小白菜BcUBCE2基因的克隆及表达分析

小白菜BcUBCE2基因的克隆及表达分析
赵瑞丽;钟凤林;林义章;高世超;林俊芳;杨碧云;胡海非
【摘要】采用cDNA-AFLP和RACE技术从小白菜中克隆得到泛素结合酶E2基因(ubiquitin conjugating enzyme E2),命名为BcUBCE2.序列分析表
明,BcUBCE2基因cDNA全长830 bp,包含1个456 bp的开放阅读框,编码152个氨基酸.结构分析发现,该序列包含一个泛素结合酶E2活性位点和一个高度保守的半胱氨酸.进化分析显示,小白菜BcUBCE2蛋白同拟南芥E2蛋白的亲缘关系最近.qRT-PCR分析表明,BcUBCE2基因在小白菜根、茎、叶中均有表达,铜处理10 d时BcUBCE2基因的表达量最高.研究认为,BcUBCE2基因可能在铜胁迫响应中发挥重要作用.
【期刊名称】《西北植物学报》
【年(卷),期】2014(034)001
【总页数】6页(P60-65)
【关键词】小白菜;泛素结合酶E2;RACE;铜胁迫
【作者】赵瑞丽;钟凤林;林义章;高世超;林俊芳;杨碧云;胡海非
【作者单位】福建农林大学园艺学院,福州350002;福建农林大学园艺学院,福州350002;福建农林大学园艺学院,福州350002;福建农林大学园艺学院,福州350002;福建农林大学园艺学院,福州350002;福建农林大学园艺学院,福州350002;福建农林大学园艺学院,福州350002
【正文语种】中文
【中图分类】Q785;Q786
泛素－蛋白酶体途径（ubiquitin－proteasome pathway，UPP）广泛存在
于真核生物中，对蛋白质的降解具有高度选择性，它通过调节功能蛋白质的周转或降解不正常的蛋白实现对多种代谢过程的调节，在维持细胞功能以及周期运转，抵御环境胁迫，胚胎发育，激素响应和衰老等方面发挥着重要的作用［1－5］。

泛
素结合酶 E2（ubiquitin conjugating enzyme E2）是UPP途径的关键作用酶之一，具有结合并转移泛素到靶蛋白的作用，决定泛素链长度、拓扑结构和蛋白泛素化效率［6］，对泛素化修饰的特异性和精确性起着关键作用［4－5］。

有研究表明，干旱、重金属、高温等非生物胁迫因素能够诱导植物泛素结合酶E2基因表达，从而提高植物适应不良环境的能力。

目前，泛素结合酶E2基因响应干旱、高盐、SA 及重金属汞的研究已有报道［7－9］，而关于该基因响应铜胁迫的研究尚未见报道。

小白菜（Brassica chinensis L．）是十字花科芸薹属植物，营养价值较高，栽培
面积较广，是备受人们喜爱的蔬菜之一。

近年来，由于含重金属农药、化肥、有机肥的使用以及工业废水的排放，使得土壤中铜含量越来越高，严重影响了小白菜的产量和品质［10－13］。

因此挖掘小白菜自身所具有的抗逆基因，研究其机理和
通过操纵这些抗逆基因的表达提高小白菜对不良环境的适应能力就显得非常重要。

本试验应用 cDNA－AFLP（cDNA amplified fragment length polymorphism）技术分析10mg／L铜胁迫下小白菜基因的差异表达，得到了与小白菜铜胁迫相关的泛素结合酶E2基因的差异表达TDF（transcript derived fragment）；利用RACE 技术克隆获得该基因cDNA全长，命名为BcUBCE2；利用生物信息学对其核苷酸序列以及编码的氨基酸序列进行了分析；采用qRT－PCR分析该基因在铜
胁迫下的表达模式，为进一步研究其在抗逆过程中的生物学功能奠定基础。

1 材料和方法
1．1 材料及铜胁迫处理
本试验供试小白菜品种为‘上海青’，将种子播于珍珠岩和草炭土按3∶18比例混匀的穴盘中，待幼苗长到4～5片真叶时，作为试验材料在叶菜类营养液［14］中水培，铜质量浓度为10mg／L，以CuSO4·5H2O形态加入。

培养液每隔5d 更换1次，每次更换前取样。

分别取处理0、5、10、15、20d时的根、茎和第5片真叶（去除主叶脉）用液氮速冻后保存于－80℃冰箱备用。

1．2 方法
1．2．1 小白菜总RNA提取与cDNA的合成采用Trizol（Invitrogen公司）试剂提取小白菜总RNA，并进行电泳检测和吸光度（OD）值的测定。

分别利用RevertAit First strand cDNA Synthesis Kit试剂盒（Thermo公司）和SMARTTM RACE cDNA Amplification试剂盒（Contech公司），将所提取的RNA反转录成cDNA，作为3′－RACE 和5′－RACE的模板。

合成3′－RACE模板cDNA的引物为锚定引物AP。

cDNA第二链合成采用LD－PCR法进行，双链cDNA用紫外分光光度法检测。

1．2．2 cDNA－AFLP分析 cDNA－AFLP分析参照张凤云［15］的方法进行。

将差异表达TDFs进行回收、二次PCR后经连接、转化、验证后送上海博尚公司测序。

测序后的TDFs核苷酸序列于NCBI上进行Blast比对，预测其功能，筛选出与铜胁迫相关的基因。

1．2．3 基因全长的扩增及测序差异表达TDFs功能分析发现一个与E2基因相关的TDF片段。

根据获得的 TDF片段设计3′－RACE和5′－RACE引物（表1）进行嵌套PCR扩增，第一轮PCR扩增产物稀释10倍作为第二轮的模板。

将所获得的目的片段回收、纯化后送到上海博尚公司测序。

根据测序结果利用DNAMAN 软件将5′－RACE、3′－RACE序列与TDF片段拼接整合，得到
BcUBCE2基因的cDNA全长序列。

在全长序列的3′－UTR和5′－UTR处设计特异引物 UBC－F、UBC－R用于克隆BcUBCE2基因的ORF，进行序列校正。

1．2．4 生物信息学分析利用相关软件分析BcUBCE2的氨基酸序列：用 Blast （http：／／blast．ncbi．nlm．nih．gov／Blast．cgi）进行同源序列搜索；用 Prot－Param（http：／／web．expasy．org／protparam／）预测基本的理化性质；用 ProScal（http：／／web．expasy．org／protscale／）默认算法（Hphob．／Kyte ＆ Doolittle）预测该蛋白的疏水性；用 TMHMM（http：／／www．cbs．dtu．dk／services／TMHMM／）预测跨膜结构；用 SignalP 4．1Server（http：／／www．cbs．dtu．dk／services／SignalP／）预测信号肽；选取部分E2，应用DNAMAN进行序列比对；用 MEGA5．2构建系统进化树。

表1 BcUBCE2基因克隆及荧光定量PCR所用引物Table 1 Primers for cloning and qRT－PCR of BcUBCE2tion UBC－31 UBC－32引物名称Primer name 引物序列Primer sequence（5′→3′）用途Descrip 3′－RACE UBC－51 UBC－52 TCAAGACAACAACATCATGCTCTGG GGGAGTATATGCTTGGACATCC GGATGTCCAAGCATATACTCCCATC CAGAGCATGATGTTGTTGTCTTG 5′－RACE UBC－F UBC－R CCACGGTTAGAGAGGAGGATGTCG CCAAACACAAGAGAGGAGGTTC ORF扩增Amplificition of ORF UBCrt－F UBCrt－R actin－F actin－R TGCTCCACAAGACAACAACATC TCCGAGAAACAAACCGAACA GTCCTGTTCCAGCCTTCGTTC CAAGTCCTTCCTGATATCCACGTC qRT－PCR AP GGCCACGCGTCGACTATACTTTTTTTTTTTTTTTTT 反转录Reverse transcription
1．2．5 BcUBCE2基因特异性表达分析分别提取培养0、5、10、15、20d的小
白菜总 RNA，用Superscript TM Ш First－Strand cDNA Synthesis System for RT－PCR试剂盒合成第一链。

利用小白菜actin为内参基因设计引物（actin－F、actin－R）。

根据已得到的BcUBCE2基因cDNA全长设计特异性引物UBCrt－F 和 UBCrt－R。

用SYBR Premix Ex Taq试剂盒进行qRT－PCR。

2 结果与分析
2．1 小白菜铜胁迫cDNA－AFLP分析
利用筛选出多态性较好的135对引物组合，对铜胁迫0、5、10、15、20d叶片
的cDNA 进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，共筛选出180条差异表达TDFs，从中
挑选差异较为明显的152条TDFs进行二次PCR扩增、回收、测序，最终得到151条有效序列。

将获得的151条TDFs进行功能分析，发现1个与小白菜泛素
结合酶E2相关的TDF，其表达量在铜胁迫10d时最高（图1）。

测序结果表明，该TDF长度为393bp（图2），Blast分析表明，该片段与拟南芥泛素结合酶E2
蛋白的一致性高达97%，推测其可能是小白菜泛素结合酶E2基因cDNA上的一
个片段。

2．2 BcUBCE2基因cDNA全长的克隆与序列分析
利用RACE技术获得283bp的5′序列和451 bp的3′序列（图3），将3′、5′序
列与cDNA－AFLP技术获得393bp的TDF片段拼接后得到830bp的泛素结合
酶E2的cDNA全长（命名为BcUBCE2，GenBank登录号KF148023）。

该序列包含一个459 bp的开放阅读框，150bp的5′－UTR和221bp的3′－UTR序列，36bp Poly A，推测其编码152个氨基酸，含有起始密码子ATG和终止密码子TAG（图4）。

特异引物 UBC－F、UBC－R克隆 ORF测序结果与拼接后的序列
相一致。

2．3 BcUBCE2基因生物信息学分析
用ProtParam软件预测，BcUBCE2基因编码的蛋白分子量为17．28kD，理论等
电点为5．37，所带的正电荷总数（Arg＋Lys）为18，负电荷总数（Asp＋Glu）为16，为酸性蛋白。

理论推导半衰期是30h，消光系数为28 085，不稳定指数为72．04，为不稳定蛋白（参数大于40是不稳定蛋白）。

利用Expasy网站对蛋白质亲水性、疏水性进行分析，结果显示疏水性氨基酸占26．7%，亲水性氨基酸占73．3%，为亲水性蛋白，但不存在跨膜区和信号肽。

结构域预测，BcUBCE2的cDNA推导的氨基酸序列在第24－38部位存在一个WD－重复结构。

第77－92残基部位有一个保守结构域，包含15个氨基酸（FHPNIYADGSICLDIL），是E2I型的酶活性中心［16］。

其间第88部位存在
一个高度保守且具有催化活性的半胱氨酸残基Cys（C），能够与泛素形成高能硫酯键进而将泛素转移到E3酶或靶蛋白上［17－19］。

多序列比对发现（图5），保守结构域的15个氨基酸残基和第88位的半胱氨酸残基与其他真核生物E2对应的序列完全匹配，在进化上高度保守。

将小白菜BcUBCE2的编码蛋白与GenBank中登载的11个物种的E2蛋白进行聚类分析，构建E2进化树，结果（图6）显示，小白菜BcUBCE2蛋白与同为十字花科拟南芥的E2蛋白的亲缘关
系最近，首先聚为一支，同玉米的E2蛋白的亲缘关系最远。

图1 铜胁迫下小白菜BcUBCE2基因cDNA－AFLP图谱Fig．1 cDNA－AFLP map of BcUBCE2in B．chinensis L．under copper stress
图2 铜胁迫下小白菜BcUBCE2基因的差异表达TDF序列Fig．2 The TDF sequence of BcUBCE2in B．chinensis L．under copper stress
图3 BcUBCE2基因PCR扩增结果M．DL2000；A．3′－RACE扩增；B1、
B2．5′－RACE扩增；C1～C3．ORFFig．3 Amplification products of BcUBCE2M．DL2000；A．Amplification products of 3′－ACE；B1and
B2．Amplification products of 5′－RACE；C1～C3．ORF
图4 BcUBCE2基因核苷酸序列及推导氨基酸序列方框内为起始密码子和终止密码
子；单下划线部分为WD－重复结构；双下划线部分为UBC活性位点；阴影为保守的半胱氨酸Fig．4 Nucleotiode sequence and deduced amino acid sequence of BcUBCE2The initiator and terminator codons，ATG and TAG，are boxed；The single lines indicate WD－40repeats and the double lines indicate the active site of UBC；Shaded residue indicate conservative cysteine
图5 BcUBCE2基因推测的氨基酸序列与其他同源序列的比对W区为WD－重复
结构，U区为UBC活性位点，＊为保守的半胱氨酸Fig．5 Alignment of deduced amino acid sequences between BcUBCE2and homologous genes fromB．chinensis L．and some other plant speciesW area is WD－repeats，U area is UBC active site，＊indicate conservative cysteine
2．4 BcUBCE2基因在铜胁迫下的特异性表达
为研究小白菜BcUBCE2基因对铜胁迫的应答，用qRT－PCR检测铜胁迫0、5、10、15、20d的根、茎、叶片中BcUBCE2基因的表达（图7），结果显示该基
因在根、茎、叶中均有表达，但其表达丰度不同，在根中的表达量最高，其次是茎，说明该基因没有组织特异性。

在铜胁迫下，该基因被诱导而上调表达，处理10d
时BcUBCE2基因的表达量最高，10d后其表达量降低，但仍高于对照（处理
0d）。

图6 小白菜BcUBCE2与其他物种泛素结合酶E2氨基酸序列系统进化分析分支点数字表示Bootstrap验证中基于1 000次重复该节点可信度Fig．6 Phylogenetic tree of amino acid sequences of BcUBCE2with
E2fromB．chinensis L．and other speciesThe number at the nodes represents the reliability percent of bootstraps values based on 1
000replications
图7 铜胁迫下BcUBCE2在根、茎、叶中的相对表达Fig．7 Expression analysis of BcUBCE2in root，stem and leaf under copper stress
3 讨论
泛素结合酶E2是一个多基因家族，拟南芥基因组中有37个E2基因，根据结构和功能可将E2基因分为4大亚类：ClassⅠ只含有UBC结构域，在许多短命蛋白和异常蛋白的泛素依赖性降解中起重要作用；ClassⅡ包含有一个C端延长的蛋白序列，能够参与靶蛋白识别、与E3酶互作、参与N－末端规则（N－end rule）依赖性蛋白水解途径；ClassⅢ包含一个在N端延长的蛋白序列；ClassⅣ同时包含有N端和C端延长的蛋白序列［20］。

小白菜BcUBCE2与其它物种的E2具有极高的相似性，结构域分析发现该基因含一个UBC催化结构域和一个高度保守的半胱氨酸残基，但不含C－末端延伸结构和N－末端延伸结构。

因此小白菜BcUBCE2基因属于小白菜Ⅰ类E2。

泛素结合酶E2可与苯丙氨酸解氨酶等防御反应基因启动子上特定的顺式作用元件结合，实现对植物防御反应的调节［21］。

本研究结果显示，小白菜BcUBCE2基因在根、茎、叶中均有表达，在铜胁迫下该基因被诱导而上调表达，且胁迫10d 时表达量最高，10d后表达量降低，这与Genschik等［22］的研究结果相似。

Genschik等用0．1%HgCl2处理野生烟草原生质体发现处理6h时泛素－蛋白酶体途径的3种基因表达量达到最大值。

E2基因存在着种类和功能多样性，在逆境作用下E2基因表现出下调或上调等不同的表达方式［21］。

Feussner等［23］研究发现番茄LeUBC1基因受热激和重金属诱导表达增强，拟南芥AtUBC2基因对紫外光胁迫和植物激活因子表现出较强的抗性［24－25］。

这些结果说明E2基因可能通过参与不正常蛋白的降解过程，从而提高植物的抗逆性。

本研究表明在胁迫发生时，BcUBCE2在小白菜根、茎、叶中均能响应铜胁迫，但其对铜胁迫的响应机制尚不清楚，有待进一步研究。

【相关文献】
［1］ ADAMS J．The proteasome：structure，function，and role in the cell［J］．Cancer Treatment Reviews，2003，29（1）：3－9．
［2］ KUEPA J，SMALLE J A．Structure function and regulation of plant proteasomes ［J］．Biochimie，2008，90（2）：324－335．
［3］ GUO Q F（郭启芳），ZOU Q（邹琦），WANG W（王玮）．Physiological function
of plant ubiquitin／26Sproteasome pathway and its molecular biology［J］．Plant Physiology Communications（植物生理学通讯），2004，40（5）：533－539（in Chinese）．［4］ NI X G（倪晓光），ZHAO P（赵平）．The components and functions of the ubiquitin－proteasome pathway［J］．Progress in Physiological Sciences（生理科学进展），2006，37（3）：255－258（in Chinese）．
［5］ WU Y Q（吴焱秋），CHAI J K（柴家科）．The composition and biological role of ubiquitin－proteasome pathway［J］．Progress in Physiological Sciences（生理科学进展），2001，32（4）：331－333（in Chinese）．
［6］ YE Y，RAPE M．Building ubiquitin chains：E2enzymes at work［J］．Nature Reviews Molecular Cell Biology，2009，10（11）：755－764．
［7］ JEON E H，PAK J H，KIM M J，et al．Ectopic expression of ubiquitin－conjugating enzyme gene from wild rice，OgUBC1，confers resistance against UV－B radiation and Botrytisinfection in Arabidopsis thaliana［J］．Biochemical and Biophysical Research Communications，2012，427（2）：309－314．
［8］ KOKEN M H，REYNOLDES P，JASPERS－DEKKER I，et al．Structural and functional conservation of two human homologs of the yeast DNA repair gene RAD6［J］．Proceedings of the National Academy of Sciences，1991，88（20）：8 865－8 869．［9］ XU CH X（徐晨曦），JIANG J（姜静），LIU T T（刘甜甜），et al．Sequence analysis and function determination of E2sgene fromTamarix androssowii［J］．Journal of Northeast Forestry University（东北林业大学学报），2007，35（11）：1－4（in Chinese）．［10］ LIN Y ZH（林义章），XU L（徐磊），LIN B Y（林碧英）．Effects of copper stress
on Brassica chinensis L．resistant enzyme system and other resistant indexes ［J］．Journal of Fujian Agriculture and Forestry University（福建农林大学学报），2007，36（4）：369－372（in Chinese）．
［11］ XU L（徐磊），LIN Y ZH（林义章）．The change of Brassica chinensis L．quality indicators under the copper stress［J］．Chinese Agricultural Science Bulletin（中国农学通报），2009，25（14）：161－163（in Chinese）．
［12］ LIN Y ZH（林义章），ZHANG SH Y（张淑媛），ZHU H SH（朱海生）．Effect of copper stress on ultra－structure of mesophyll cells in Chinese cabbage［J］．Chinese Journal of Eco－Agriculture（中国生态农业学报），2008，16（4）：948－951（in Chinese）．
［13］ LIN Y ZH（林义章），XU L（徐磊）．Physiological toxicity of copper pollution to higher plant［J］．Chinese Journal of Eco－Agriculture（中国生态农业学报），2007，15（1）：201－204（in Chinese）．
［14］连兆煌．无土栽培原理与技术［M］．北京：中国农业出版社，1994：57－59．
［15］张凤云．青花菜软腐病病程的cDNA－AFLP差异表达分析［D］．福州：福建农林大学，2013．
［16］ SIBERIL Y，THIERSAULT M，NEPUMOCENO G，et al．Cloning of a cDNA enconding an E2ubiquitin－conjugation enzyme fromCatharanthus roseus：Expression analysis in plant organs and in response to hormones in cell suspensions［J］．Jourrnal
of Experimental Botany，2002，53（366）：149－150．
［17］ SULLIVAN M L，VIERSTRA R D．A ubiquitin carrier protein from wheat germ is structurally and functionally similar to the yeast DNA repair enzyme encoded by RAD6［J］．Proceedings of the National Academy of Sciences，1989，86（24）：9 861－9 865．［18］ WANG Y（王园），WANG J SH（王甲水），XIE X L（谢学立），et al．Studies of
the relationship between MaUCE1and banana fruit ripening［J］．Acta Horticulturae Sinica（园艺学报），2010，37（5）：705－712（in Chinese）．
［19］ YI Y F（易乐飞），WANG P（王萍），ZHOU X H（周向红），et al．cDNA cloning and characterization of a novel ubiquitin－conjugating enzyme gene fromPorphyra yezoensis Ueda［J］．Journal of Fisher Ies of China（水产学报），2009，33（5）：719－726（in Chinese）．
［20］ JENTSCH S．The ubiquitin－conjugation system［J］．Annual Review of Genetics，1992，26（1）：179－207．
［21］ LAI Y（赖燕），XU B（徐波），LIN M（林明），et al．Isolation of ubiquitin－conjugating enzyme cDNA fromCapsicum annumand analysis of its expression under UV
－B stress［J］．Journal of Fujian Agriculture and Forestry University（福建农林大学学报），2008，37（2）：162－165（in Chinese）．
［22］ GENSCHIK P，PARMENTIER Y，DURR A，et al．Ubiquitin genes are differentially regulated in protoplast－derived cultures of Nicotiana sylvestris and in response to various stresses［J］．Plant Molecular Biology，1992，20（5）：897－910．
［23］ FEUSSNER K，FEUSSNER I，LEOPOLD I，et al．Isolation of a cDNA coding for an ubiquitin－conjugating enzyme UBC1of tomato－the first stress－induced UBC of higher plants［J］．FEBS Letters，1997，409（2）：211－215．
［24］ ZWIRN P，STARY S，LUSCHNIG C，et al．Arabidopsis thaliana RAD6homolog
AtUBC2complements UV sensitivity，but not N－end rule degradation deficiency，of Saccharomyces cerevisiae rad6mutants［J］．Current Genetics，1997，32（5）：309－314．
［25］ XU L，MENARD R，BERR A，et al．The E2ubiquitin－conjugating enzymes，AtUBC1and AtUBC2，play redundant roles and are involved in activation of FLC expression and repression of flowering in Arabidopsis thaliana［J］．The Plant Journal，2009，57（2）：279－288．。