一测多评法测定转移因子口服液中核糖核酸的含量

一测多评法测定转移因子口服液中核糖核酸的含量
于妮娜;薛美玲;杨静;杨飞快
【摘要】目的:建立转移因子口服液中核糖核酸的一测多评含量测定方法.方法:对转移因子口服液酶解条件、色谱方法筛选,以鸟嘌呤脱氧核苷酸为内参物,建立其余核苷酸,核苷及总核糖核酸含量的一测多评法.结果:各核苷酸及核苷峰形好,分离度高,一测多评法及多对照外标法测定结果基本一致.结论:此方法实现了转移因子口服液中核糖核酸的准确定量,同时提高检测效率,降低检测成本,适用于转移因子口服液中的核糖核酸的检测与监控.
【期刊名称】《北方药学》
【年(卷),期】2019(016)007
【总页数】3页(P8-9,131)
【关键词】转移因子;核糖核酸;高效液相色谱;含量;一测多评
【作者】于妮娜;薛美玲;杨静;杨飞快
【作者单位】陕西省新药审评中心西安710065;金花企业(集团)股份有限公司西安金花制药厂西安710065;金花企业(集团)股份有限公司西安金花制药厂西安710065;金花企业(集团)股份有限公司西安金花制药厂西安710065
【正文语种】中文
【中图分类】R927.2
转移因子（transter factor，简称TF）又称传输因子，是一种天然双向免疫调节
剂，是目前治疗免疫功能低下、缺陷等疾病的理想药物。

转移因子的主要成分为健康猪或牛脾脏中提取的多肽、氨基酸和核糖核酸[1，2]。

准确测定转移因子中的核糖核酸含量对于优化转移因子生产工艺及控制产品质量具有重要的意义。

从健康猪脾脏提取分离的核糖核酸（RNA），是由几十至几千个核苷酸聚合而成的长链，每一种RNA都有一定的核苷酸排列顺序和二级、三级结构。

现有技术核糖核酸含量测定采用紫外吸收系数法[3，4]，但因一方面样品中的杂蛋白和苯酚等在相同波长处均有吸收，干扰测定结果；另一方面RNA片段的长短以及二级结构状态会对吸光度产生较大影响，导致测定结果不准确。

有采用高效液相色谱法测定核糖核酸含量的文献报道[5-8]，但一般采用离子对-HPLC法或者离子色谱法进行分离，且只用于单独分离核苷酸或脱氧核苷酸。

离子对色谱法平衡时间较长，且色谱峰容易漂移，色谱柱使用寿命短。

本方法提供了一种准确性高、重现性好、操作简便且成本较低的转移因子口服溶液中核糖核酸的含量检测方法。

该方法经过科学系统的验证，能够实现对转移因子口服溶液中核糖核酸准确定量，排除其他物质的干扰且相邻组分峰间分离度佳，重现性好，检测效率高；克服现有技术中的不足；以便对转移因子口服溶液的生产实施有效的监督控制。

1 仪器与试药
1.1 仪器:安捷伦高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；烘箱；水浴锅；天平。

1.2 试药:转移因子口服液（西安金花）；甲醇，乙腈，醋酸钠，冰醋酸；氨基酸对照品（中国药品生物制品检定所）。

2 方法与结果
2.1 转移因子口服溶液酶解条件的筛选:以3因素3水平正交试验筛选转移因子口服溶液酶解条件，酶解条件考察的3个因素分别为酶活力浓度、反应时间、酶解样品浓度；通过单因素试验考察确定3个因素的最佳水平值分别为酶活力浓度
5IU/mL、反应时间30min、酶解样品浓度1mg/mL。

依据上述3个因素的最佳水平值设计的3因素3水平正交试验见表1，正交试验结果分析见表2。

表1 转移因子口服溶液酶解条件筛选正交试验表水平酶活力浓度A 反应时间B 酶解样品浓度C 123 3IU/mL 5IU/mL 7IU/mL 20min 30min 40min 0.8mg/mL 1.0mg/mL 1.2mg/mL
表2 转移因子口服溶液酶解条件筛选正交试验结果分析表序号酶活力浓度A 反应时间B 酶解样品浓度C核糖核酸含量（mg/支）123456789 K1/3 K2/3 K3/3极差最优组合最显著影响因素111222333 123123123 123231312 2.18 2.74 2.18 2.53 2.62 2.14 1.98 2.25 2.31 2.37 2.43 2.18 0.25 2.23 2.54 2.21 0.33 A2B2C2酶解样品浓度2.19 2.53 2.26 0.34/
由表2可见通过3因素3水平正交试验确定最佳的水解条件组合为:酶活力浓度
5IU/mL、反应时间30min、酶解样品浓度1mg/mL；并经极差分析发现影响样品检测结果的最显著因素为酶解样品浓度。

2.2 校正因子:一测多评法测定转移因子口服溶液中核糖核酸含量中相对校正因子的测定方法采用标准曲线法，以鸟嘌呤脱氧核苷酸为内参物，4种核苷酸及4种核苷相对校正因子检测结果如表3所示。

表3 相对校正因子检测结果序号化合物名称相对校正因子12345678胞嘧啶核苷酸尿嘧啶核苷酸鸟嘌呤核苷酸胞嘧啶核苷腺嘌呤核苷酸尿嘧啶核苷鸟嘌呤核苷腺嘌呤核苷1.84 1.20 0.80 0.96 0.84 0.70 0.70 0.51
上述一测多评法测定转移因子口服溶液中核糖核酸含量中的耐用性考察条件如表4所示，考察结果均符合要求。

表4 相对校正因子耐用性考察条件条件拟定值考察值1 考察值2流动相pH值柱温流速检测波长不同色谱柱不同仪器不同人员3.6 35℃0.8mL/min 260nm Kromasil安捷伦检验员A 3.55 33℃0.6mL/min 258nm岛津戴安（UV）检验员
B 3.65 37℃1.0mL/min 262nm菲罗门戴安（DAD）检验员C
各核苷酸及核苷的液相色谱图如图1所示，液相色谱图中，各核苷酸及核苷峰峰
形好，分离度高，大大降低了相邻组分峰间的重叠比例，提高了检测准确度。

图1 各核苷酸及核苷的液相色谱图
2.3 单对照一测多评法测定转移因子胶囊中总核糖核酸含量
2.3.1 色谱条件:采用Agilent高效液相色谱仪，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂色谱柱；以甲醇为流动相A，0.1mol/L磷酸二氢钾溶液（用磷酸调节pH值为3.6）为流动相B进行梯度洗脱；流速为每分钟0.8mL，检测波长为260nm，柱温为35℃，进样体积为2μL。

表5 洗脱梯度时间表时间（min）流动相A（%）流动相B（%）0 10 10.1 20 20.1 30 221 5 15 22 98 98 85 85 98 98
2.3.2 标准曲线的测定:精密称取鸟嘌呤脱氧核苷酸对照品20.0mg，置100mL量
瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液。

分别精密量取对照品贮备液0.1mL、0.5mL、1.0mL、2.5mL、5.0mL，分置于 25ml量瓶中，加水稀释
至刻度，摇匀，作为对照溶液1～5。

分别精密量取上述标准曲线系列溶液各2μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。

以鸟嘌呤脱氧核苷酸浓度对其峰面积按最小二乘法进行线性回归，求出标准曲线方程及线性相关系数。

2.3.3 样品的测定量取转移因子口服溶液3μL，加蛇毒磷酸二酯酶溶液15μL，涡
旋混匀，置37℃反应30min后，加水至100μL，混匀，沸水浴5min，离心
15min，取上清液，即得。

精密量取上述供试品溶液2μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。

依据表3中各氨基酸的相对保留时间定位4种核苷酸及4种核苷的色谱峰，各色谱峰面积代入标准曲线方程求出含量，乘以表3中各待测物质相对校正
因子并加和即得核糖核酸含量。

样品的液相色谱图如图2所示。

图2 转移因子口服溶液核糖核酸含量测定供试品溶液色谱图
2.4 单对照一测多评法及多对照外标法测定转移因子胶囊总核糖核酸含量结果比较分别采用单对照一测多评法及多对照外标法测定同10批转移因子口服溶液中核糖核酸含量，结果显示单对照一测多评法及多对照外标法测定结果基本一致；检测结果见表7。

单对照一测多评法相对多对照外标法检测效率高且需要对照品少、检测效率高且检测成本显著降低。

表6 两种方法测定转移因子口服溶液核糖核酸含量结果比较表批次核糖核酸含量（mg/支） RSD%一测多评法外标法1234567891 0 2.34 2.98 2.62 2.57 2.91 2.85 2.47 2.43 2.11 2.26 2.38 2.92 2.57 2.63 2.86 2.78 2.54 2.38 2.20 2.32 1.37 1.26 1.08 1.12 0.96 1.53 1.34 1.38 1.82 1.79
3 讨论
与现有技术相比，本方法的优点在于:第一，采用酶水解-高效液相色谱法测定转移因子口服溶液中核糖核酸含量，可排除干扰，方法专属性强；且本方法采用的高效液相色谱条件较文献报道方法可操作性强，检测能力高。

第二，通过筛选色谱柱、流动相组成、流动相pH值、色谱柱柱温及优化洗脱时间梯度等措施，确定了最优检测色谱条件；采用该条件检测，液相色谱图中，各氨基酸峰峰形好，分离度高，提高了检测准确度。

第三，通过系统的验证研究确定了拟定色谱条件下核糖核酸基本组成物质4种核苷酸及4种核苷的相对校正因子及相对保留时间，日后检测中可采用一测多评方法，以法定标准物质鸟嘌呤脱氧核苷酸为内参物，实现核糖核酸类物质的定量检测，解决了外标法需要对照品较多，不易获得且检测成本较高，操作烦琐的技术难题。

本方法适用于转移因子口服溶液中核糖核酸的检测与监控。

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