B-DNA-现代生物学仪器分析

圆二色光谱(Circular dichroism spectroscopy) (Ci l di h i t)
杜海宁梁毅
(武汉大学生命科学学院)
手性与圆二色光谱
蛋白质、核酸和多糖等生物大分子都是手性分子
手性(chirality)：具有不能重叠的三维镜像对应异构体 凡具有手性的分子就具有旋光活性
在上世纪六七十年代，旋光色散和圆二色光谱成为研究生物分子结构的有力手段之一
是测定蛋白质二级结构的有力手段之一
平面偏振光
✓振动方向在同一平面内
的电磁波为平面偏振光
✓振动方向保持不变
✓振幅发生周期性变化
旋光色散
●一束平面偏振光通过光学活性分子后，由于左、右圆偏振光的折射率不同，偏振面将旋转一定的角度，这种现象称为旋光(Optical rotation)，偏振面旋转的角度称为旋光度
●朝光源看，偏振面按顺时针方向旋转的，称为右旋，用“+号表示；偏振面按逆时针方向旋转的，称为+”
左旋，用“-”号表示
圆偏振光
✓两束相互垂直，振幅相等的平面偏振光，其位相相差1/4波长时，其合成矢量E的末端轨迹沿着螺旋形旋转,如果对着光的传播方向观察，电场矢量E的末端轨迹为一圆,这就是圆偏振光
✓特点：振幅保持不变而方向周期变化，电场矢量绕传播方向螺旋前进电场矢量方向按顺时针方向旋转的，称为右圆偏振光(dextoratary，用✓(d t t
符号d表示)
✓电场矢量方向按逆时针方向旋转的，称为左圆偏振光(levoratary，用符号l表示)
椭圆偏振光
●振幅相等的左、右圆偏振光合成平面偏振光，其振动方向由左、右圆偏振光的位相决定(图a和b)
●振幅不等的左、右圆偏振光合成椭圆偏振光(图和)，椭圆偏振光常用主
c d)
轴方向和椭圆度来表征它的特性
●主轴方向即椭圆长轴的方向,是由左、右圆偏振光的位相决定的
●椭圆度或椭圆率是一个角度(图中
这个角度的正切是椭圆的短轴与长轴
之比
圆二色性●当一束平面偏振光通过介质时，光学活性分子对左、右圆偏振光的吸收εL 和εR 不同，其差值∆A = A L –A R 或∆ε= εL -εR 就是圆二色性
●摩尔消光系数表示的圆二色性：>0C tt ()()()
11L R L R εεεA A C l mol cm --∆=-=-⋅⋅●如果εL -εR > 0，则CD 为“＋”，相应于正Cotton 效应；如果εL -εR < 0，则CD 为“－”，相应于负Cotton 效应✓∆A 或∆ε均是波长的函数，
∆因此常以∆A λ或∆ελ来表示波
长为λ处的圆二色性吸收
∆✓∆ε或∆A 随波长的变化就是
椭圆率
●椭圆率θ(ellipticity)的正切是椭圆的短轴与长轴之比：
tg θ=●g E E +对于波长为λ的平面偏振光，穿过光学活性物质后，为
2.303180 2.303180()2.303180 2.303180A A A θ⨯⨯=-=∆⨯⨯(εε)εCl Cl =-=∆
平均残基摩尔椭圆率
摩尔椭圆率[θ] (Molar ellipticity)
●](Molar ellipticit)
[θ] = 3298(εL-εR)≈3300∆ε
●在蛋白质研究中，常用平均残基摩尔椭圆率[θ] (the mean residue molar ellipticity [θ] (deg⋅cm2⋅dmol-1)) mean residue molar ellipticity[](deg
[](obs)()
θ] = (θ/10)(MRW/lc
θ
是仪器测定出的CD光谱值，单位是deg，MRW表obs
示蛋白质的平均残基分子量，l表示比色皿的光径，单位是cm，c表示蛋白质的质量浓度，单位是g/ml
g
Jasco J-810
Jasco J-810样品池
圆二色光谱仪是20世纪60年代发展起来的一种分析仪器，它利用光学活性分子具有旋光活性，通过其对偏振光的吸收来分析生物分子结构及相关问题
圆二色光谱仪工作原理
●圆二色光谱仪需要将平面偏振光调制成左圆偏振光和右圆偏振光，并以很高的频率交替通过样品，因而设备复杂，完成这种调制的是CD调制器
●圆二色光谱仪采用氙灯作光
源，其辐射通过由两个棱镜组
成的双单色器后，就成为两束
振动方向相互垂直的平面偏振
光，接着由调制器调制成
CD
左、右圆偏振光。

这两束圆偏
振光通过样品产生的吸收差由
光电倍增管接收检测
CD谱测量中的生物样品为溶液状态。

样品的浓度根据样品的性质、测量的波长范围等因素决定，一般在若干
g g
g/ml至几十mg/ml。

样品池由高度均匀的熔融石英制作的，它不会带来附加的圆二色性，也不会对光产生散射
样品池
CD实验的最佳吸光度在0.8
Typical Initial Concentrations
1.Protein Concentration: 0.5 mg/ml
Protein Concentration:0.5mg/ml
2.Cell Path Length: 0.5 mm
Cell Path Length:0.5mm
3.Stabilizers (Metal ions, etc.):minimum
Stabilizers(Metal ions,etc.):
4.Buffer Concentration :5 mM or as low as possible
Buffer Concentration:5mM or as low as possible while maintaining protein stability
5.Contaminants:Unfolded protein, peptides, particulate
matter (scattering particles)
matter(scattering particles)
圆二色光谱在生物学中的应用
蛋白质的光学活性
蛋白质或多肽中主要的光
学活性基团：
肽链骨架中的肽键
芳香氨基酸残基
二硫键
因而CD可用于蛋白质二、
三级结构和氨基酸微环境
的检测
蛋白质的紫外分区
CD
()
远紫外区(Far-UV CD)：分析蛋白质的二级结构
(1)180-250 nm –反映肽键的CD
肽键是高度有规则排列的，排列方向决定了肽键能级跃迁的分裂情况,二级结构不同，其位置、吸收强度则不相同
, CD
近紫外区(Near-UV CD):分析蛋白质的三级结构
(Near-UV CD)
(1) 250-320 nm –处于不对称微环境的芳香氨基酸残基、二硫键
(2) 可作为光谱探针分析蛋白质不对称微环境的扰动
Far-UV CD 运用Far UV CD 分析蛋白质的二级结构
192 nm 有一正谱带
α-螺旋：222
216-218 nm: 负峰
208有两个负的特征峰
β-折叠:185-200 nm: 正谱带
206β-转角: 206 nm 有一正谱带
无规卷曲：198nm ,220nm 蛋白质二级结构对应的远紫外CD 198 nm 负峰, 220 nm 小而宽
的正峰
分析氨基酸残基的微环境蛋白质中芳香氨基酸残基：
色氨酸(Trp)
酪氨酸(Tyr)
处于不对称微环境时250-320 nm 出现苯丙氨酸(Phe)
二硫键
CD 信号Trp: 279, 284和291 nm
Tyr:277nm Tyr: 277 nm
Phe: 255, 261和268 nm
二硫键: 整个近紫外CD 谱氨基酸的紫外吸收光谱
CD分析蛋白质二级结构的局限性
✓对不同蛋白质之间的差异忽略不计，把CD图谱简单地当作是不同结构组分对应图谱的加合，是一种比较粗糙的处理方式
✓蛋白质的α-helix 的CD 信号会随着螺旋长度的增加变大, 而β-sheet的CD 信号对环境非常敏感
h t CD
研究蛋白质的二级结构
(1)第一类为全α
这类三级结构是由α-螺旋组成的。

全α类型中最简单的
亚类是所谓升降螺旋捆(up-and-down helix bundle)，即相邻的α-螺旋反向排列，头尾相连，形成近似于一个筒形的螺旋捆或螺旋簇。

(2)第二类为平行α/β
这类结构是由α-螺旋和β-折叠链沿着肽链的方向交替存在，并折叠组成多层的结构。

平行β-折叠片层在内部，α-螺旋形成外部覆盖层。

(3)第三类为反平行β结构
像平行α/β类一样，反平行β结构也能形成β筒和单片层，但是它们的拓扑图以及其它结构不同于α/β蛋白质。

反平行β结构中最常见的亚类是所谓的"希腊花边β筒(yβ)。

"(Greek key-barrel
/Bovine Prion Proteins -5
5
b Li Yi t l B Liang, Yi et al., d o Secondary structural changes of rabbit (A),human (C proteins in the absence of a crowding agent.Curve ti l i th b f di t
-100
respectively,in the absence of a crowding agent.10
a
阳离子表面活性剂CPB诱导BSA构象变化
-CD光谱
Far-UV CD(a)and near-UV CD(b)spectra of BSA and BSA in CPB
1.BSA;
2.BSA in1.0⨯10-5M CPB;
3.BSA in1.0⨯10-4M CPB
CD
由远紫外谱可以看出
α-螺旋β-折叠
BSA (a)-1 49% 9.8%
BSA(a)149%98%
CPB+BSA(a)-2 78% 7.6%
CPB+BSA(a)-3 37% 10.5%
()337%105%
由近紫外CD谱可以看出
near-UV CD268nm 天然状态下BSA分子的near UV CD光谱图中在261和268 nm处有最小值，在277和284 nm处有两个肩峰。

当加入CPB后，261和268 nm处的椭圆率增加，而280至300 nm处的椭圆率降低，表明此时氨基酸残基周围
300nm
环境的极性发生了变化，这种变化是由于二硫键的不对称性遭到破坏而引起BSA分子三级结构变化的结果
核酸
fsDNA
15fsDNA ：鱼精DNA e 0
DNA构象的研究
280nm
A-form:
280 nm有正的Cotton效应
243nm 正的强度约为负的强度的3倍
243 nm有负的Cotton效应
B form:278 nm有正的Cotton效应
B-form:
245 nm有负的Cotton效应
28C
C-form:
285 nm有正的Cotton效应(弱)
250 nm有负的Cotton效应(强) Z-form: 290 nm有一负的Cotton效应
A-DNA、B-俯视和平视图：从上往下依次为A DNA B
DNA、Z-DNA；从左往右依次为A-DNA
B-DNA、Z-DNA。

固相圆二色光谱的应用
Hu,et al.Biopolymer,
总结
圆光谱能够帮助我们获得蛋白质或者多肽肽段的●圆二色光谱能够帮助我们获得蛋白质或者多肽肽段的二级结构及其三级结构的折叠信息；
●优点：样品用量少(200 l of 0.5 mg/ml solution
in standard cells), 可精确测定由于环境变化（pH
in standard cells)
值、温度、变性剂）而引起的局部结构的改变。

缺点溶液吸收对测定的干扰(特别是以下区●缺点：溶液吸收对测定的干扰200 nm
域), 绝对测量的不准确性。

●圆二色光谱的结构生物学应用。