禽呼肠孤病毒SYBR Green I荧光定量PCR检测方法的建立

禽呼肠孤病毒SYBR Green I荧光定量PCR检测方法的建立李天芝;于新友;王金良;沈志强
【摘要】为了建立禽呼肠孤病毒（ARV）快速、敏感的检测方法。

本研究利用
RT-PCR技术扩增出ARV S1基因中298bp的保守序列，并克隆到pMD18-T载
体中作为标准品制作标准曲线，建立了ARV的SYBR Green I 荧光定量PCR 检测方法。

该方法检测灵敏度可达4.8×101拷贝，与NDV、AIV、IBV、IBDV、ALV、REV 均不发生交叉反应，具有良好的特异性和重复性。

结果表明，建立的实时荧
光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点，可用于临床ARV的检测。

%To develop the SYBR Green I real-time quantitative PCR assay for detection of Avian reovirus (ARV), a 298bp conservative region from ARV
S1 gene was amplified by RT-PCR and cloned into pMD18-T vector to construct recombinant plasmid of pMD18-S1,which was served as template to establish the standards curve of the SYBR Green I rea1 time PCR. The results showed that the SYBR Green I real-time PCR was specifically detected ARV with a limi ted detection of 4.8 ×101copies and
no amplification for NDV、AIV、IBV、IBDV、ALV and REV. There data suggested that the SYBR Green I real-time PCR could be applied in clinical diagnosis and epidemiological investigation for ARV.
【期刊名称】《家禽科学》
【年(卷),期】2015(000)010
【总页数】5页(P10-14)
【关键词】禽呼肠孤病毒;S1基因;SYBR Green I;荧光定量PCR
【作者】李天芝;于新友;王金良;沈志强
【作者单位】山东绿都生物科技有限公司，山东滨州 256600;山东绿都生物科技
有限公司，山东滨州 256600;山东绿都生物科技有限公司，山东滨州 256600; 山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州 256600;山东绿都生物科技有限公司，山东
滨州 256600; 山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州 256600
【正文语种】中文
【中图分类】S858.314.4+3
禽呼肠孤病毒(avian reovirus，ARV)可感染鸡、鸭、鹅等禽类，感染鸡主要表现
为关节炎和腱鞘炎，也可引起呼吸道病、肠道病、矮小综合征和吸收障碍综合征等[1]。

ARV与其它免疫抑制病的混合感染也普遍存在鸡群中[2]，使鸡对其它传染病的易感性增加，死亡率、淘汰率升高，生长缓慢或停滞，从而导致饲料报酬率降低、种鸡产蛋率下降等；番鸭感染后的临床症状表现有软脚、腹泻等，病理变化则主要以多器官的局灶性坏死为特征，死亡率高达98%；雏鹅感染后也可表现为关节炎，病理变化主要是肝、脾坏死，因此，给养禽业造成巨大的经济损失[3]。

1954年，Fahey和Craloley首次从慢性呼吸道病鸡体内分离到ARV。

此后，英国、美国、意大利等相继报道了ARV感染引起的疾病，20世纪80年代我国也有ARV引起
疾病的相关报道。

ARV属呼肠病毒科、正呼肠病毒属，基因组为线性双股RNA，由分节段的10个基因片段组成，根据核酸电泳迁移率可分成3组，即3个大基因节段(L1、L2、L3)，3个中基因节段(M1、M2、M3)，4个小基因节段 (S1、S2、S3、S4)，P10基因是S1节段的一部分，可编码感染细胞后细胞膜融合相关蛋白。

目前，ARV诊断方法主要有病毒分离鉴定[4]、ELISA[5]、荧光抗体检测[6]、核酸
探针[7]、RT-PCR[8]、套式RT-PCR[9]等方法，有的操作繁琐，诊断时间长，结果重复性不好，有的难以检测出微量病毒，不适宜疾病早期诊断，荧光定量PCR 是近几年发展起来的病原分子检测技术，与常规RT－PCR比较，具有重复性好、灵敏度高、定量准确、高通量等优点，是低拷贝病原检测的重要方法，已经被应用于多种疾病的检测。

本实验据ARV S1基因保守序列设计1对引物，建立ARV SYBR Green I荧光定量RT－PCR检测方法，为快速检测ARV提供了一种新的方法。

1.1 病毒株与病料禽呼肠孤病毒（ARV）、新城疫病毒（NDV）、H9N2亚型禽流感病毒(AIV)、传染性支气管炎病毒（IBV）、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、禽白血病病毒(ALV)和禽网状内皮组织增生病病毒(REV)由山东省滨州畜牧兽医研究院预防兽医学与动物生物技术重点开放实验室保存，临床检测病料为2014年10月～2015年6月采自山东省各地鸡场临床诊断为呼肠孤病毒感染的鸡附关节、关节液、脾脏等。

1.2 主要试剂和仪器 pMD18－T载体和反转录试剂盒；限制性内切酶、PCR相关试剂、DNAMarker，DNA凝胶回收试剂盒购自大连宝生物公司，TRIzol试剂购自上海生工生物工程有限公司，SYBR GreenⅠ购自美国应用生物系统公司，实时荧光定量PCR仪购自美国应用生物系统公司（7300型）。

1.3 RT-PCR引物设计与合成应用 Primer Premier 5.0基因分析软件，参照GenBank中登录的序列（AF330703）设计1对引物，扩增ARV S1基因部分片段298bp，引物由上海生物工程技术有限公司合成。

上游引物：5′－ATGCTGCGTATGCCTCCCGGT－3′
下游引物：5′－TCAAACGTCGTTATGGCGGA－3′
1.4 ARV S1基因的RT-PCR 参考TRIzol试剂说明书提取组织毒总RNA，提取的RNA用无RNase水溶解沉淀，以其为模板，按照反转录说明书进行cDNA的合
成，随后进行PCR或置于－20℃保存。

PCR扩增体系如下：反应总体系为25μl，其中Premix Taq 12μl，cDNA 2μl，上、下游引物各0.5μl(50μmol/L)，加去离
子水至25μl。

反应程序为：95℃ 5min；94℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 20s，35个循环后；72℃ 10min。

扩增后用质量分数为2%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.5 制备重组质粒标准品将PCR产物纯化回收后连接到pMD18－T载体构建重
组质粒pMDS1，重组质粒由宝生物公司测序验证。

将重组质粒pMD－S1利用紫外分光光度计测定其在260nm和280nm处的吸光度，并计算出质粒中的DNA浓度和纯度，并进行10倍倍比梯度稀释，作为阳性
定量标准模板，用于荧光定量PCR的扩增和标准曲线的建立。

1.6 荧光定量 PCR的扩增及标准曲线的制备以10倍梯度稀释的已知拷贝数的重组质粒为模板进行荧光定量PCR扩增，并通过预试验对ARV S1基因的SYBR Green I荧光定量PCR的反应条件进行优化，最终确定其最佳反应体系和反应条
件如下：25μl反应体系中依次加入上、下游引物各1μl，SYBR Green I Premix
聚合酶12.5μl，模板1μl，灭菌去离子水9.5μl，反应的循环参数为95℃，5min；95℃ 20s、55℃ 20s、72℃ 20s，共40个循环。

并利用随机软件进行分析，得到动力学曲线及标准曲线。

1.7 荧光定量PCR特异性、敏感性、重复性试验用建立的荧光定量PCR方法对ARV、NDV、AIV、IBV、IBDV、ALV、REV进行特异性检测。

将模板质粒做10
倍梯度稀释，用荧光定量PCR进行扩增，以此测定荧光定量PCR所能检出的最低模板的拷贝数，并与普通PCR比较。

选取同一批次的3个不同浓度和不同批次3
个不同浓度的质粒标准品作为模板，为评价标准品的稳定性，在同一批次试验中进行测定和在不同批次试验中进行测定，同时设NTC。

1.8 临床样品检测用建立的荧光定量PCR法对从山东省各地收集的临床疑似病料60份进行ARV检测，同时用常规PCR法进行检测，并比较二者的阳性检出率。

2.1 目的基因PCR扩增及克隆利用RT－PCR技术进行目的片段的扩增，琼脂糖
凝胶电泳初步检测表明，扩增产物约为298bp，与预期结果相符(图1)。

将扩增的目的片段纯化后，克隆于pMD18－T载体中，构建重组质粒pMD－S1，将其测
序结果与GenBank中ARV S1基因的相应片段进行比较，结果证实该扩增产物与ARV S1基因的相应区域的同源性为100%。

2.2 荧光定量PCR标准曲线的建立以预试验筛选的5个稀释度的重组质粒作模板，进行荧光定量PCR扩增，生成动力学曲线和标准曲线，如图2所示，曲线1～5
所对应的重组质粒模板浓度分别为4.8×108，4.8×107，4.8×106，4.8×105，4.8×104拷贝，曲线6是阴性对照(即NTC)，未发生扩增，线性回归方程为 Ct＝－3.361×lgcopies＋40.37 （R2＝ 0.9996）。

在SYBR Green I荧光定量PCR
完成后进行熔解曲线分析，扩增产物的溶解温度Tm为84.8～85.3℃，无非特异
性产物和引物二聚体的峰值出现，标准品均一稳定。

2.3 特异性检验按照所建立的SYBR Green I荧光定量反应体系对ARV、NDV、AIV、IBV、IBDV、ALV、REV的阳性样品进行荧光定量PCR检测，只有ARV的样品孔出现了单一的s型扩增曲线 (图3)，表明所建立的针对ARV的荧光定量PCR方法具有较强的特异性。

2.4 敏感性试验将制备的质粒模板10倍倍比稀释，并分别以此为模板进行荧光定量PCR扩增，得到不同浓度的质粒标准模板的real－time PCR扩增曲线，曲线1～6所对应的重组质粒模板浓度分别为4.8×105、4.8×104、4.8×103、
4.8×102、4.8×101、4.8×100拷贝，结果显示其灵敏度为4.8× 101拷贝，与常规PCR结果对比，荧光定量PCR的灵敏度比常规PCR高100倍（图4）。

2.5 重复性检验为了验证荧光PCR检测结果的重复性，选取3个标准品进行批内
和批间重复性测定，结果样品的Ct值及Tm值批内重复性试验CV值均小于2.0%，批间重复性试验CV值均小于1.0%，表明本方法的重复性好（表1）。

D组阴性
对照组，未检测到荧光信号。

2.6 临床样品检测分别用建立SYBR Green I荧光定量PCR和普通PCR方法，对临床收集的60份疑似ARV样品进行检测，检测结果为：SYBR Green I荧光定量PCR检测到25份阳性、35份阴性，而普通RT-PCR检测到15份阳性、45份阴性。

表明该SYBR Green I荧光定量方法对于ARV的检测比普通RT-PCR方法灵
敏度高，能检出普通RT-PCR不能检出的病料。

SYBR Green I荧光定量 PCR是荧光定量PCR的一种，是在反应体系中加入过量SYBR荧光染料，荧光染料只有特异地掺入DNA双链后才发出荧光，随着PCR产物的增加荧光信号也增强，该方法现在也用于一些动物疾病的诊断中。

本试验所建立的SYBR Green I实时定量PCR方法熔解曲线只出现特异的单个峰，产物的Tm 值均一，表明没有引物二聚体及非特异性扩增产物出现；检测灵敏度可达48个拷贝，具有很好的重复性。

将建立的荧光定量PCR方法初步用于临床疑似病料的检
测中，并与实验室已建立的RT-PCR方法进行比较，结果显示：与常规RT-PCR
相比较，本试验所建立的方法不但可以定性检测ARV，还可以定量检测ARV，而且能够检测出常规RTPCR无法检测的病料，同时也免去了DNA水平电泳的步骤，更加省时且操作简单。

因此，该方法具有快速、灵敏、特异、定性、定量等优点。

本试验以ARV最保守的S1基因为目的基因，成功建立了SYBR Green I荧光定量PCR检测方法，该方法只对ARV cDNA有阳性扩增信号，对NDV、AIV、IBV、IBDV、ALV、REV均无特异性反应，表明其具有高度特异性，该方法的表达公式
Ct＝－3.361×lgcopies＋40.37，相关系数 R2＝0.9996，Efficiency为1.984，对质粒标准品最低检测限为4.8×101拷贝，比常规PCR敏感性强100倍，这说
明所建立的SYBR Green I实时定量PCR方法具有良好的稳定性和重复性，标准
曲线相对理想，具有较好的实用性。

可用于ARV感染的分子流行病学调查和ARV
的早期诊断，为研发ARV的新型分子诊断技术奠定了基础。

【相关文献】
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