分析化学第11章--荧光分析法

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6 1.光源 2.4.7.9.狭缝 3.激发单色器 5.样品池 6.表面吸光物质 8.发射单色光 10.检测器 11.放大器 12.指示器 13.记录器
12
8 9
11 13 图
10
荧光分光光度计结构示意图
光源：氙灯，高压汞灯 单色器：滤光片，光栅 检测器：光电倍增管
荧光分析新技术
• 时间分辨荧光分析 在激发和检测之间延缓一段时间，使 具有不同荧光寿命的物质达到分别 检测的目的。 光源：脉冲激光 应用：免疫分析
加，荧光效率提高，荧光波长长移。
常见给电子基团：
－NH2,－OH,－OCH3,－NHR,－ NR2，－CN。
b.吸
硝基苯
F=0
λem:——
吸电子取代基使π电子共轭程度降 低，使荧光减弱甚至熄灭。 常见吸电子取代基： －COOH,－NO2,－C=O,－NO,－SH, －NHCOCH3,－F,－Cl,－Br,－I.
λex 水 乙醇 环己烷 四氯化碳 248 271 267 267
—
313 350 344 344 320
365 416 409 408 375
405 469 459 458 418
436 511 500 499 450
选择激发光波长时，应使溶剂不干扰 测定。
11.3 定量分析方法
一、荧光强度与物质浓度的关系 • 荧光强度F正比于吸收的光量子Ia和荧 光量子效率 ： F = Ia Ia= I0 - I F∝(I0 - I)
光子和物质分子发生非弹性碰撞光子运动方向发生改变也发生能量交换光子把部分能量转移给物质分子或从物质分子获得部分能量发射出比入射光稍长或稍拉曼光对荧光测定干扰较大
第11章 荧光分析法
概述 基本原理 定量分析方法 荧光分析技术及应用
11.1 概述
1.光致发光：物质受到光照射时，除 吸收某种波长的光之外还会发射出比 原来所吸收光的波长更长的光，这种 现象称为光致发光。
3.荧光光谱特征 1）斯托克斯位移(Stokes shift) λ 荧光 > λ激发光 2）荧光光谱的形状与激发光波长无关。 3）荧光光谱与激发光谱成镜像关系。
荧光激发光谱
荧光发射光谱
200
250
300
350
400
450
蒽的激发光谱和荧光光谱
500 nm
二、分子结构与荧光的关系 (一)荧光寿命和荧光效率 1.荧光寿命(fluoresce lift time)当除去 激发光源后，分子的荧光强度降低 到最大荧光强度的1/e所需的时间， 常用τf表示。 荧光物质从激发态到基态的变化用 指数衰减定律表示：
• 同步荧光分析 在荧光物质的激发光谱和荧光光谱中 选择一适宜的波长差值△λ，同时扫 描荧光发射波长和激发波长，得到 同步荧光光谱。 Fsp(λem,ex) = KcFexFem
2.荧光(fluorescence)：物质分子接受 光子能量被激发后，从激发态的最低 振动能级返回基态时发射出的光。
3.荧光分析法(fluorometry)：根据物质 的荧光谱线位置及其强度进行物质鉴定 和含量测定的方法。 荧光分析法的优点： 灵敏度高;选择性好; 检测限达10-10g/mL,最低可达10-12g/mL。
3
S2*
V4 V3 V2 V1 V0
c
b
S1*
V4 V3 V2 V1 V0
4
V4 V3 V2 V1 V0
f
T1*
E
a
a
d
e
g
S0 5
λ1 λ2 λ3 λ4 2 图 荧光和磷光产生示意图
1
a. 吸收 b. 振动驰豫 c. 内转换 d. 荧光 e. 外转换 f. 体系间跨越 g. 磷光
b.内部能量转换(internal conversion): 简称内转换，当两个电子激发态之 间的能量相差较小以致其振动能级 有重叠时，受激分子常由高电子能 级以无辐射方式转移至低电子能级 的过程。如S2* S1*
b.与金属离子形成络合物 如：8－羟基喹啉和8－羟基喹啉镁
O H N O
N
Mg
8-羟基喹啉
8－羟基喹啉镁
弱荧光
强荧光
刚性和共面性增加，可以发射荧光或增 强荧光。
c.位阻效应
NaO3S
N(CH3)2 NaO3S N(CH3)2
1-二甲氨基萘-7-磺酸钠 f＝0.75
1-二甲氨基萘-8-磺酸钠
f ＝0.03
2.荧光效率(fluorescence efficiency) 又称荧光量子产率(fluorescence quantum yield),指激发态分子发射荧 光的光子数与基态分子吸收激发光 的光子数之比，常用i 表示。
发射荧光的光子数 i 吸收激发光的光子数
0< <1
i
(二)有机化合物分子结构与荧光的关 系 发射荧光的物质必须具备两个基本条 件： 1）有强的紫外－可见吸收； 2）具有一定的荧光效率。 1.长共轭结构 芳香环或杂环化合物，一般能产生荧 光，具有长共轭的π π* 跃迁。
11.2 荧光分析法的基本原理
一、分子荧光 (一)分子荧光的产生 1.分子的电子能级与激发过程 1)分子的电子能级 △E= △Ee +△Ev+ △Er
2)电子能态的多重性： M=2S+1 S:总自旋量子数。S＝s1+s2 对于 S=1/2 +(-1/2)=0 M=2S+1=1 对应基线单重态； 对于激发态 s1=1/2,s2=1/2, S=1/2+1/2=1, M=2×1+1=3 三重态
2.辐射跃迁 a.荧光发射：处于任一激发单重态的 分子，通过内转换及振动驰豫，可回 到第一激发单重态的最低振动能级， 然后再以辐射形式发射光量子而返回 至基态的任一振动能级，这时发射的 光量子称为荧光。 特点：△E激发光> △E荧光 λ激发光<λ荧光
b.磷光发射：经过体系间跨越的分 子再通过振动驰豫降至激发三重态 的最低振动能级，分子在激发三重 态的最低振动能级可以存活一段时 间，然后返回至基态的各个振动能 级而发出光辐射，称为磷光。 特点： △E激发三线态<△E激发单线态
拉曼光对荧光测定干扰较大。 消除拉曼光的方法： 选择适当的激发波长。
瑞利光
瑞利光
拉曼光
拉曼光
结论：无论选择320nm或350nm为 激发光，荧光峰总是在448nm. 而空白溶剂分别在320nm及 350nm激发光照射下测定，测得 的实际上是散射光而非荧光。
表 在不同波长激发光下主要溶剂的拉曼光波长
Ft F0e
Kt
激发后时间t时的荧光强度
衰减常数
Ft F0e
若t=τf,Ft=F0e-1,则K=1/τf F0 t ln Ft i
Kt
激发态t=0的荧光强度
以ln(F0/Ft)对t作图，直线斜率即为1/τf
• τf与吸光过程的吸光系数存在以 下关系： τf ≈10-5/εmax(s) • 荧光寿命常为10-8~10-10s 。 • 利用荧光分子寿命的差别，可以 进行荧光物质混合物的分析。
pH>13 无荧光
4.荧光熄灭剂 1）荧光熄灭(荧光焠灭)：荧光物质 分子与溶剂分子或其他溶质分子相 互作用引起荧光强度降低的现象。 2）荧光熄灭剂(quenching medium):引 起荧光熄灭的物质。如：卤素离子， 重金属离子，氧分子，硝基化合物， 重氮化合物，羰基，羧基化合物。
3）荧光熄灭法(fluorescence quenching method):在荧光物质中加入某种熄灭 剂后，荧光强度的减弱与荧光熄灭 剂的浓度呈线性关系，利用这一性 质测定荧光熄灭剂的含量，称为荧 光熄灭法。
FS F0 CS FX F0 C X
FX F0 CX CS FS F0
11.4 荧光分光光度计
1.荧光分光光度计的主要部件 由激发光源、激发单色器(置于样 品池前)、发射单色器(置于样品 池后)、样品池、检测系统组成。
岛津RF-5301PC型荧光分光光度计
5 1 2 3 4
2.荧光光谱： 固定激发光波长 (λex)，改变荧光 波长(λem) ，测 定F,以 λem 为横 坐标，F为纵坐标 作图，得荧光光 谱.
F
a
b
300 图
400
500 nm
硫酸奎宁的激发光谱(a) 和荧光光谱(b)
两个光谱的作用： 1）可用来鉴别荧光物质； 2）进行荧光测定时选择适当测定 波长的依据。
• 单重态与三重态的区别 1）电子自旋方向不同； 2）激发三重态的能量稍 低一些。 2.荧光的产生 1）激发过程： hv 基态分子 激发单重态(s1*,s2*) 激发三重态
2）激发态能量传递途径
传递途径
辐射跃迁
荧光 磷光
无辐射跃迁
系间跨越内转换 外转换 振动弛豫
1.无辐射跃迁 a.振动驰豫(vibrational relexation): 处于激发态各振动能级的分子通过 与溶剂分子的碰撞而将部分振动能 量传递给溶剂分子，其电子则返回 到同一电子激发态的最低振动能级 的过程。 如：S1*:V4,V3,V2,V1 V0
λ磷光>λ荧光
(二)荧光的激发光谱和发射光谱 荧光物质的两个特征光谱 1.激发光谱(excitation spectrum): 表示不同激发波长的辐射引起的物质 发射某一波长荧光的相对效率。 固定荧光波长(λem) ，改变激发光波 长(λex) ，测定F荧光强度，以激发 光波长(λex)为横坐标，荧光强度为 纵坐标作图，得激发光谱。
c. －R,－SO3H,－NH3+等取代基 对π电子共轭体系作用小，对荧光 作用不明显。
三、影响荧光强度的外部因素
1.温度 T ,f
,F
2.溶剂 溶剂极性增强， λem 长移，F 溶剂粘度 ，F
3.酸度 如：苯胺
NH3+ OHH+ NH2 OHH+ NH-
pH<2 无荧光
pH=7~12 蓝色荧光
由朗伯-比耳定律： • I=I0×10-εcl • Ia = I0(1-10 - l c ) • F = I0(1-10- l c ) = I0(1-e-2.3 l c ) 当 l c <0.05时， F=2.3K′I0ECl=KC ——荧光定量的依 据。
二、定量分析方法 1.校正曲线法 以荧光强度为纵坐标，对照品溶液的 浓度为横坐标绘制校正曲线，在同 样条件下测定试样溶液的荧光强度， 由校正曲线求出试样中荧光物质的 含量。
位阻效应使分子共面性下降，荧光减弱。
d.顺反异构体
H
C=C
H
H
C=C
H
反式1,2-二苯乙烯 强荧光
顺式1,2-二苯乙烯 无荧光
反式有荧光，顺式无荧光。
3.取代基的影响 a.给电子取代基
OH
苯 F=10
λem:270~312nm
苯酚
F=18
λem:285~365nm
给电子取代基使分子的共轭程度增
c.外部能量转换(external conversion)
简称外转换，溶液中的激发态分子 与溶剂分子或与其他溶质分子之间相 互碰撞而失去能量，并以热能的形式 释放能量的过程。 外转换常发生在第一激发单重态或激 发三重态的最低振动能级向基态转换 的过程中。
d.体系间跨越(intersystem crossing): 处于激发态的电子发生自旋反转而使 分子的多重性发生变化的过程。 如：S1* T1*
苯 λex 205nm λem 278nm f 0.11
萘 286nm 321nm 0.29
蒽 356nm 404nm 0.36
π电子共轭程度越大， f 越大 ，荧光 波长长移。
2.刚性平面结构 a.刚性结构与非刚性结构 如联苯和芴
联苯 f＝0.2
芴 f＝1.0
分子的刚性和共面性越强，荧光效率 越大。
F-F0
100 80
· ·
------------------------------
60
40 20
·
0.2 0.4
·
·
0.6
Cx 0.8 1.0
1.2 C(µ g/ml)
荧光法测定硫酸奎宁标准曲线
2.比例法 当校正曲线通过原点，可取已知量的 对照品配制一对照品溶液(Cs),使其 浓度在线性范围内，测定荧光强度 (Fs),在同样条件下测定试样溶液的 荧光强度(FX),按比例关系计算荧 光物质的含量。
5.散射光(scattering light)： 定义：当一束平行单色光照射在液体 样品时，大部分光线透光溶液，小 部分由于光子和物质分子相碰撞， 使光子的运动方向发生改变而向不 同角度散射，称散射光。 包括瑞利光和拉曼光。
a.瑞利光(Reyleigh scattering light):光子和 物质分子发生弹性碰撞，不发生能量交 换，仅仅是光子运动方向发生改变，波 长与入射光波长相同。 b.拉曼光(Raman scattering light):光子和物 质分子发生非弹性碰撞，光子运动方向 发生改变，也发生能量交换，光子把部 分能量转移给物质分子或从物质分子获 得部分能量，发射出比入射光稍长或稍 短的光，称拉曼光。