实验十二质粒DNA的小量制备、电泳检测及细菌转化

实验十二质粒DNA的小量制备、电泳检测及细菌转化
Ⅰ. 质粒DNA的小量制备
一实验目的
学习并把握质粒的小量制备技术。

二实验材料和用具
菌种：DH5α/pUC19
培育基：LB：Tryptone 1%，Yeast Extract %，NaCl 1%，
(Agar 2%)；120℃灭菌20min。

D0001碧云天质粒小量抽提试剂盒（或其它公司的产品）
恒温培育箱、恒温摇床、超净工作台、台式高速离心机、台式小型振荡仪、EP管（Eppendorf管，微量离心管）、加样器、吸头等。

三原理
实验采纳国产的质粒小量抽提试剂盒。

它是一种新型的离子互换柱，在特定的条件下，使质粒能在离心过柱的刹时，结合到质粒纯化柱上，在必然条件下又能将质粒充分洗脱，从而实现质粒的快速纯化。

而且在提取进程中，无需酚-氯仿抽提、无需酒精沉淀，可在较短时刻内完成质粒的提取和纯化。

四实验内容
1.细菌培育及菌体的收成。

2.用试剂盒进行小量质粒制备。

五实验步骤
1. 将菌株接种到液体LB培育基中，加入氨苄青霉素至100μg/ml，150rpm振荡16h；
2. 吸取培育菌液与离心管中，13000rpm室温下离心2min。

倒掉上清，然后倒置于吸水纸
上，使液体流尽；
3. 加入150μl溶液Ⅰ，vortex或弹起沉淀，使完全散开，无絮块。

4. 加入200μl溶液Ⅱ，倒置离心管6~8次，使细菌完全裂解，溶液透明，注意不能振荡；
5. 加入500μl溶液Ⅲ，倒置6~8次，可见白色絮状物产生；
6. 13000rpm离心10min。

离心时预备好质粒纯化柱及最后的质粒搜集管；
7. 直接将上清液倒入质粒纯化柱，13000rpm离心1min，使质粒结合于纯化柱上；
8. 倒弃搜集管内的液体，在质粒纯化柱内加入750μl溶液Ⅳ，13000rpm离心1min，洗去
杂质；
9. 倒弃搜集管内液体，13000rpm离心1min，除去残留液体；
10. 将质粒纯化柱放在质粒搜集管上，加50ul溶液Ⅴ至管内柱面上，放置1min；
11. 13000rpm离心1min，所得液体确实是质粒。

质粒于-20℃冰箱保藏备用。

六注意事项
1.在利用前，在溶液Ⅳ（洗涤液）加入40ml无水乙醇或43ml95%乙醇，然后在瓶盖
上作好记号。

2.溶液Ⅱ在温度较低时，可能会产生沉淀，需先用水浴加热溶解，混匀后再利用。

溶
液Ⅱ易被空气中的CO2酸化，用完后应当即盖紧瓶盖。

七试探题
1.加入溶液Ⅱ后，什么缘故不能猛烈振荡？
附录一：pUC19图谱
Ⅱ. 质粒DNA的电泳检测
一实验目的
学习并把握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的技术。

二实验材料
琼脂糖，TAE缓冲液，加样缓冲液，溴化乙锭（EB），标准分子量Marker
电泳仪、稳压电源、凝胶电泳成像仪等
三实验原理
琼脂糖电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离、鉴定和纯化DNA片段的有效方式。

琼脂糖凝胶的分辨能力要比聚丙烯酰胺凝胶低，但其分离范围较广。

用各类浓度的琼脂糖凝胶可分离长度200bp~50kb的DNA.。

琼脂糖凝胶通常采纳水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。

直接用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙锭进行染色，可确信DNA在凝胶中的位置。

四实验内容
对所提取的质粒DNA样品进行电泳检测。

五实验步骤
1. 制胶（见图3）
(1) 胶模两头用胶带封严，架好梳子备用；
(2) 称取的琼脂糖于100ml烧杯中，加入20mlTAE，加热熔化至无颗粒状琼脂糖，冷却
到60℃左右加入EB（终浓度μg/ml），摇匀，即倒入胶模中凝固30min以上；
(3) 临用前，撕去封口胶带，放入电泳槽中，倒入适量的电泳缓冲液TAE（淹过胶面），
拔取梳子备用。

2. 样品预备
取已提取好的质粒DNA 5μl于500μl指管中，加入1μl的加样缓冲液，混匀；
3. 电泳
(1) 将样品和5μl标准分子质量别离点样到梳孔中；
(2) 恒压50v，电泳60分钟左右；
(3) 电泳终止后关闭电源，掏出凝胶，用凝胶成像仪进行摄影和记录。

图3 灌制水平琼脂糖凝胶
六实验结果
将质粒DNA条带与DNA MW Marker进行比对，对证粒提取结果进行分析。

七注意事项
溴化乙锭是强诱变剂，并有中度毒性，取用含有这一染料的溶液时务必戴上手套，这些溶液经利用后应按下面介绍的方式进行净化处置。

附录一
溴化乙锭稀溶液的处置
(适用于含有 g/ml的溴化乙锭的电泳缓冲液)
方式一
1.每100ml溶液中加入Amberlite XAD-16,这是一种非离子型多聚吸附剂,可向Rohm
& Haas公司购买；
2.于室温放置12小时，不时摇动；
3.用Whatman 1滤纸过滤溶液，抛弃滤液；
4.用塑料袋封装滤纸和Amberlite 树脂，作为有害废物予以抛弃。

方式二
1.每100ml溶液中加入100mg粉状活性炭；
2.于室温放置1小时，不时摇动；
3.用Whatman 1号滤纸过滤溶液，抛弃滤液；
4.用塑料袋封装滤纸和活性炭，作为有害废物予以抛弃。

附录二
1. 电泳缓冲液
Tris-乙酸（TAE）：L Tris-乙酸，L EDTA。

浓储藏液液（50×TAE）：每升含有242g Tris碱，冰乙酸，10ml L EDTA（）
2. L EDTA（）
在80ml蒸馏水中加入EDTA-Na·2H2O，在磁力搅拌器上猛烈搅拌，用NaOH调剂溶液的pH值至，然后定容至1000ml，分装后灭菌备用。

Ⅲ大肠杆菌的转化实验
一实验目的
学习并把握大肠杆菌感受态细胞的制备及外源基因导入细胞的技术。

二实验材料和用具
菌种：DH5α；
质粒：pUC19；
培育基：LB：
1.LB液体试管：5ml/管；
2.LB液体三角瓶：20ml/250ml三角瓶；
3.LB+Amp平板：Ampicillin 加量100μg/ml；
器材：恒温培育箱、恒温摇床、离心机、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、涂布棒、EP 管、
可调移液器、吸头等。

三实验原理
转化活性是检测质粒生物活性的重要指标。

用于转化的受体细胞一样是限制-修饰系统缺点的变异株，以避免对外源DNA的切割。

质粒可否进入受体细胞取决于该细胞是不是处于容易吸收外源DNA的感受态。

细胞的感受态能够通过理化因素诱导产生。

大肠杆菌是经常使用的受体菌，其感受态一样是通过用CaCl2在0℃条件下处置细胞而形成。

细胞处于0℃的CaCl2低渗溶液中，会膨胀成球形，细胞膜的通透性发生改变，转化混合物中的质粒DNA 形成抗Dnase的羟基-钙磷酸复合粘附于细胞表面，经42℃短时刻热激处置，增进细胞吸收DNA复合物，在LB培育基上培育数小时后，球形细胞恢复并增殖，在选择培育基上即可取得所需的转化子。

四实验内容
1.制备DH5α的感受态细胞；
2.进行质粒pUC19的转化
五操作步骤
1. 菌种在LB液体培育基中活化，37℃，150rpm振荡培育留宿；
2. 转接到新鲜LB液体培育基中，接种量5%；
3. 37℃，150rpm培育至OD600=~；
4. 将培育液放入冰浴冷却10min；
5. 取培育液于6500rpm离心5min，弃上清液；
6. 加冰凉CaCl2溶液（50mmol/LCaCl2，10mmol/L Tris，），用混匀器混匀或用手指弹离
心管混匀；
7. 将离心管置于冰浴45min；
8. 6500rpm 5min离心搜集细胞；
9. 将细胞警惕悬浮于冰凉CaCl2溶液中（用移液器警惕混匀）；
10. 加1 l质粒，警惕混匀，置冰浴45min；
11. 将离心管置于42℃恒温水浴热处置2min（准确！）；
12. 加1mlLB液体培育基后于37℃、150rpm振荡培育1h；
13. 取培育液涂布至LB+Amp平板上；
14. 将平板倒置于37℃恒温培育箱中培育留宿。

六实验结果
观看转化结果，并进行分析。

七试探题
1. 本实验成功的关键是什么？
2. 什么是感受态细胞，用什么方式取得感受态细胞？
3. 本实验中转化的原理是什么？pUC19质粒有何特点？。