一株斜带石斑鱼_Epinepheluscoioides_病原菌的分离与鉴定.

皮溃烂，肝脏点状发红。2011 年 7 月从濒死病鱼肝脏、肾脏中分离到 2 株细菌，分别命名
为 201107 － I 与 201107 － II，经生理、生化指标和 16S rＲNA 基因鉴定，这两株均为哈维氏
弧菌 （ Vibrio harveyi） 。毒 性 实 验 发 现 这 两 株 菌 都 能 引 起 斜 带 石 斑 鱼 表 皮 溃 烂 症，其 中
更强； 死亡石斑鱼表现为鳞片脱落、表皮溃烂。 证实该菌株是引起斜带石斑鱼表皮溃烂症的病 原菌。
用肌肉注射、腹腔注射和创伤浸浴这 3 种方 式来进一步测定菌株 201107 － II 的毒性，3 种回 归感染实验对石斑鱼的半致死剂量 LD50 分别为 4. 3 × 104 、2. 9 × 105 和 5. 4 × 106 cfu / g 鱼 体 重 （ 表 1） 。从感染后的石斑鱼肾脏组织中再次分离 到一株菌，标记为 201107 － Ｒ。该菌株菌落形态 与 201107 － II 相同。
脏组织中均分离到比较单一的菌落，且用 TCBS 培养基分离的细菌与对应的 2216E 分离的细菌， 菌落形态相近。挑取从肝脏组织分离的细菌，标 记为 201107 － I； 挑取从肾脏组织分离的细菌，
第6 期
林克冰等： 一株斜带石斑鱼 （ Epinephelus coioides） 病原菌的分离与鉴定
感染方式 菌液浓度 / （ cfu / mL） Infection method Strain concentration
6 × 108
肌肉注射 Muscle injection
6 × 107 6 × 106 6 × 105
6 × 104
对照组 Control group
生理盐水 6 × 108
腹腔注射 Celiac injection
中图分类号： S943
文献标识码： A
斜 带 石 斑 鱼 （ Epinephelus coioides） 是 福 建 省海水养殖的重要经济种类。近年来，随着养殖 规模的扩大，在幼苗培育和成体养殖阶段，爆发 性死亡现象常有发生。细菌病是危害石斑鱼健康 养殖的常见病之一，特别是弧菌属种类 （ Vibrio） ，常造成养殖石斑鱼的大量死亡，给水产养 殖业造成重大的经济损失［1 － 4］。
1 材料与方法
1. 1 患病石斑鱼的取样及表现症状 患病斜带石斑鱼 （ E. co场。病鱼体重 3 ～ 10 g，
收稿日期： 2014 － 10 － 28 基金项目： 福建省海洋与渔业厅项目 “斜带石斑鱼苗种期病害防治技术研究”［闽海渔科 （ 2007） 004］． 作者简介： 林克冰 （ 1964 － ） ，女，硕士，副研究员，主要从事海洋生物病害防控技术研究． E － mail： kebingl@
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16S rＲNA 基因鉴定，为同株菌。药敏实验结果表明，该菌株对红霉素、大观霉素、氯霉素
等 16 种抗生素高度敏感，对呋喃唑酮、克拉霉素、环丙沙星等 9 种抗生素中度敏感，对苯
唑西林、青霉素 G、万古霉素等 13 种抗生素不敏感。本研究对石斑鱼病害防治与健康养殖
具有一定的指导意义。
关键词： 斜带石斑鱼； 哈维弧菌； 细菌鉴定； 药敏
设置 3 种感染方式： 腹腔注射、肌肉注射以 及创伤浸浴。同样以无菌生理盐水作为对照。腹 腔注射和肌肉注射分别设置 5 个浓度梯度，分别 是： 6 × 104 、6 × 105 、6 × 106 、6 × 107 、6 × 108 cfu / mL，每组 10 尾。每尾注射 0. 1 mL 菌液； 创 伤浸浴设置 3 个浓度梯度，分别为 6 × 106 、6 × 107 、6 × 108 cfu / mL。每个梯度设置两个平行组， 连续观察 2 周，记录每组的死亡情况。半致死量 LD50 测定参照 Ｒeed － Muench 的方法［5］。方法如 下： lgLD50 = algb + c； a 为距离比例，a = （ 高 于 50% 死亡率 － 50% ） / （ 高于 50% 死亡率 － 低于 50% 死亡率） ，b 为稀释系数，本实验的稀 释系数为 10 － 1 ； c 为高于 50% 死亡率的最小浓度 的对数。
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标记 为 201107 － II。这 两 株 菌 在 TCBS 培 养 基 28℃ 培养 24 h 后，所形成的菌落均表现为： 菌 落圆形、黄色、边缘整齐，直径 0. 5 ～ 1. 0 mm， 但是 201107 － I 菌株菌落类似 “煎鸡蛋样”。 2. 2 人工感染实验及 LD50 的测定
sina. com
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福建水产
第 36 卷
表现症状为鱼体色变深，拒食，离群缓慢游动， 背鳍下方局部鳞片脱落、表皮溃烂，肝脏点状发 红。
将患病石斑鱼置于充氧海水中，带回实验室 进行细菌分离。 1. 2 细菌分离
患病鱼体表用酒精棉球擦洗消毒后，用无菌 剪刀、镊子取肝脏和肾脏组织，涂布于 TCBS 平 板和 2216E 培养基平板，并放置在 28℃ 培养箱 中培养 24 h。长出菌落后再次在 2216E 平板上 划线做进一步纯化分离。纯化后的细菌用 15% 甘油，保存于 － 80℃ 冰箱中。 1. 3 石斑鱼的人工感染及半致死浓度 （ LD50 ） 的测定
经 109 cfu / mL 菌液浓度进行肌肉注射感染实 验，对照组石斑鱼正常，而感染组全部死亡，表 明菌株 201107 － I 和 201107 － II 均为石斑鱼病原 菌。在 2 d 内菌株 201107 － I 引起石斑鱼的死亡 率为 10% ，而在 5 h 内菌株 201107 － II 对石斑鱼 致死率达到 90% ，表明菌株 201107 － II 的毒性
选择人工感染后濒死且有典型症状的石斑鱼 按 2. 2 中方法再次分离肾脏中的细菌，进行后续
的生理、生化及分子鉴定。 1. 4 细菌的生理、生化及 16S rＲNA 基因鉴定
细菌的鉴定采用常规的生理、生化鉴定方法 以及 16S rＲNA 基因分子鉴定。 1. 4. 1 生理、生化鉴定
将于 28℃ 条件下，在 2216E 培养基上培养 24 h 的菌株经生理盐水洗后进行生理、生化鉴 定。生理、生 化 鉴 定 采 用 法 国 梅 里 埃 公 司 的 API20E 细菌鉴定系统并结合 《伯杰细菌鉴定手 册》 （ 第九版） 进行［6］。 1. 4. 2 16S rＲNA 基因鉴定
6 × 107 6 × 106 6 × 105
6 × 104
对照组 Control group
创伤浸浴 Wound immersion
生理盐水
6 × 108 6 × 107 6 × 106
对照组 Control group
生理盐水
剂量 / （ cfu / g） Dose
1． 5 × 107 1． 5 × 106 1． 5 × 105 1． 5 × 104 1． 5 × 103
－
1． 5 × 107 1． 5 × 106 1． 5 × 105 1． 5 × 104 1． 5 × 103
－
1． 5 × 107 1． 5 × 106 1． 5 × 105
－
感染数目
存活数
死亡数 死亡率 /%
Infected number Survival number Death number Death rate
201107 － II 毒性较强，被用于后续感染实验。通过肌肉注射、腹腔注射与创伤浸浴 3 种方式
进行回归感染实验，得到 3 种方式对石斑鱼的半致死量 LD50 分别为 4. 3 × 104 、2. 9 × 105 和 5. 4 × 106 cfu / g 鱼体重。从人工感染的石斑鱼肾脏中再次分离到该菌，经生理、生化指标和
2011 年 07 月，福建省晋江某养殖场养殖的 斜带石斑鱼 （ E. coioides） 发病，症状为背鳍下 方局部鳞片脱落、表皮溃烂。为了确定该病病原 情况，本研究对病鱼的内脏组织进行病原菌的分
离培养，通过人工感染实验确定病原菌，并通过 常规的生理、生化特性和细菌 16S rＲNA 基因序 列的鉴定进一步确定了病原菌的种类。通过药敏 纸片法检测了该病原菌对常用水产药物的敏感 性，为预防发病提供理论支持。本研究对石斑鱼 病害防治与健康养殖具有一定的指导意义。
取体长 （ 6. 0 ± 0. 6） cm，体重 （ 4. 0 ± 1. 0） g 的健康斜带石斑鱼苗种进行人工感染实验。石 斑鱼分组饲养在 15 L 充气水桶中，水温 24℃ ， 盐度 27. 5‰，每天换水一次，早、晚各投喂配 合饲料一次。
将经过无菌生理盐水稀释配制成的 109 cfu / mL 浓度的菌液，以肌肉注射方式感染石斑鱼并 观察 2 d，用以评估分离得到的菌株的毒性大小。 实验分为实验组和对照组，每组 10 尾。实验组 鱼每尾注射 0. 2 mL 菌液，以等量无菌生理盐水 作对照，之 后 选 择 毒 性 最 大 的 菌 株 进 行 后 续 试验。
第 36 卷第 6 期 2014 年 12 月
福建水产 Journal of Fujian Fisheries
Vol． 36 No． 6 Dec． 2014
文章编号： 1006 － 5601（ 2014） 06 － 0419 － 09
DOI： 10. 14012 / j. cnki. fjsc. 2014. 06. 001
一株斜带石斑鱼 （ Epinephelus coioides） 病原菌的分离与鉴定
林克冰，吴建绍，黄兆斌，葛 辉，朱志煌，孙敏秋
（ 福建省水产研究所，福建，厦门 361013）
摘要： 2011 年 7 月，福建省晋江某养殖场养殖的斜带石斑鱼 （ Epinephelus coioides） 发病，
病鱼体重 3 ～ 10 g，症状为鱼体色变深，拒食，离群缓慢游动，背鳍下方局部鳞片脱落、表
除噁喹酸 （ 2 μg / 片） 、氟 苯 尼 考 （ 30 μg / 片） 两种药敏纸片为实验室自制外，其他纸片 均采用杭州天和微生物试剂公司的常用新药敏纸 片试剂盒。按照试剂盒说明书测试待测菌株对 40 种抗菌药物的敏感性。
2 结果
2. 1 细菌的分离培养 用 TCBS 培养基和 2216E 培养基从肝脏和肾
PCＲ 扩增程序如下： 94 ℃ 变性 5 min，94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1. 5 min，30 个循环， 72 ℃ 延伸 10 min。PCＲ 产物经 1. 5% 琼脂糖凝胶 电泳检测后送至南京金斯瑞生物公司测序。
测 序 序 列 去 除 前 后 的 模 糊 序 列 后， 用 BLAST 比对相近序列，用 MEGA 5. 0 软件构建系 统进化树［8］。 1. 5 药敏实验
Tab. 1
表 1 不同浓度梯度的菌株 201107 － Ⅱ感染石斑鱼的累计死亡率 Accumulated mortality rate of E. coioides caused by different concentrations of strain 201107 － Ⅱ
using three types of artificial injection
将过夜培养的菌液，取 10 μL 置于 PCＲ 反 应管中，离心，去除培养基，加 10 μL ddH2 O 于 99 ℃ 加热 10 min，12 000 rpm 离心 5 min，上清 即为细菌 DNA，可作为 PCＲ 模板。
PCＲ 扩增引物如下： 27F （ 5’ － AGAGTTTGATCCTGGCTCAG － 3 ’） ，1492Ｒ （ 5 ’ － GGTTACCTTGTTACGACTT － 3’） ［7］。PCＲ 扩增体系： 5 μL 10 × PCＲ buffer，200 μM dNTPs，0. 4 μM 引物，1. 25 U ExTaq polymerase （ 大 连 TaKaＲa 公司） ，1 μL 细菌 DNA。