r a l．c o m/１４７r２１４８/１１/２６３．[１５]F E IX,L IP,L IX,e t a l．L o wＧt e m p e r a t u r eＧa n d p h o s p h a t ed e f iＧ
c i e n c yＧr e s p o n s i v e e l e m e n t s c o n t r o l D G A T３e x p r e s s i o n i n
C h l a m y d o m o n a s r e i n h a r d t i i[J]．J o u r n a l o f e u k a r y o t i cm i c r o b iＧ
o l o g y,２０１７,１３:２１４Ｇ２３８．
[１６]W E IH,S H IY,MA X,e t a l．At y p eＧI d i a c y l g l y c e r o l a c y l t r a n sＧ
f e r a s e m o d u l a t e st r i a c y l
g l y c e r o lb i o s y n t
h e s
i s a n df a t t y a c i d
c o m p o s i t i o n i n t h e o l e a g i n o u sm i c r o a l g a,N a n n o c h l o r o p s i s o c eＧa n i c a[J]．B i o t e c h n o l B i o f u e l s,２０１７,５(１０):１７４Ｇ１８４．
[１７]K UMA RS,S T E C H E R G,T AMU R A K．M o l e c u l a re v o l u t i o nＧ
a r yg e n e t i c s a n a l y s i s(M E G A)V e r s i o n７．０f o r
b i g g e r d a t a s e t s
[J]．M o l e c u l a r b i o l o g y a n d e v o l u t i o n,２０１６,３３(７):１８７０Ｇ１８７４．[１８]HU B,J I NJP,G U O A Y,e t a l．G S D S２．０:a nu p g r a d e d g e n e
f e a t u r ev i s u a l i z a t i o ns e r v e r[J]．B i o i n f o r m a t i c s,２０１５,３１(８):
１２９６Ｇ１２９７．[１９]L E T U N I CI,C O P L E Y R R,S C HM I D TS,e t a l．S MA R T４．０: t o w a r d s g e n o m i c d a t a i n t e g r a t i o n[J]．N u c l e i cA c i d sR e s,２００４,３２(１):１４２Ｇ１４４．
[２０]Y A N GZ．P AM L:a p r o g r a m p a c k a g e f o r p h y l o g e n e t i ca n a l y s i s
b y m a x i m u ml i k e l i h o o d[J]．C o m p u t e ra p p l i
c a t i o n s i nt h eb i oＧ
s c i e n c e s,１９９７,１３:５５５Ｇ５５６．
[２１]陈洁,张丽君,王艇．蕨类植物r b c l基因正选择和负选择位点的鉴定[J]．西北植物学报,２００９,２９(１２):２３９１Ｇ２４００．
[２２]Y A N GZ,B I E L AW S K I JP．S t a t i s t i cm e t h o d f o r d e t e c t i n g m oＧl e c u l a r a d a p t a t i o n[J]．T r e n d s e c o l o g y e v o l u t i o n,２０００,１５(１２):４９６Ｇ５０３．
[２３]梁成伟,程江峰,苏忠亮,等．八氢番茄红素脱氢酶(P D S)基因分子进化特征[J]．青岛科技大学学报(自然科学报),２００９,３０(５):４０８Ｇ４１１．
[２４]李丽莎,李祥龙,周荣艳,等．酪氨酸相关蛋白酶１基因编码区系统发育分析和正选择位点检测[J]中国畜牧兽医,２０１５,４２(９):２４２７Ｇ２４３５．
[２５]郝敬云,周广航,邵雪梅,等．莱茵衣藻D G A T２基因家族的鉴定与功能分析[J]．分子植物育种,２０１６,１４(９):２３４３Ｇ２３５２．[２６]郭宁,胡利宗,解恒昌,等．棉花与模式植物D G A T１基因的鉴定与比较分析[J]．广东农业科学,２０１５,１５:９８Ｇ１０４．
S t r u c t u r e a n d e v o l u t i o no f d i a c y l g l y c e r o l a c y l t r a n s f e r a s e
(D G A T)i nm i c r o a l g a e
Y A N G X i a o㊀L I A N GC h e n g w e i
C o l l e g e o f M a r i n eS c i e n c e a n dB i o l o g i c a lE n g i n e e r i n g,Q i n g d a oU n i v e r s i t y
o f S c i e n c e a n dT e c h n o l o g y,Q i n g d a o２６６０４２,C h i n a
A b s t r a c t㊀M i c r o a l g a e i s t h e t h i r d g e n e r a t i o no f p o t e n t i a l b i oＧe n e r g y r e s o u r c e s,a n dt h e p r e s e n c eo f g r e a s e i nm i c r o a l g a e i sm a i n l y t r i a c y l g l y c e r o l．D i a c y l g l y c e r o l a c y l t r a n s f e r a s e(D G A T)i s a k e y r a t eＧl i m i tＧi n g e n z y m e i n t h e c o n t r o l o fT A Gs y n t h e s i s．D G A T i sd i v i d e d i n t o D G A T１,D G A T２,D G A T３a n d W S/ D G A T．T h e D G A T o fm i c r o a l g a e a n dh i g h e r p l a n t sw a s o b t a i n e d f r o mt h e d a t a b a s e．T h e d i v e r s i t y a n d eＧv o l u t i o no f t h e f o u r D G A T t y p e s a n d g e n e a n d p r o t e i n s t r u c t u r e sw a s a n a l y z e dw i t h p h y l o g e n e t i cm e t hＧo d s．I no r d e r t o f u r t h e r a n a l y z e t h e e v o l u t i o n o f D G A T i nm i c r o a l g a e,t h e p o s i t i v e s e l e c t i o n s i t e sw e r e s eＧl e c t e d t o e s t i m a t e t h e s e l e c t i o n p r e s s u r e i n t h e e v o l u t i o n a r y p r o c e s s．R e s u l t s h o w e d t h a t t h e g e n e t i c s t r u cＧt u r e a n d p r o t e i ns t r u c t u r eo fd i f f e r e n t D G A T t y p e s i n m i c r o a l g a ew e r ed i f f e r e n t．I nt h es a m e D G A T t y p e,t h e g e n es t r u c t u r ea n d p r o t e i ns t r u c t u r eo f m i c r o a l g a e w a sd i f f e r e n tf r o m t h a to fo t h e rh i g h e r p l a n t s．I tw a s f o u n dt h a tm i c r o a l g a ed i dh a v ed i f f e r e n t e v o l u t i o n a r yp r o c e s s e sw i t ho t h e rh i g h e r p l a n t s．T h e r ew a s a p o s i t i v es e l e c t i o ns i t e so f D G A T２a n d W S/D G A T．T h e p o s i t i v es e l e c t i o ns i t e so f D G A T１a n d D G A T３w e r en o t f o u n d．I tw i l l h e l p u s t od e c i p h e r i t s f u n c t i o n a l r o l e i n p l a n t s a n d p r o m o t e t h e r eＧs e a r c ho f r e n e w a b l e e n e r g y．
K e y w o r d s㊀m i c r o a l g a e;d i a c y l g l y c e r o l a c y l t r a n s f e r a s e;g e n e s t r u c t u r e;p o s i t i v e s e l e c t i o ns i t e;p h yＧl o g e n y
(责任编辑:张志钰)
９３。