高产甘露醇眀串珠菌的分离与鉴定_白琴琴_李志华_李冬梅_崔福顺_金清

甘露醇(D-mannitol)是一种天然多羟基化合物，广泛用于食品、药物、医疗和化学工业[1]。

它属于低热量的糖类，在功能性糖醇中是唯一一种不易吸潮的六元糖醇，可以取代蔗糖、乳糖、葡萄糖或果糖而应用于食品加工当中。

甘露醇的代谢过程不需要胰岛素的参与，因此是糖尿病人食收稿日期：2013-05-30 *通讯作者基金项目：国家自然科学基金项目(31260362)。

作者简介：白琴琴(1990—)，女，辽宁人，硕士研究生，研究方向为食品微生物发酵。

品中甜味成分的最佳替代品[2]。

长期以来，由于甘露醇受到生产原料来源的限制，以及在主要用途方面与生产流程较短、成本较低的山梨醇相近，故影响了甘露醇生产的发展。

随着甘露醇应用的开发以及原料来源的多样化，成本的降低，加上其独特的用途，预示着甘白琴琴，李志华，李冬梅，崔福顺，金 清*(延边大学农学院，延吉 133000)摘要：为了分离与鉴定明串珠菌中高产甘露醇菌株，选取4种蔬菜发酵食品，运用平板稀释法，根据产生透明黏性代谢产物的菌落特征初筛选出21株明串珠菌。

通过高效液相色谱法测定其产生甘露醇的量，筛选出5株高产甘露醇的菌株B17、C47、D24、E13和E28，并对其进行生长特性分析和菌株鉴定。

通过16s rRNA 基因测序确定，B17、C47、D24、E13属于肠膜明串珠菌，E28属于嗜柠檬酸明串珠菌。

关键词：甘露醇；明串珠菌；分离鉴定中图分类号：TS 201.3 文献标志码：A 文章编号：1005-9989(2013)11-0012-04Isolation and identi fi cation of Leuconostoc highly producing D-mannitolBAI Qin-qin, LI Zhi-hua, LI Dong-mei, CUI Fu-shun, JIN Qing *(College of Agricultural, Yanbian University, Yanji 133000)Abstract: Four vegetable-fermented foods were selected for isolating and identifying Leuconostoc, which produces D-mannitol highly. 21 strains of Leuconostoc were isolated based on their colony characteristics of producing transparent and sticky metabolites using the dilution plating method. After measuring the content of D-mannitol by high-performance liquid chromatography, 5 strains producing D-mannitol highly, B17, C47, D24, E13 and E28, were selected from them. Analysis of their growth characteristics and strain identi fi cation were carried out. By 16s rRNA gene sequencing, B17, C47, D24 and E13 were identi fi ed as Leuconostoc mesenteroides, E28 was identi fi ed as Leuconostoc citreum.Key words: D-mannitol; Leuconostoc; isolation and identi fication 高产甘露醇眀串珠菌的分离与鉴定2013年 第38卷 第11期露醇将成为一种有前景的精细化学品[3]。

常规的甘露醇生产方法有提取法、化学合成法和电解还原法，但相应伴有转化率低、有副产物(山梨醇)、成本高等缺点。

近年来，利用微生物发酵合成甘露醇研究很多，许多微生物(如酵母、丝状真菌和乳酸菌等)可以利用碳水化合物为底物合成甘露醇而不生成山梨醇。

真菌以葡萄糖为底物生成甘露醇的容积产率较低，还会消耗产生的甘露醇，使得生产过程难以控制。

相比而言，乳酸菌，尤其是异型乳酸菌代谢途径中的甘露醇脱氢酶(MDH)更易于转化果糖生成甘露醇[4]。

明串珠菌属于异性发酵乳酸菌，是一种重要的革兰阳性菌。

它在多种发酵食品的生产中用作发酵剂，如辣白菜和德国泡菜，更重要的是能够用于甘露醇和葡聚糖的生产[5]。

延边地区的蔬菜发酵食品中含有丰富的乳酸菌，并且从朝鲜族辣白菜中分离出的乳酸菌当中明串珠菌属占主要优势[6]，因此可以从延边地区的蔬菜发酵食品中先分离出异型发酵乳酸菌之一明串珠菌属，再筛选出高产甘露醇的眀串珠菌菌株，为眀串珠菌发酵有效生产甘露醇奠定基础。

1 材料与方法1.1 材料与试剂辣白菜、萝卜块、四川泡菜、酸菜：市售；甘露醇、蔗糖、酵母膏、蛋白胨、K 2H P O 4、NaCl、乙腈等试剂：国产分析纯。

1.2 仪器与设备SW-CJ-IFD型超净工作台：上海新苗医疗器械机械制造有限公司；NU-9668E超低温冷冻箱：美国NUAIRE公司；UV-75型紫外可见分光光度计：上海欣茂仪器有限公司；SX-700高压蒸汽灭菌器：日本TOMY公司；TS100型电子显微镜：上海尼康仪器有限公司；DNP-9082BS-Ⅲ型电热恒温培养箱：上海新苗医疗设备有限公司；PHS-3C型数字酸度计：上海鹏顺科学仪器有限公司；Acme 9000型高效液相色谱仪：韩国英鳞有限公司。

1.3 培养基明串珠菌的筛选和培养分别用加2%蔗糖的苯乙醇琼脂培养基(PES)和MRS培养基。

合成甘露醇的蔗糖培养基按照Eom [7]的方法配制(现用现配)。

1.4 方法1.4.1 眀串珠菌的筛选与纯化培养 眀串珠菌的筛选与纯化，采用平板稀释法[8-9]。

取实验材料的汁液10倍递增梯度稀释后，选择2~3个适宜稀释度均匀涂布于PES平板，30 ℃恒温培养箱中培养48 h。

将有明显明串珠菌菌落特征的单个菌落分别挑取到MRS培养基上，30 ℃恒温培养箱中培养48 h，并按照不同样品、不同发酵时间、不同稀释度进行编号(编号头字母依次为A、B、C、D、E、F)。

1.4.2 菌种的保藏 将已经纯化的菌种接种到1 mL MRS液体培养基中，30 ℃恒温培养箱中培养24 h。

然后，取0.7 mL培养液与0.3 mL 50%甘油混合，保藏于-80 ℃的冷冻冰箱中备用[9-10]。

1.4.3 发酵 将分离纯化的明串珠菌预培养、活化以后，按2%(v/v)的接种量接种到蔗糖培养基中，30 ℃恒温发酵24 h。

1.4.4 发酵液中甘露醇含量的测定 HPLC法[7]：利用韩国Younglin公司生产的高效液相色谱仪(M930溶媒输送泵和ACME 9000折光率检测器组成)和Asahipak NH2P-504E色谱柱(4.6 mm ID×250 mm，Shodex，Japan)测定发酵液中甘露醇的含量。

流动相为乙腈和水(75:25)，流速为1 mL/min。

测定前将发酵液以3500 r/min的转速离心8 min，然后取上清液于0.45 μm滤孔过滤后进行测定。

标准曲线的绘制：使用高效液相色谱仪对4种标准浓度(0%、0.125%、0.5%、1%)的甘露醇溶液进行测定，并根据标准液中甘露醇含量与图谱上甘露醇波峰面积绘制标准曲线。

1.4.5 pH值的测定 取2 mL发酵液放入试管中，用酸度计进行测定。

1.4.6 OD值的测定 以蔗糖培养基溶液为标准液和稀释液，在660 nm波长下对发酵液进行测定[11]。

当测得OD值大于1时，则要对所测发酵液进行适当倍数的稀释后再行测定，直至OD值小于1。

1.4.7 菌种鉴定方法 菌株的16S rRNA序列的测定：16S r R N A 的序列分析是按照K i m 和Adachi的方法进行的[12]。

引物使用：27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')。

16S rRNA基因是被SolGent有限公司人工合成的(大田，韩国)。

物种鉴定后，每一个菌种的序列被存放在DNA数据库中并编号[13]。

首先把被鉴定菌株培养出单一菌落，由SolGent有限公司进行序列测定，最后把所得菌株的DNA序列信息输入NCBI(National Center for Biotechnology Information [])数据库进行BLASTN分析[14]。

1.4.8 菌株的形态学观察 将已分离纯化的菌种分别涂布MRS固体培养基上，30 ℃恒温培养24 h。

观察菌落特征，取典型菌落涂片革兰染色，油镜下观察菌体形态[15]。

2 结果与分析2.1 眀串珠菌的分离纯化观察PES培养基的菌落特征，分离出产生黏性透明物质推测为明串株菌的菌株21株。

2.2 发酵液中甘露醇含量的测定将21株菌株按2%的接种量，分别接种到蔗糖培养基中，30 ℃恒温培养24 h后，用HPLC法测定发酵液中甘露醇的浓度，结果见表1。

表1 各菌株发酵液甘露醇浓度 %检测菌株甘露醇浓度检测菌株甘露醇浓度A62-D240.24B14-D400.17B170.19E3-B330.17E130.19B440.13E280.18B470.07E370.13C30.08F3-C230.16F6-C470.21F22-D3-F54-D210.15注：图表中“-”，表明在该菌株发酵液的HPLC图谱中未出现甘露醇波峰或者甘露醇波峰不明显。

表1中，每个编号头字母代表着一种菌株来源，以生成甘露醇含量不低于0.18%为基准，最终所挑选出的高产菌株依次为：B17、C47、D24、E13和E28。

2.3 高产甘露醇的眀串珠菌的发酵特性研究将所筛选出的5株高产菌株，分别接种到蔗糖培养基，30 ℃条件下发酵24 h。

期间，每隔3 h对发酵液进行OD值(660 nm)和pH值测定，并绘制出OD值变化曲线(图1)和pH值变化曲线(图2)。

图2 不同培养时间pH值的变化图1 不同培养时间OD值的变化从图1和图2中可以看出，所有菌株均没有明显的迟滞期。

当进入对数生长期后，OD值逐渐升高并达到最大值，这说明菌株生长速度逐渐加快，菌数急剧增加。

其中E28菌株生长速度最快，其次是D24和C47菌株，E13和B17生长速度与其他相比较缓慢。

同时菌液的pH值急剧下降，这是由于菌数的急剧增加，底物转化的速度逐渐加快，产生酸性物质所致。