多糖类药物分子量及其分布测定

多糖类药物分子量及其分布测定的意义和方法，各种分子量的介绍，介绍国内外分析方法的建立方法及对比，以低分子肝素为例。

有EP & BP 方法和USP 方法 一、原理
•凝胶渗透色谱(Gel Permeation Chromatography, GPC)测定多糖分子量及分子量分布 •或高效分子排阻色谱（High performance size exclusion chromatography, HPSEC) •检测器：紫外( ultra-violet ， UV , 200～400nm)和 • 示差（refractive index, RI)
1. UV 检测器
•具有共轭双键的化合物都具有紫外吸收
共轭双键
→π π 和n → π 电子跃迁，从而导致紫外吸收
由光源产生波长连续可调的紫外光或可见光，经过透镜和遮光板变成两束平行光，无样品
通过时，参比池和样品池通过的光强度相等，光电管输出相同，无信号 产生；有样品通过时，由于样品对光的吸收，参比池和样品池通过的光强度不相等，有信号产生。

根据朗伯—比尔 定律，样品浓度越大，产生的信号越大， 这种检测器灵敏度高，检测下限约为 10-10 g ／ml ，而且线性范围广，对温度和流速不敏感，适于进行梯度洗脱。

2. 示差折光检测器
•示差折光检测器是根据不同物质具有不同折射率来检测的。

•凡是具有与流动相折射率不同的组分，均可以使用这种检测器。

•示差折光检测器分为反射式和折射式两种。

•反射式的原理：光在两种不同物质界面的反射百分率与入射角和两种物质的折射率成正
比。

如果入射角固定，光线反射百分率仅与这两种物质的折射率成正比。

光通过仅有流动相的参比池时，由于流动相组成不变，故其折射率是固定的；光通过样品池时，由于存在待测组分而使折射率改变，从而引起光强度的变化，测量光强度的变化，即可测出该组分浓度的变化。

•示差折光检测器的优点是通用性强，操作简便；缺点是灵敏度低，最小检出限约为
10-7
g/ml 。

• 3.平均分子量的表示方法
数均分子量（Number-average molecular weight ） 按聚合物中含有的分子数目统计平均的分子量 高分子样品中所有分子的总重量除以其分子(摩尔)总数
式中，Wi ，Ni ，Mi 分别为i-聚体的重量、分子数、分子量 i = 1－∞
数均分子量是通过依数性方法(冰点降低法、沸点升高法、渗透压法、蒸汽压法) 和端基滴定法测定
重均分子量（ Weight-average molecular weight ） 是按照聚合物的重量进行统计平均的分子量
C
H C
H C
H C(O)
∑∑∑∑∑
=
=
=
)
(i i
i
i
i
i i
n M W
W N
M N N W
M
i-聚体的分子量乘以其重量分数的加和
式中符号意义同前 测定方法：光散射法
Z 均分子量（Z-average molecular weight ） 按照Z 值统计平均的分子量
测定方法：超离心法
三种分子量可用通式表示：
粘均分子量（Viscosity- average molecular weight ）
对于一定的聚合物－溶剂体系，其特性粘数[η]和分子量的关系如下：
Mark-Houwink 方程K, α方程
K, α是与聚合物、溶剂有关的常数
一般， α值在0.5～0.9之间，故
举例：设一聚合物样品，其中分子量为104的分子有10 mol, 分子量为105
的分子有5 mol, 求分子量
∑∑∑∑==i
i
i
i i i i w M
N M N W M W M 2
i
i i M W Z ≡∑∑∑∑∑∑=
=
=
2
3
2
i
i
i i i
i
i
i i
i
i i M
N M N M
W M W Z
M Z M ∑∑-1
q q
i
i
i
i M
N M N M ＝
3
21===q q q Z
w n M
M M α
η ][M
K =α
α
α
α
1
1
1⎪⎪⎭
⎫
⎝⎛=⎪⎪⎭
⎫
⎝⎛=∑∑∑∑+i
i i i i
i
i v M N M N W M W M w v M M <40000
5
1010
510105
4=+⨯+⨯=
=
∑∑Ni NiMi Mn 85000
10
51010)10(5)10(105
4
2
5242
=⨯+⨯⨯+⨯=
=∑∑NiMi
NiMi Mw
讨论：
M z > M w > M v > M n ，M v 略低于M w
M n 靠近聚合物中低分子量的部分，即低分子量部分对M n 影响较大 M w 靠近聚合物中高分子量的部分，即高分子量部分对M w 影响较大
一般用M w 来表征聚合物比M n 更恰当，因为聚合物的性能如强度、熔体粘度更多地依赖于样品中较大的分子
• 高分子分子量多分散性的表示方法
单独一种平均分子量不足以表征聚合物的性能，还需要了解分子量多分散性的程度 ← 以分子量分布指数表示
即重均分子量与数均分子量的比值，Mw / Mn Mw / Mn 分子量分布情况
1 均一分布 接近 1 (1.5 ~ 2） 分布较窄
远离 1 (20 ~ 50) 分布较宽 4. 高聚物的分子量分布
•高聚物的分子量分布是指试样中各种大小不等的分子量组分在总量中所占的各自的分量，
它可以用一条分布曲线或一个分布函数来表示。

•例如，当我们知道高聚物试样中分子量为Ml M2、 M3、 …、Mi 各组分在总重量中所
占的重量分数分别为W1 W2、 W3、 Wi 时，我们就可以用对应的W 和M 作图，得到分子量分布曲线。

用重量分数(分子数分数也一样)对分子量作图的分布曲线，称为归一化的分布曲线，因为曲线下面的面积总和等于1。

分子量分布曲线有二种画法：用重量分数W 对M 作图的曲线叫微分分布曲线；用累积重量分布对分子量M 作图的曲线叫积分分布曲线。

↑ 分子量分布曲线
将高分子样品分成不同分子量的组分，这一实验操作称为分级 分级的实验方法
•
逐步沉淀分级
• 逐步溶解分级
• GPC(凝胶渗透色谱
可通过曲线形状，直观判断分子量分布的宽窄 分子量分布宽度
•试样间分子量分布宽度的比较，最直接的方法是将实验所得到的分子量分布曲线作对比。

80000
1051010)10(5)10(106
.01
541
6.0516.04≈⎪⎪⎭
⎫
⎝
⎛⨯+⨯⨯+⨯=++v M 98000
)
10(5)10(10)10(5)10(10M
N M 2
5
2
4
3534i
i
i i 2
3
≈⨯+⨯⨯+⨯=
=
∑∑N M z
从归一化的微分分布曲线或积分分布曲线都可以很方便地把定性和定量的差异检查出来。

这种用分子量分布曲线对比的方法在工厂定型产品的对比中很实用。

还有一种更一般化的定量方法，那就是定义一个多分散程度的参数，如用多分散指数来表示。

最常用的是重均数均比Mw／Mn。

这个比值随分子量分布宽度而变化。

在单分散时，Mw／Mn等于1，随着分子量分布变宽，Mw／Mn值逐渐变大。

• 5 高聚物分子量及其分布测定方法
•聚合物溶液，特别是稀溶液，它的物理性质和聚合物的分子量有关。

例如，溶液的渗透压、沸点、冰点都与体系中的分子数目有关，因而由此可测聚合物的数均分子量；又如，溶液的光散射能力与体系中大分子的重量有关，因而由此可测出重均分子量：溶液的黏度与体系中的分子数目、分子大小、分子形状都有关，由此可测出黏均分子量以及分子尺寸。

二、多糖类药物分子量及其分布测定的意义和方法
•多糖是由单糖缩合而成的链状结构物质，是自然界中广泛存在的一类生物大分子。

由于多糖分布的广泛性、结构的复杂性和生物作用的多样性，使人们对它的药用研究越来越重视，它将作为一类高效、低毒、新型药物广泛应用于人类疑难疾病的治疗。

•多糖是天然高分子中具有多分散性的聚合物，为了鉴定一种聚合物，首先必须测定其分子量与分子量分布，这是高分子化合物的最基本参数之一。

•多糖的理化性质及活性与多糖的分子量及其分化有关。

•多糖是天然高分子中具有多分散性的聚合物，为了鉴定一种聚合物，首先必须测定其分子量与分子量分布，这是高分子化合物的最基本参数之一。

•多糖的理化性质及活性与多糖的分子量及其分化有关。

•水相高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)用于多糖的分子量及其分布的测定，它具有快速、高分辨和重现性好等优点，是多糖类药物分子量测定的较理想质控方法。

三、凝胶色谱图的解析
•实验得到的凝胶色谱图在一般情况下纵坐标是浓度检测器的讯号，横坐标是洗脱体积。

一
个典型的高聚物的色谱图如图。

高聚物试样的凝胶色谱图经过适当处理可以换算成分子量分布图并由此可以计算出各种平均分子量。

在作试样间分子量分布的比较时通常采用两种方法：一种是色谱图的直接目视比较； • 另一种是将谱图换算成分子量分布曲线，然后再计算各种平均分子量。

这里所谓归
一化是指把原始色谱图中的纵坐标转换成重量分数。

如果需要得到分子量分布曲线和计算试样的各种平均分子量时，对色谱图要依次作如下步骤的处理： • 1)确定色谱图的基线；
• 2)对色谱图进行归一化处理；
• 3)对色谱图进行峰加宽效应的改正
• 4)结合标定曲线把色谱图的纵横坐标都换算成微分分子量分布曲线所要求的坐标； • 5)按定义计算出各种平均分子量。

•
1) GPC 谱图的归一化处理 就是把原始谱图的纵坐标转换为重量分数，如此便于比较不同的实验结果和简化计算。

具体作法：确定色谱图的基线后，把色谱图下的洗
脱体积等分为20个左右的计算点，记下这些计算点处的纵坐标高度Hi (它正比于各该组分的重量浓度)。

把所有的Hi 加和后得到ΣHi (它正比于被测试样的总浓度)。

那么Hi/ΣHi 就等于各计算点处的组分占总试样的重量分数，以Hi/ΣHi 对V 作图就得到归一化的GPC 图。

四、低分子肝素分子量的测定 分子量测定标准品的结构
在235nm 处有UV 吸收，而原料未分级肝素则无此吸收 1. 一种简便的测定方法 •两个假设：
•1. 所有不同大小分子片段的Na/Nn •Na ：有UV 吸收的片段的摩尔数 •Nn ：无UV 吸收的片段的摩尔数
•235nm 的吸收度可作为测定具有UV 吸收的片段在总片段中的摩尔数，即：UV •2. 不同的RI 值代表质量浓度，RI/UV 代表摩尔质量 •发现当正确的聚合度（n)指定为一个值
•如 n=4, RI/UV 的比值可以规整为整数值如1：2：3相当于各锋片段的聚合度。

因为这一
系列不同片段锋都相差一个双糖，所以这一方法可行。

H
R '
2. EP & BP方法
size-exclusion chromatography.（HPSEC）
•Column: 7.5X 300mm packed with porous silica beads (5 μm), having at least 20 000 theoretical plates per metre and having a fractionation range for proteins of approximately 15 000 to 100 000,室温
•mobile phase:28.4 g/l solution of sodium sulphate R adjusted to pH 5.0 using dilute sulphuric acid R,
•Flow rate: 0.5 ml/min
•Detectors: column —UV —RI.
•Sample & Standard solution: 10mg/ml mobile phase
•Injection: 25 μl
用T为横坐标，logMi为纵坐标作标准曲线，
根据标准曲线计算log2000和log8000算出对应的T值，积分T2000右侧面积A1，用A1/A则计算出<2000的含量；同样
积分T8000左侧面积A2用A2/A则计算出>8000的含量
3. USP 方法
•Column: 6X400 mm保护柱－7.8 X 300 分析柱两个
•柱温：室温
•Mobile phase:0.5M 硝酸锂0.45 μm膜过滤
•Calibration solution: A和 B 2mg/ml
•Detectors: column —UV —RI.
•Sample & Standard solution: 10mg/ml mobile phase
•Injection: 20 μl
计算
•校正曲线：用A和B校正液测定的T为Y轴，Mi为X轴
•GPC软件测定
•如果计算结果标准品的Mw与表示值的差值在150以内，则校正曲线可用。

•然后计算样品。