荧光定量PCR仪的边缘效应与实验误差分析

荧光定量PCR仪的边缘效应与实验误差分析
郑卫东;袁仕伟
【摘要】Objective To explore the reasons for the edge effect and experimental error of the quantitative fluorescence PCR instrument. Methods The light systems and heating modules of some PCR instruments from foreign countries were compared. Results The deficiencies in design of the light system and the uneven temperature in heating holes were the main reasons for the edge effect and experimental error, which affected the repeatability of the experimental result. Conclusion The principles of different brands of quantitative fluorescence PCR instruments have to be mastered to eliminate experimental errors and ensure the accuracy of the result.%目的:探讨荧光定量PCR分析仪边缘效应及实验误差的原因.方法:通过比较部分国外知名品牌荧光定量PCR仪的光路系统及加热模块设计原理,分析边缘效应及实验误差产生的原因.结果:传统荧光定量PCR仪光路设计缺陷和加热模块的孔间温度均一性不足会导致边缘效应和实验误差,是影响荧光定量PCR结果重复性的重要原因.结论:了解不同品牌荧光定量PCR仪的检测原理,选购性能优良的荧光定量PCR仪,尽量避免实验误差,以保证实验结果的准确性.
【期刊名称】《医疗卫生装备》
【年(卷),期】2013(034)002
【总页数】3页(P113-115)
【关键词】荧光定量PCR仪;边缘效应;实验误差
【作者】郑卫东;袁仕伟
【作者单位】湖北医药学院附属人民医院检验部,湖北十堰442000
【正文语种】中文
【中图分类】R318.6;TH773
0 引言
荧光定量PCR仪主要由PCR和荧光检测系统组成。

目前，商品化的荧光定量PCR仪种类繁多。

国外的品牌主要有ABI、Roche、MJ、Bio-Rad、Stratagene、Corbtt、Cepheid 等，国内也有荧光定量PCR仪的生产[1]。

对于定量PCR系统来说，重要的参数除了传统PCR的温控精确性、升降温速度等，更重要的还在于
样品孔之间的温度均一性，以避免微小的差别被指数级放大[2]。

至于荧光检测系统，多色多通道检测是当今的主流趋势——仪器的激发通道越多，仪器适用的荧
光素种类越多，仪器适用范围就越宽。

荧光检测系统主要包括激发光源和检测器。

监测系统有超低温CCD成像系统和光电倍增管（PMT），前者可以一次对多点成像，后者灵敏度高但一次只能扫描一个样品，需要通过逐个扫描实现多样品的检测，扫描大量样品需要较长的时间。

边缘效应和实验误差是影响定量PCR结果重复性的2个重要原因。

但这两者的来
源不同，前者来源于仪器硬件，后者来源于各种因素的干扰，是2个不同的概念。

针对这2种误差，本研究对其产生的原因及解决方法进行探讨，供同行参考。

1 定量PCR边缘效应产生的原因
（1）光路设计缺陷是造成边缘效应产生的主要原因。

对于边缘效应来说，采用CCD检测器的定量PCR仪或多或少都会存在该问题。

该问题主要来源于仪器的光
路设计缺陷和控温模块性能的不稳定。

传统的PCR仪光路设计采用的是CCD的
检测器，它把卤钨灯光源的光通过反射镜照射到96孔样品槽上，由于边缘孔和中间孔的光程不一样，所以光的能量在96孔的分布不均，孔间的荧光基团获得的激发光能量有差异，导致96孔间荧光基团发射荧光的强度不一致，影响最终的实验结果。

另外，CCD的信号采集模式属于96孔同时采集，很容易造成孔间信号干扰，如图1、图2所示。

图1 传统定量PCR仪光路设计
为了避免该问题，后续研发的定量PCR仪都采用新的仪器设计概念。

目前应用的
较成功的是逐孔独立扫描的设计。

如Agilent Stratagene的MX系列定量PCR仪，其光路设计原理采用石英卤钨灯光源，光通过不同的滤光镜过滤获得特异波长的激发光，由300根小光纤组成的光纤束传递到单个样品孔，激发荧光基团。

每个孔
都是独立激发，所以光的强度是一致的。

另外，荧光基团的发射光也是逐孔扫描检测，并通过光纤传递到检测器，这种设计有效地避免了边缘效应和孔间干扰，如图3所示。

图2 96孔板的孔间光强不一致
图3 同轴光纤扫描设计，避免边缘效应
（2）除了光路原因，加热模块的孔间温度均一性不足，也是造成边缘效应的重要原因。

按照仪器的加热性能，可以将荧光定量PCR仪为2 类[1]:①一类是半导体（半导体＋电热丝）加热。

硅加热是使用最普遍的一种，具有导热好、易自动化、速度快、直接加热降温、效果好的特点，但由于其使用的介质是金属，与反应管很难做到无缝接触。

ABI、MJ等多数仪器都属于这一类。

②另一类是空气加热。

用
空气做介质可与反应体系无缝接触，但是空气具有导热性差、比热小的缺点。

Roche的Roche LightCycler荧光定量PCR仪、Corbett的Rotor-Gene荧光定量PCR仪均属此类。

孔间均一性主要是指96孔样品槽中任意两孔间温度差异大小。

完美的温度一致性是很难达到的。

以下是第三方机构对不同品牌的定量PCR仪控温模块做的比较测定（如图4所示），以及主流品牌的控温均一性参数，见表1。

图4 国外部分品牌的加热模块温度均一性比较
表1 部分品牌的荧光定量PCR仪公开温度均一性参数比较荧光定量PCR仪升降温方式温度均一性/℃AgilentMx3005P Peltier半导体±0.25 ABI Prism7500 Peltier半导体±0.5 Bio-RADCFX96 Peltier半导体±0.4 Eppendorf:Realplex4 Peltier半导体±0.4
2 实验误差产生的原因
2.1 核酸样本的提取
荧光定量PCR实验影响因素众多，实验的成功与否，与备检样本核酸的提取、所用试剂的质量等因素有直接的关系，而作为PCR技术必不可少的扩增仪，其性能的好坏直接影响到扩增效率[3-5]。

以HBV-DNA定量为例，国内大多数有批文的试剂盒均采用煮沸裂解法[6]。

该法具有样品处理时间短、核酸提取效率较高和操作简单等优点，但存在处理后样品中杂质较高干扰PCR反应、短时间内病毒核酸从Dane颗粒中裂解释放不完全等缺陷[7]。

为克服上述缺陷，后期研发的HBV-DNA试剂核酸提取改良为:核酸浓缩-弃上清-再加核酸提取液，以去除样品中杂质的干扰。

2.2 试剂质量
荧光定量PCR检测项目繁多，试剂质量的好坏，直接影响到检测结果的准确性。

目前，多数医院荧光定量PCR仪为国外品牌公司的仪器，尤其ABI公司的系列荧光定量PCR仪占有较大的市场份额，试剂开放。

以HBV-DNA定量为例，使用的试剂多为广州达安、深圳匹基等国产试剂。

而Roche公司Lightcycler系列定量PCR仪，试剂专一，价格昂贵，使其市场受到限制。

各医院仪器、试剂的差异，
其检测结果是否具有可比性？文献报道甚少，本研究认为唯一可行的办法是参加卫生部或各省临床检验中心的室间质量评价活动，从反馈的质评结果来评价本室检测结果的准确性。

此外，部分国产试剂中提供的标准品浓度未必准确，如广州达安公司的HBV-DNA标准品，通过大量室间质评反馈结果分析，其标准品浓度应提高
一个数量级，才符合实际浓度，编程时标准品浓度应加以改变，如1E4改为1E5，1E5改为1E6等。

2.3 仪器的影响
荧光定量PCR仪对检测结果的影响，文献报道较多。

王火生等[8]用同一试剂分别在 PE7000、BioRad-icycler及Roche-Lightcycler定量PCR扩增仪平行测定，
结果显示:3种仪器的检测结果无差异，但BioRad-icycler仪器对HBV-DNA低拷贝含量标本检测值偏低，PE7000型仪器具有操作简单、耗材低廉、检测数据稳定及价格适中等优点，更适合于临床。

Roche-Lightcycler具有仪器价格低廉、检测快速、结果稳定等优点，但操作相对复杂、耗材较贵且检测样本量较少，更适合于临床小样本检测及科研工作。

喻晶等[9]用MJ Opticon 2及ABI 7300荧光定量PCR仪检测HBV-DNA和HCV-RNA，评价2种仪器检测结果的一致性。

结果显示:M J Opticon 2及ABI 7300检测结果具有较好的一致性，可用于同时检测HBV DNA或HCV DNA。

黄薇等[10]将1款进口荧光定量PCR仪与2款国产的
仪器进行比较，结果显示:进口仪器A、国产仪器B 2组间的差异无统计学意义，
而仪器A、国产仪器B与国产仪器C组间差异有统计学意义。

通过对样品检测Ct 值均数的分析，C组的Ct值明显大于A、B 2组，其灵敏性低于前2组，这表明
荧光定量PCR仪性能对实验结果有显著影响。

章林华等[11]系统地总结了ABI PRISM 7000型荧光定量PCR仪样品孔槽污染、扩增曲线多波折、边缘效应、滤
光片霉变等常见故障及排除方法，尽管该型仪器厂家已停产，但国内仍有不少实验室在使用，其故障具有一定的代表性，对该仪器的操作者具有较大的指导价值。

3 结语
综上所述，导致荧光定量PCR仪边缘效应产生的主要原因有2个:一是光路设计的原理不同；二是加热模块温度均一性的差异。

在选购定量PCR仪之前，我们需要先了解仪器的设计原理，尽量选择没有边缘效应的PCR仪。

随着科学技术的加速发展，不断有新的荧光素、标记方法和试剂盒面市，选购定量PCR仪时还要考虑仪器性能在将来的可拓展性等。

对于实验误差来说，最有效的方法是建设标准化的实验室，规范实验流程，操作者持证上岗，严格控制PCR反应各个环节，选择质量可靠的试剂。

由于多数国产HBV-DNA定量试剂无ROX染料校正，无法完全克服边缘效应。

为解决此问题，建议操作者每次实验时必须做室内质控，试剂盒内的临界值、高值质控品就是良好的质控物，同时每次实验至少带3个标准品，把误差降低到可以接受的范围。

不少实验室为节约成本，往往只做1次标准曲线，用Excel绘制表格，以后待测样品测定的Ct值就套用以前公式计算样品的浓度。

由于PCR反应影响因素太多，灯泡寿命的衰减、背景荧光的变化、ROIs（增益范围）的定期校准等都会影响仪器的性能，因此上述做法是错误的，必须制止。

[参考文献]
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