日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶基因及其DNA疫苗[发明专利]

(10)申请公布号 CN 102392031 A (43)申请公布日 2012.03.28
C N 102392031 A
*CN102392031A*
(21)申请号 201110333898.0(22)申请日 2011.10.28
C12N 15/53(2006.01)C12N 9/02(2006.01)C12N 15/63(2006.01)A61K 48/00(2006.01)A61K 39/00(2006.01)A61P 33/12(2006.01)C12N 5/10(2006.01)C12N 1/21(2006.01)
(71)申请人中国农业科学院上海兽医研究所
地址200241 上海市闵行区紫月路518号(72)发明人傅志强 林矫矫 曹燕 韩艳辉
赵彬 石耀军 张娟 吴秀娟洪炀 艾德宙 朱珠(74)专利代理机构上海大邦律师事务所 31252
代理人
周东萍(54)发明名称
日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶基因及其DNA 疫苗(57)摘要
本发明公开了一种日本血吸虫基因，该基因为编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶基因。

本发明还公开了该基因在制备预防或治疗血吸虫病的疫苗中的应用。

本发明日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶基因的DNA 疫苗对血吸虫病有很好的免疫预防效果，适于成为抗血吸虫病的新疫苗。

(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
权利要求书 1 页 说明书 10 页 附图 1 页
1.一种日本血吸虫基因，其特征在于，所述基因为编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶基因。

2.根据权利要求1所述的日本血吸虫基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列为SEQ IDNO.2所示的DNA序列。

3.一种日本血吸虫蛋白质，其特征在于，所述蛋白质具有硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶活性，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求1所述的日本血吸虫基因。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，该重组载体的空载体为pVAX1质粒。

6.一种抗血吸虫疫苗，其特征在于，包含权利要求4或5所述重组载体。

7.一种宿主细胞，其特征在于，包含权利要求4或5所述的重组载体。

8.权利要求1所述日本血吸虫基因在制备预防或治疗血吸虫病的疫苗中的应用。

日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶基因及其DNA疫苗
技术领域
[0001] 本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶基因(简称SjTGR基因)及其DNA疫苗。

背景技术
[0002] 血吸虫病是一种人和动物都会受传染的寄生虫病，血吸虫发育的不同阶段，尾蚴、童虫、成虫和虫卵均可对宿主引起不同的损害和复杂的免疫病理反应，流行范围广，对人和家畜均产生严重危害。

目前，主要采用药物，例如吡喹酮，对已经感染血吸虫病的人或动物进行治疗，但是这不能解决再次感染的问题。

要想更有效的防治血吸虫病，比较可行的措施是采用疫苗与药物治疗相结合的方式。

因此，研制新的抗血吸虫病疫苗仍是当今血吸虫病防治研究的重点之一。

[0003] 硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶是血吸虫体内一种特殊的氧化还原酶类，对保护血吸虫不受宿主免疫系统和自身新陈代谢而产生的游离氧的损害具有重要作用。

目前尚没有关于日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶基因及其DNA疫苗的相关报道。

发明内容
[0004] 本发明要解决的技术问题是提供一种日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶基因(SjTGR基因)，该SjTGR基因可用于制备抗血吸虫的DNA疫苗，免疫保护效果显著。

[0005] 为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：
[0006] 在本发明的一个方面，提供了一种日本血吸虫基因，所述基因为编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶基因。

[0007] 优选的，所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示的DNA序列。

[0008] 在本发明的另一方面，提供了一种日本血吸虫蛋白质，所述蛋白质具有硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶活性，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0009] 在本发明的另一方面，还提供了一种包含上述日本血吸虫基因的重组载体。

[0010] 优选的，所述重组载体的空载体为pVAX1质粒。

[0011] 在本发明的另一方面，还提供了一种包含上述重组载体的抗血吸虫疫苗。

[0012] 优选的，该抗血吸虫疫苗为包被有金颗粒的SjTGR-pVAX1 DNA疫苗。

[0013] 在本发明的另一方面，还提供了一种包含上述重组载体宿主细胞。

[0014] 在本发明的另一方面，还提供了一种上述日本血吸虫基因在制备预防或治疗血吸虫病的疫苗中的应用。

[0015] 利用本发明日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶SjTGR基因制备的DNA疫苗，在小鼠免疫保护性实验中，使免疫组小鼠的减虫率与肝脏减卵率分别达到38.82％和44.51％(与pVAX1空载体对照组相比)，表明本发明SjTGR基因的DNA疫苗对血吸虫病有很好的免疫预防效果，能有效降低宿主体内虫体数目，更重要的是肝脏内虫卵数目的减少可以大大降低宿主肝脏的病理反应。

附图说明
[0016] 下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

[0017] 图1是本发明实施例1日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶SjTGR-pVAX1重组质粒双酶切鉴定图；
[0018] 图2是本发明实施例1日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶SjTGR-pVAX1重组质粒PCR鉴定图。

具体实施方式
[0019] 下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础，等译.第3版，北京：科学出版社，2002)中所述的方法进行。

[0020] 本发明利用PCR从日本血吸虫(中国大陆株)成虫cDNA中扩增到获得的日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶SjTGR的基因序列。

进一步利用BamHI和XhoI将SjTGR 基因克隆至真核表达质粒pVAX1中，构建了SjTGR-pVAX1 DNA疫苗，在大肠杆菌中大量扩增后，用试剂盒提取纯化得到免疫用的重组SjTGR-pVAX1质粒，并用金颗粒包被该重组DNA质粒制备免疫用子弹。

在小鼠腹部剃毛后用基因枪轰击制备的子弹以免疫小鼠，3周后加强免疫一次，2周后攻击日本血吸虫尾蚴，攻击后6周剖杀小鼠，门静脉灌洗收集成虫，肝脏用KOH消化后计算每克肝组织所荷虫卵数。

结果表明本发明SjTGR基因的DNA疫苗对血吸虫病有很好的免疫预防效果。

[0021] 实施例1日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶SjTGR基因的克隆和SjTGR-pVAX1重组质粒的构建
[0022] 1.1实验动物雄性新西兰白兔，2.5kg～3kg，购自上海罗泾飞达实验动物养殖场。

[0023] 1.2日本血吸虫(中国大陆株)成虫日本血吸虫尾蚴由中国农科院上海兽医研究所钉螺室提供。

新西兰白兔分别以腹部贴片法感染2000条血吸虫尾蚴，感染后42天解剖，以胸主动脉灌注法从肝门静脉收集日本血吸虫成虫，用无菌PBS充分洗涤虫体，去除来自宿主的粘附物质。

冲洗好的血吸虫成虫在液氮中冻存备用。

[0024] 1.3菌种、质粒及主要试剂购自Promega公司。

TRIzol试剂盒、RNA酶抑制剂、大肠杆菌DH5α、T载体、pVAX1、DNA胶回收纯化试剂盒、限制性内切酶等购自上海申能博彩生物科技有限公司、Invitrogen公司、TaKaRa公司、赛百盛基因技术有限公司等。

[0025] 1.4引物
[0026] 上游特异性引物：5′-CGCGGATCCATGCCTCCGATTGAT-3′，(SEQ ID NO：3，下划线为BamHI酶切位点)
[0027] 下游特异性引物：5′-GCCTCGAGTCAGCAACCGGTTACC-3′，(SEQ ID NO：4，下划线处为XhoI酶切位点)
[0028] 引物均由上海赛百盛生物技术有限公司合成。

[0029] 2.方法
[0030] 2.1日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶SJTGR基因克隆
[0031] 2.1.1总RNA提取取液氮中冻存的日本血吸虫成虫，按TRIzol试剂盒说明书进行
总RNA的提取。

将RNA溶解于H
O(RNase free)。

总RNA溶液立即用于下步实验或于-80℃
2
冻存。

[0032] 2.1.2RT-PCR扩增硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶SJTGR基因
[0033] 应用TaKaRa公司的One Step RNA PCR Kit进行一步法RT-PCR扩增日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶SjTGR基因，方法根据说明书，具体如下：
[0034] 按下列组成在冰上配制RT-PCR反应液
[0035]
[0036] 按以下程序进行RT-PCR反应：
[0037]
[0038] 反应结束后，取PCR反应液进行1％琼脂糖凝胶电泳。

并应用申能博彩公司的3S Spin DNA琼脂糖胶纯化试剂盒纯化、回收PCR产物，送上海奥科生物技术有限公司测序。

[0039] 结果：利用RT-PCR扩增到了日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶SjTGR基因序列(如SEQ ID NO：2所示)，核苷酸测序结果显示，该序列含有完整的ORF，经与曼氏血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶基因序列同源性分析表明，成功获得能编码完整日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶SJTGR蛋白(如SEQ ID NO：1所示)的基因克隆。

[0040] 2.2SjTGR-pVAX1DNA疫苗的构建
[0041] 2.2.1SjTGR基因片段、质粒pVAX1的酶切和纯化：
[0042] 分别取回收的SjTGR基因片段、质粒pVAX1用限制性内切酶BamH I、Xho I进行酶切反应。

按下列组分配制酶切反应体系：
[0043]
溶液组分体积(μl)
O 8
ddH
2
10×H缓冲液 2
SjTGR基因片段或质粒pVAX 1 8
BamH I 1
Xho I 1
总体积 20
[0044] 37℃孵育2小时。

结束后用申能博彩3S DNA胶纯化试剂盒V3.1纯化目的片段(方法同上)。

将纯化得到的DNA片段立即进行连接。

[0045] 2.2.2酶切SjTGR基因片段与pVAX1载体的连接和转化：
[0046] 按下述反应体系在16℃连接1小时，将酶切日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶SjTGR基因片段插入pVAX1载体中：
[0047]
溶液组分体积(μl)
ddH2O 3.5
10×连接缓冲液 1
双酶切pVAX1 1.5
双酶切SjTGR基因片段 3
T4DNA连接酶 1
总体积 10
[0048] 将连接产物转化大肠杆菌DH5α。

取200μl含SjTGR-pVAX1/DH5α菌液涂于含卡那霉素(KANA)LB琼脂平板培养基，37℃倒置培养12小时(方法同上)。

[0049] 2.2.3重组质粒SjTGR-pVAX1的鉴定：
[0050] 从过夜培养的平板上，选择菌落形态圆整、微隆起的克隆至含KANA的LB培养液(4ml)，37℃摇床培养过夜。

次日，抽提重组质粒SjTGR-pVAX1进行酶切鉴定(鉴定结果见图1，在图1中，M：DNA marker DL5000，1：SjTGR-pVAX1重组质粒BamH I、Xho I双酶切)。

[0051] 将抽提的重组质粒SjTGR-pVAX1进行PCR鉴定(鉴定结果见图2，在图2中，M：DNA markerDL2000，1：SjTGR-pVAX1重组质粒PCR产物)。

[0052] 将鉴定正确的阳性克隆送上海奥科生物技术公司测序鉴定。

[0053] 结果：重组质粒通过酶切鉴定、核苷酸序列测定，表明插入的目的基因片段长度、插入方向及读码框均正确无误。

[0054] 2.2.4.重组质粒SjTGR-pVAX1的大量扩增和纯化
[0055] 取3ml SjTGR-pVAX1/DH5α菌液接种于300ml含Kana的LB中，37℃振荡培养约18h，4℃离心收集细菌。

按Qiagen Plasmid Maxi Kit方法提取纯化免疫用的重组SjTGR-pVAX1质粒。

[0056] 实施例2重组质粒SjTGR-pVAX1在小鼠日本血吸虫病模型中的免疫保护效果评估[0057] 1.材料
[0058] 5～6周龄雄性BALB/c小鼠购自复旦大学实验动物科学部。

中国大陆株日本血吸虫尾蚴由中国农业科学院上海兽医研究所钉螺室提供。

[0059] 基因枪有关试剂和设备均购自bio-rad公司，操作也根据其说明书进行。

其它试剂同前述。

[0060] 2.DNA疫苗制备和免疫方法
[0061] (1)首先确定金属微粒载体的量(MLQ)为0.5mg/子弹，以及DNA的上样量比例(DLR)为5μg/mg金粉。

[0062] (2)将DNA包被到金属微粒载体上。

[0063] 1)取浓度为20mg/ml的PVP(Polyvinylpyrrolidone，聚乙烯吡咯酮)/乙醇储存液，用乙醇稀释到0.05mg/ml)；
[0064] 2)在1.5ml离心管中称入25mg金粉，在金粉中加入100μl 0.05M的亚精胺，涡旋混匀，在超声仪中超声3-5秒打碎金粉块；
[0065] 3)根据DNA的上样比例在金粉和亚精胺的混合物中加入适量体积的DNA，涡旋3-5秒混匀，在可调速度的混匀器上调至中等速度，滴入100μl 1M CaCl
，室温下沉淀10分钟，
2
去除上清液；
[0066] 4)用无水乙醇清洗三次，每次1ml，离心5秒，最后一次洗涤后将离心沉淀重悬于PVP乙醇溶液中，达到所需的MLQ量。

[0067] (3)使用制管装置将包被好的金粉加入管道中
[0068] 1)将制管装置连接到氮气源上，抽出管道中的乙醇；
[0069] 2)剪下一段(约75cm)用于做子弹的Gold-Coat tubing管子，插入O型密封圈，约1cm；
[0070] 3)打开氮气，通气干燥至少15分钟，取出管子，迅速将金粉悬液吸入管中，立即将管子放于水平位置，插入制管装置中，静置3～5分钟，抽出乙醇，静置3～4秒，然后一边转动一边吹干。

[0071] (4)用切管器将包被了DNA和金粉的管子切成一个个子弹
[0072] 1)检查管子确定金粉均匀涂布在管道内，用剪刀剪去两端或中间没有涂布到金粉或金粉凝结成块的区段；
[0073] 2)用切管器切子弹；
[0074] 3)盖紧瓶盖，做好标记，封上封口膜保存于4℃。

[0075] (5)免疫方法
[0076] 1)将子弹上入弹夹，放入基因枪中相应的位置；
[0077] 2)保定动物，腹部向上，完全暴露剃毛区域；
[0078] 3)对准小鼠腹部皮肤，按住安全锁扣动扳机射击。

[0079] (6)小鼠免疫保护试验
[0080] 将小鼠随机分组，试验SjTGR-pVAX1DNA疫苗免疫组、pVAX1空载体对照组、空白对照组三组。

首次免疫后间隔3周加强免疫一次。

末次免疫2周后，每只小鼠用腹部盖玻片法感染尾蚴40±2条。

攻击尾蚴后6周，解剖小鼠，肝门静脉冲洗法收集成虫记数，同时收集每只小鼠的肝脏。

称取全肝组织重量，剪碎后加5％KOH 20ml，组织匀浆器匀浆，置50℃水浴消化1h，定容至50ml，混匀，按1：50稀释，并吸取100μl的悬液4份，镜检计数肝组织虫卵，最后换算成平均每克肝组织中所负荷虫卵数(EPG)。

按以下公式计算减虫率、肝脏减卵率：
[0081]
[0082]
[0083] 免疫保护结果见下表1：和pVAX1空载体对照组相比，pVAX1-SjTGR DNA疫苗在小鼠中诱导了38.82％的减虫率和44.51％的减卵率，与空白对照组相比，pVAX1-SjTGR DNA 疫苗在小鼠中诱导了41.62％的减虫率和49.46％的减卵率，差异极显著(P＜0.01)。

[0084] 表1：SjTGR pVAX1在小鼠中诱导的减虫、减卵率
[0085]
[0086] 以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。

应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

[0087] 序列表
[0088] <110>中国农业科学院上海兽医研究所
[0089] <120>日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶基因及其DNA疫苗
[0090] <160>4
[0091] <170>PatentIn version 3.3
[0092] <210>1
[0093] <211>596
[0094] <212>PRT
[0095] <213>Schistosoma japonicum
[0096] <400>1
[0097] Met Pro Pro Ile Asp Gly Thr Ser Gln Trp Leu Gln Arg Thr Ile Glu [0098] 1 5 10 15 [0099] Ser Ala Ala Val Ile Val Phe Ser Lys Thr Thr Cys Pro Tyr Cys Lys [0100] 20 25 30 [0101] Lys Leu Lys Asp Val Leu Ala Glu Ala Lys Ile Lys His Ala Thr Ile [0102] 35 40 45
[0103] Glu Leu Asp Gln Leu Ser Asn Gly Ser Val Ile Gln Lys Ala Leu Ser [0104] 50 55 60
[0105] Asn Phe Ser Lys Ile Glu Thr Val Pro Gln Met Phe Val Arg Gly Lys [0106] 65 70 75 80 [0107] Phe Ile Gly Asp Ser Lys Ala Val Leu Asn Tyr His Asn Asn Asn Gln [0108] 85 90 95 [0109] Leu Arg Ala Ile Val Asn Glu Asn Lys Tyr Asp Tyr Asp Leu Ile Ile [0110] 100 105 110 [0111] Ile Gly Gly Gly Ser Gly Gly Leu Ala Ala Gly Lys Glu Ala Ala Lys [0112] 115 120 125
[0113] Tyr Gly Ala Lys Thr Ala Val Leu Asp Tyr Val Glu Pro Thr Pro Met [0114] 130 135 140
[0115] Gly Thr Thr Trp Gly Leu Gly Gly Thr Cys Val Asn Val Gly Cys Ile [0116] 145 150 155 160 [0117] Pro Lys Lys Leu Met His Gln Ala Gly Leu Leu Ser His Ser Leu Glu [0118] 165 170 175 [0119] Asp Ala Gln His Phe Gly Trp Ser Leu Asp Lys Ser Lys Ile Ser His [0120] 180 185 190 [0121] Asp Trp Ser Thr Met Val Glu Gly Val Gln Ser His Ile Gly Ser Leu [0122] 195 200 205
[0123] Asn Trp Gly Tyr Lys Val Ser Leu Arg Asp Asn Ala Val Thr Tyr Leu [0124] 210 215 220
[0125] Asn Ala Arg Gly Met Leu Leu Ser Pro His Glu Val Gln Ile Thr Glu [0126] 225 230 235 240 [0127] Lys Asn Lys Lys Val Ser Thr Ile Thr Gly Asn Lys Ile Ile Leu Ala [0128] 245 250 255 [0129] Thr Gly Glu Arg Pro Lys Tyr Pro Glu Ile Pro Gly Ala Ile Glu Tyr
[0130] 260 265 270 [0131] Gly Ile Thr Ser Asp Asp Leu Phe Ser Leu Pro Tyr Phe Pro Gly Lys [0132] 275 280 285
[0133] Thr Leu Val Val Gly Ala Ser Tyr Val Ala Leu Glu Cys Ala Gly Phe [0134] 290 295 300
[0135] Leu Ala Ser Leu Gly Gly Asp Val Thr Val Met Val Arg Ser Ile Leu [0136] 305 310 315 320 [0137] Leu Arg Gly Phe Asp Gln Gln Met Ala Glu Lys Val Gly Asp Tyr Met [0138] 325 330 335 [0139] Glu Asn His Gly Val Lys Phe Ala Lys Leu Cys Val Pro Asp Glu Ile [0140] 340 345 350 [0141] Thr Gln Leu Lys Pro Val Asp Thr Glu Asn Asn Lys Pro Gly Leu Leu [0142] 355 360 365
[0143] Leu Val Lys Gly His Tyr Thr Asp Gly Lys Lys Phe Glu Glu Glu Phe [0144] 370 375 380
[0145] Glu Ala Val Ile Phe Ala Val Gly Arg Glu Pro Arg Leu Ser Lys Leu [0146] 385 390 395 400 [0147] Asn Cys Glu Ala Val Gly Val Lys Leu Asp Lys Asn Gly Arg Val Val [0148] 405 410 415 [0149] Cys Ser Asp Asp Glu Gln Thr Thr Val Ser Asn Ile Tyr Ala Ile Gly [0150] 420 425 430 [0151] Asp Ile Asn Ala Gly Lys Pro Gln Leu Thr Pro Val Ala Ile His Ala [0152] 435 440 445
[0153] Gly Arg Tyr Leu Ala Arg Arg Leu Phe Ala Gly Ala Thr Glu Leu Thr [0154] 450 455 460
[0155] Asp Tyr Ser Asn Val Ala Thr Thr Val Phe Thr Pro Leu Glu Tyr Gly [0156] 465 470 475 480 [0157] Ala Cys Gly Leu Ser Glu Glu Asp Ala Ile Glu Lys Tyr Gly Asp Asn [0158] 485 490 495 [0159] Asp Ile Glu Val Tyr His Ser His Phe Lys Pro Leu Glu Trp Thr Val [0160] 500 505 510 [0161] Ala His Arg Glu Asp Asn Val Cys Tyr Met Lys Leu Val Cys His Ile [0162] 515 520 525
[0163] Ser Asp Asn Met Arg Val Leu Gly Leu His Val Leu Gly Pro Asn Ala [0164] 530 535 540
[0165] Gly Glu Ile Thr Gln Gly Tyr Ala Val Ala Ile Lys Met Gly Ala Thr [0166] 545 550 555 560 [0167] Lys Glu Asp Phe Asp Arg Thr Ile Gly Ile His Pro Thr Cys Ser Glu [0168] 565 570 575
[0169] Thr Phe Thr Thr Leu His Val Thr Lys Arg Ser Gly Gly Ser Ala Ala [0170] 580 585 590
[0171] Val Thr Gly Cys
[0172] 595
[0173] <210>2
[0174] <211>1791
[0175] <212>DNA
[0176] <213>Schistosoma japonicum
[0177] <400>2
[0178] atgcctccga ttgatggaac atcccagtgg ttgcagagga ctatcgaatc agcggcggta 60 [0179] atcgtcttta gcaaaacaac ttgtccatat tgcaaaaagc taaaggatgt tttagctgaa 120 [0180] gcaaagatta aacacgctac aattgaactg gatcaattat ccaatggttc ggttattcaa 180 [0181] aaggcattat ctaacttctc taaaattgaa acagtcccgc aaatgtttgt tagaggcaag 240 [0182] ttcattggcg attctaaagc agtacttaat taccacaata ataatcaatt gcgggcgatc 300 [0183] gtcaacgaaa ataagtatga ctatgatctg ataatcatcg gtggaggatc tggtggactc 360 [0184] gctgctggaa aggaggcagc caaatacggc gcaaagacag ctgttctgga ttatgtagaa 420 [0185] ccgactccaa tgggtactac ttggggatta ggtggaacct gtgttaacgt tggatgtatc 480 [0186] cctaaaaaat taatgcacca agctggactc ttaagtcatt ctttggaaga tgcccaacat 540 [0187] ttcggttgga gcttggataa atcaaaaatt tcccatgatt ggtcaactat ggttgaagga 600 [0188] gttcagagtc acatcggttc tttaaattgg ggctataaag tttcactaag agataatgcg 660 [0189] gttacgtatc ttaatgctcg tgggatgcta ttaagtcctc atgaggttca gattacagaa 720 [0190] aagaataaaa aagtatccac aataactgga aataaaatca tcttagctac tggcgagcgt 780 [0191] ccaaaatacc cagaaatacc tggagcaatc gaatatggga ttacaagtga tgatttgttt 840 [0192] tccttaccat acttcccggg caaaacactg gtcgttggag cgagctatgt tgcattggaa 900 [0193] tgtgctggtt ttcttgccag tttgggcggt gatgttactg ttatggttcg ttccattttg 960 [0194] cttcgtggtt tcgatcaaca aatggctgag aaggttggcg actatatgga aaatcatgga 1020 [0195] gtcaagttcg caaagttgtg tgtaccagac gagattacac agttgaaacc ggtagatacc 1080 [0196] gagaataaca aacctggact cctgcttgtt aagggtcatt atactgatgg taagaagttt 1140 [0197] gaagaagaat ttgaagcggt cattttcgct gttggtcgtg aaccacgatt atcgaagctt 1200 [0198] aattgtgaag ctgtcggtgt taaactagat aagaatggtc gggttgtatg ctcagatgat 1260 [0199] gaacaaacta cagtcagtaa catttatgcc attggagata taaacgctgg aaaaccacag 1320 [0200] ttaactccag tggctattca tgctggacgt tatttggcta gacggttatt cgctggtgca 1380 [0201] actgaactga ctgactattc caatgttgct acgactgttt tcactccatt agaatatggc 1440 [0202] gcttgtggac tgagtgaaga ggatgcaatt gaaaagtatg gtgataatga tattgaggta 1500 [0203] tatcattcac atttcaaacc tttagaatgg actgttgctc atcgtgaaga taatgtttgt 1560 [0204] tacatgaaac ttgtttgcca tatatctgat aacatgcgtg tactgggtct acatgtttta 1620 [0205] ggacctaatg caggtgaaat aacacagggg tatgcagttg caattaaaat gggtgcaact 1680 [0206] aaagaagatt ttgatcgtac cataggaatt cacccaactt gttctgagac atttacaacg 1740 [0207] ttgcatgtaa ccaagagatc tgggggctct gcagcggtaa ccggttgctg a 1791
[0208] <210>3
[0209] <211>24
[0210] <212>DNA
[0211] <213>人工序列
[0212] <220>
[0213] <221>misc_feature
[0214] <222>(1)..(24)
[0215] <223>引物
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[0219] <223>BamH I酶切位点
[0220] <400>3
[0221] cgcggatcca tgcctccgat tgat 24 [0222] <210>4
[0223] <211>24
[0224] <212>DNA
[0225] <213>人工序列
[0226] <220>
[0227] <221>misc_feature
[0228] <222>(1)..(24)
[0229] <223>引物
[0230] <220>
[0231] <221>misc_signal
[0232] <222>(3)..(8)
[0233] <223>Xho I酶切位点
[0234] <400>4
[0235] gcctcgagtc agcaaccggt tacc 24
图1图2。