如何添加酶切位点

当在引物5’端添加酶切位点时要考虑：
a)该目的序列内部不得含有相同的酶切位点，在引物发出后才发现错误的事情本人就干过，在论坛上也能看到这样的粗心人。

这样的错误会给将来的克隆造成麻烦。

b)如果打算PCR 后直接酶切，不要忘了在酶切位点的外侧再加上保护碱基，不同的酶对于保护碱基的要求是不同的。

如果不设计保护碱基，则多半要用TA 克隆的方式连接到质粒上，这时要注意Taq 酶的选择，若想在目的序列上附加上并不存在的序列，如限制位点和启动子序列，可以加入到引物5'端而不影响特异性。

当计算引物Tm 值时并不包括这些序列，但是应该对其进行互补性和内部二级结构的检测。

PCR设计引物时酶切位点的保护?
?酶寡核苷酸序列切割率%?2 hr20 hr?Acc IGGTCGACC
CGGTCGACCG
CCGGTCGACCGG 0
00
0?Afl IIICACATGTG
CCACATGTGG
CCCACATGTGGG0
>90
>900
>90
>90?Asc IGGCGCGCC
AGGCGCGCCT
TTGGCGCGCCAA>90
>90
>90>90
>90
>90?Ava ICCCCGGGG
CCCCCGGGGG
TCCCCCGGGGGA50
>90
>90>90
>90
>90?BamH ICGGATCCG
CGGGATCCCG
CGCGGATCCGCG10
>90
>9025
>90
>90?Bgl IICAGATCTG
GAAGATCTTC
GGAAGATCTTCC0
75
>90
>90?BssH IIGGCGCGCC
AGGCGCGCCT
TTGGCGCGCCAA0
500
>90?BstE IIGGGT(A/T)ACCC010?BstX IAACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT0
25
250
50
>90?Cla ICATCGATG
GATCGATC
CCATCGATGG
CCCATCGATGGG0
>90
500
>90
50?EcoR IGGAATTCC
CGGAATTCCG
CCGGAATTCCGG>90
>90
>90>90
>90
>90?Hae IIIGGGGCCCC
AGCGGCCGCT
TTGCGGCCGCAA>90
>90
>90>90
>90
>90?Hind IIICAAGCTTG
CCAAGCTTGG
CCCAAGCTTGGG0
100
75?Kpn IGGGTACCC
GGGGTACCCC
CGGGGTACCCCG0
>900
>90
>90?Mlu IGACGCGTC CGACGCGTCG0
250
50?Nco ICCCATGGG CATGCCATGGCATG0
500
75?Nde ICCATATGG CCCATATGGG CGCCATATGGCG GGGTTTCATATGAAACCC GGAATTCCATATGGAATTCC GGGAATTCCATATGGAATTCCC0
75
750
>90
>90?Nhe IGGCTAGCC CGGCTAGCCG
CTAGCTAGCTAG0
10
100
25
50Not ITTGCGGCCGCAA ATTTGCGGCCGCTTTA AAATATGCGGCCGCTATAAA ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTAT AAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAAA0 10
10
25
250
10
10
90
>90Nsi ITGCATGCATGCA CCAATGCATTGGTTCTGCAGTT10
>90>90
>90Pac ITTAATTAA
GTTAATTAAC
CCTTAATTAAGG0
00
25
>90Pme IGTTTAAAC
GGTTTAAACC
GGGTTTAAACCC AGCTTTGTTTAAACGGCGCGCCGG0
750
25
50
>90Pst IGCTGCAGC TGCACTGCAGTGCA AACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT0
10
>90
>90
00
10
>90
>90
0Pvu ICCGATCGG
ATCGATCGAT
TCGCGATCGCGA0
10
00
25
10Sac ICGAGCTCG1010Sac IIGCCGCGGC TCCCCGCGGGGA0
500
>90Sal IGTCGACGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC GCGTCGACGTCTTGGCCATAGCGGCCGCGG ACGCGTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA0
10
100
50
75Sca IGAGTACTC
AAAAGTACTTTT10 7525
75Sma ICCCGGG CCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA0
10
>9010
10
50
>90Spe IGACTAGTC GGACTAGTCC CGGACTAGTCCG CTAGACTAGTCTAG10 10
0>90
>90
50
50Sph IGGCATGCC CATGCATGCATG ACATGCATGCATGT0 0
100
25
50Stu IAAGGCCTT GAAGGCCTTC AAAAGGCCTTTT>90 >90
>90>90
>90
>90Xba ICTCTAGAG GCTCTAGAGC TGCTCTAGAGCA CTAGTCTAGACTAG0 >90
75
750
>90
>90
>90Xho ICCTCGAGG CCCTCGAGGG CCGCTCGAGCGG0
10
100
25
75Xma ICCCCGGGG
CCCCCGGGGG
CCCCCCGGGGGG
TCCCCCCGGGGGGA0
25
50
>900
75
>90
>90注释：
1．如果要加在序列的5‘端，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的5’端加上相应的碱基（黑色），相同如果要在3‘端加保护碱基，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的3’端加上相应的碱基（黑色）。

2．切割率：正确识别并酶切的效率
3。

加保护碱基时最好选用切割率高时加的相应碱基。

克隆PCR产物的方法之一，是在PCR产物两端设计一定的限制酶切位点，经酶切后克隆至用相同酶切的载体中。

但实验证明，大多数限制酶对裸露
的酶切位点不能切断。

必须在酶切位点旁边加上一个至几个保护碱基，才能使所定的限制酶对其识别位点进行有效切断。

下表列举了15种限制酶，分别比较了各种限制酶在其酶切位点旁边分别加0、1、2、3个保护碱基后的切断情况。

表中的：(-)?为不能切断；(±)?为
不能完全切断；(+)?为能完全切断。

结果显示，基本上所有限制酶，在其酶切位点旁边加上3个以上的保护碱基后，可以对其酶切位点进行有效切断。