改进差示苯酚—硫酸法测定维血宁颗粒多糖含量

改进差示苯酚—硫酸法测定维血宁颗粒多糖含量
目的建立维血宁颗粒中多糖含量测定方法，以更好地控制该制剂质量。

方法采用改进差示苯酚-硫酸法，以葡萄糖为对照品，在波长487 nm处，以苯酚浓度、浓硫酸浓度和反应时间为考察因素，优选最佳显色条件。

结果测定多糖的最佳显色条件为0.04 g/mL苯酚溶液1 mL、87.5%硫酸溶液5 mL和显色时间为15 min；葡萄糖在15.3～306.0 μg范围内与吸光度差值（ΔA）呈良好的线性关系，r=0.999 7；平均回收率为103.5%，RSD=2.9%。

测得维血宁颗粒中多糖平均含量为27.04%，RSD=1.1%。

结论该方法操作简便、准确，稳定可靠，可用于维血宁颗粒中多糖含量的测定。

标签：维血宁颗粒；苯酚-硫酸法；多糖；含量测定
维血宁颗粒收载于2010年版《中华人民共和国药典》中药成方制剂中，由虎杖、白芍（炒）、仙鹤草、生地黄、鸡血藤、熟地黄、墨旱莲、太子参8味药组成，具有滋补肝肾、凉血清热功效，用于治疗血小板减少症，血热所致的出血症，因肿瘤放、化疗引起白细胞减少症等[1-2]。

多糖是生物体中广泛存在的物质，具有多种生物活性[3]。

该制剂处方中生地黄、熟地黄、太子参、虎杖、白芍等均含有多糖，多糖是该处方提取物中比例最大的活性成分，但目前维血宁颗粒质量标
准中仍没有多糖含量测定项，因此有必要建立简便、准确的多糖含量测定方法，用于该制剂生产工艺的进一步改进和质量控制。

1 仪器与试药
UV BluestarB紫外-可见分光光度计（北京莱伯泰科技有限公司），BT125D 电子天平（十万分之一，赛多利斯科学仪器有限公司），HH-S恒温水浴锅（金坛市大地自动化仪器厂），AKRY-UP-1816超纯化水机（成都唐氏康宁科技发展有限公司），DZF-6090型真空干燥箱（上海齐欣科学仪器有限公司）。

葡萄糖（批号110833-200904，中国食品药品检定研究院），维血宁颗粒由甘肃中医学院中药制药实验室（国家中医药管理局二级科研实验室）提供，D941-大孔吸附树脂（山东鲁抗立科药物化学有限公司），苯酚为分析纯，浓硫酸为优级纯，蒸馏水。

2 方法与结果
2.1 溶液的制备
2.1.1 对照品贮备液的制备精密称量置五氧化二磷真空干燥箱干燥24 h的葡萄糖对照品15.3 mg，置50 mL量瓶中，加蒸馏水溶解并定容至刻度，即得1 mL 含葡萄糖0.306 mg的对照品贮备液。

2.1.2 供试品溶液的制备取维血宁颗粒5.0 g，研碎，以25 mL蒸馏水溶解，加无水乙醇调至含醇量为85.0%，冰箱静置过夜，3500 r/min离心10 min，除去上清液，沉淀挥干乙醇，加入20 mL蒸馏水溶解，精密吸取1 mL，上D941-大孔吸附树脂柱（R15 mm×H90 mm），预吸附5 h，以蒸馏水进行洗脱，流速3 BV/h，收集洗脱液50 mL，取洗脱液5 mL置100 mL容量瓶中，加蒸馏水稀释并定容，即得。

2.2 检测波长的选择
取供试品溶液1.0 mL置具塞刻度试管中，加入1.0 mL 0.05 g/mL苯酚溶液，混匀，迅速滴加5.0 mL 83.3%硫酸溶液，振摇2 min，置沸水浴中加热30 min，取出冷却至室温，补加1.0 mL蒸馏水，混匀后于紫外-可见分光光度计上以蒸馏水同样操作作为空白对照，于400～600 nm波长范围内测得各波长下吸光度值A1。

另取供试品溶液1.0 mL置具塞刻度试管中，加入1.0 mL蒸馏水，混匀，迅速滴加5.0 mL 83.3%硫酸溶液，振摇2 min，置于沸水浴中加热30 min，取出冷却至室温，补加1.0 mL 0.05 g/mL苯酚溶液，混匀后于紫外-可见分光光度计上以蒸馏水同样操作作为空白对照，于400～600 nm波长范围内测得各波长下吸光度值A2。

ΔA样=A1-A2。

同法于400～600 nm波长范围内测得对照品溶液在各波长下吸光度值A1和A2。

ΔA对=A1-A2。

以ΔA样和ΔA对各点做吸收曲线L样和L对。

结果显示，L样和L对在487 nm处均有最大吸收，故选择487 nm为检测波长[4]。

2.3 显色条件的优化
2.3.1 硫酸溶液浓度的考察随硫酸溶液浓度增大，吸光度差值（ΔA）逐渐增大。

当硫酸溶液中硫酸质量分数≥87.5%时，ΔA趋于平稳。

因此认为在硫酸溶液用量为5 mL、0.05 g/mL苯酚溶液用量为1 mL、显色时间为30 min的条件下，选择87.5%硫酸溶液最为适宜。

2.3.2 苯酚溶液浓度的考察随着苯酚溶液浓度不断增加，ΔA逐渐增大，当苯酚溶液浓度≥0.04 g/mL时，ΔA趋于平稳。

因此在87.5%硫酸溶液用量为5 mL、苯酚溶液用量为1 mL以及显色时间30 min条件下，故选苯酚溶液浓度为0.04 g/mL。

2.3.3 显色时间的考察随着显色时间的不断增大，ΔA不断增大，当显色时间>10 min时，吸光度差值ΔA达到平稳。

为了保证试验的重复性及结果的准确性，确定显色时间为15 min。

2.3.4 最佳显色条件的验证上述单因素考察结果表明，改进差示苯酚-硫酸法的最佳显色条件为：显色剂87.5%硫酸溶液的用量为5 mL，0.04 g/mL苯酚溶液的用量为1 mL，显色时间为15 min。

精密量取葡萄糖对照品溶液1.0 mL，分别置于6支具塞试管中，按改进差示苯酚-硫酸法操作，用最佳显色条件进行试验，测定ΔA。

结果见表1。

2.4 线性关系考察
精密吸取葡萄糖对照品贮备液0.5、1、2、4、6、8、10 mL，分别置于10 mL 容量瓶中，加蒸馏水稀释并定容，分别吸取不同浓度的葡萄糖对照溶液1 mL置具塞刻度试管中，在“2.3”项下最优显色条件下，按“2.2”项下改进差示苯酚-硫酸法操作，分别测定其吸光度值A1和A2，并求出对应ΔA（A1-A2），由质量浓度C对ΔA进行线性回归，得回归方程为：ΔA=0.0049C+0.038 9，r=0.999 7，葡萄糖在15.3～306.0 μg范围内与ΔA呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验
取葡萄糖对照品溶液，在“2.3”项最优显色条件下，按“2.2”项下改进差示苯酚-硫酸法操作，重复测定5次，测得各组吸光度值A1和A2并计算得到相应的ΔA分别为0.644 4、0.639 8、0.642 1、0.640 7、0.6435，RSD=0.3%。

2.6 稳定性试验
取维血宁颗粒多糖供试品，在“2.3”项最优显色条件下，按“2.2”项下改进差示苯酚-硫酸法操作，分别测定并计算供试品溶液在0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120 min的ΔA分别为0.372 3、0.371 9、0.371 4、0.370 6、0.370 0、0.3672、0.365 8、0.363 9、0.361 9、0.360 5、0.357 8、0.3560、0.354 5，RSD=1.7%，说明供试品溶液显色后在2.0 h内稳定。

2.7 重复性试验
取同一批维血宁颗粒5组，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.3”项最优显色条件下，按“2.2”项下改进差示苯酚-硫酸法操作，依次测得并计算每组ΔA 分别为0.366 0、0.369 9、0.359 5、0.3630、0.360 8，RSD=1.2%。

2.8 加样回收率试验
精密称取已测定多糖含量的维血宁颗粒粉末3份，每份0.125 g，分别加入样品含多糖量的80%、100%、120%的葡萄糖对照品，按”2.1.2“项下方法制备供试品溶液，在“2.3”项最优显色条件下，按“2.2”项下改进差示苯酚-硫酸法操作，分别测得其吸光度值A1和A2并算出ΔA，计算回收率。

结果见表2。

2.9 样品含量测定
取3批维血宁颗粒，分别按“2.1.2”项下备方法制备供试品溶液，分别吸取1 mL供试品溶液，在“2.3”项最优显色条件下，按“2.2”项下改进差示苯酚-硫酸法操作，分别测定其吸光度值A1和A2并算出ΔA，计算多糖含量。

结果维血宁颗粒中多糖含量均值为27.04%，RSD=1.1%。

结果见表3。

3 讨论
维血宁颗粒中的有色物质及非糖可显色物对含量测定结果影响较大。

本试验在改良差示苯酚-硫酸法[4]基础上对显色条件进行优化，显色时，将硫酸溶液与苯酚溶液分别配制，避免了原方法由于预配显色剂不稳定造成的显色效果误差；同时将大孔树脂吸附技术与苯酚-硫酸法结合，样品一次醇沉并经大孔吸附树脂处理除掉有色物质后，即可进行多糖测定，省去了反复醇沉的纯化过程，多糖丢失少，而且避免了样品中非糖物质对测定结果的干扰。

经方法学考察，该法可用于维血宁颗粒中多糖含量的测定，具有简便、准确的优点，有利于科研、生产过程中的质量控制。

在含量测定过程中，曾将维血宁颗粒水溶液经二次醇沉后所得多糖进行显色测定，但试验发现显色后的溶液短时间内极不稳定，对测定结果影响很大。

因此，采用一步醇沉结合大孔吸附树脂法对多糖进行提取纯化，同时对供试品制备条件进行优化。

结果表明，树脂用量15 mL、水洗脱树脂柱体积2倍，即可将多糖成分全部洗下，为保证数据准确性，采用洗脱体积为50 mL。

这种供试品处理方法避免了测定过程中显色溶液的不稳定性，保证了试验结果的准确性及重复性。

目前维血宁颗粒采用的制备工艺为水提取70%醇沉淀法，制备过程中多糖损失殆尽。

本试验所采用的维血宁颗粒是经超滤工艺进行纯化，浓缩干燥后直接干法制粒所得，保留了处方中多糖成分，系不含蔗糖制剂。

试验结果表明，多糖是维血宁颗粒中含量最高的一类成分，其中多糖的保留直接关系到维血宁颗粒的内在品质。

本试验建立的多糖测定方法不仅可用于维血宁颗粒的质量控制，而且可用于该制剂二次开发时制备工艺的评价。

参考文献：
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：1142.
[2] 梁家银，亚民，张印清，等.维血宁治疗放、化疗后白细胞减少的疗效观察[J].山东医药，2005，45（1）：70.
[3] 施松善，王顺春.多糖生物活性研究进展[J].生命科学，2011，23（7）：662-670.
[4] 魏舒畅，王继龙，李昶，等.改良差示酚硫法测定红芪粗多糖的方法研究[J].中成药，2013，35（3）：634-636.。