微生物理化性质实验

微生物理化性质实验
生命学院生科四班
张行润
200900140177 摘要
通过不同菌种的代谢方式和产物的不同，在一定的培养基下，对照实验，以简单方便的观察出不同鉴定菌种之间的差异。

比如铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌可以分解使用淀粉，而金黄色葡萄球菌和大肠杆菌却是不行。

乳糖发酵实验中，大肠杆菌产气产酸，但是普通变形杆菌却无法产酸产气。

通过与对照组的对照，我们便可以轻松区分，以达到鉴定区别菌种的目的。

关键词
糖酵解（glycolysis）大分子水解吲哚试验甲基红试验
前言
用生化试验的方法检测细菌对各种基质的代谢作用及其代谢产物，从而鉴别细菌的种属，称之为细菌的生化反应。

各种细菌所具有的酶系统不尽相同，对营养基质的分解能力也不一样，因而代谢产物或多或少地各有区别，可供鉴别细菌之用。

不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异，或能利用或不能利用，能利用者，或产气或不产气。

可用指示剂及发酵管检验。

某些细菌可以产生分解淀粉的酶，把淀粉水解为麦芽糖或葡萄糖。

淀粉水解后，遇碘不再变蓝。

这些都可以作为鉴定菌种的指标性特征。

一、实验材料
1.1.菌种：
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）大肠杆菌（Escherichia coli）铜绿假单胞杆菌（P.Aeruginosa）金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）普通变形杆菌（P. vulgaris）产气肠杆菌（Enterobacter amnigenus）等。

1.2.试剂及药品：
卢戈式碘液、溴甲酚紫指示剂、甲基红指示剂、吲哚试剂、蛋白胨、牛肉膏、NaCl、1.6%花生油中性红水溶液、琼脂、蒸馏水、可溶性淀粉、1.6%溴甲酚紫乙
醇溶液、葡萄糖、乳糖、蔗糖等。

1.3.器材：
培养皿、锥形瓶、试管、烧杯、接种环、试管架、酒精灯等。

二、实验原理
微生物对大分子物质如淀粉、蛋白质和脂肪不能直接被利用，必须依靠产生的胞外酶将大分子物质分解后，才能被微生物吸收利用。

胞外酶主要为水解酶，通过加水裂解大分子物质为较小化合物，使其能被运输到细胞内。

如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精、双糖和单糖，脂肪酶水解脂肪为甘油和脂肪酸，蛋白质酶水解蛋白质为氨基酸等，这些过程均可通过观察细菌菌落周围的物质变化来证实。

如淀粉遇碘液会变蓝色，但细菌水解淀粉的区域，用碘液测定时，不再产生蓝色，表明细菌产生淀粉酶。

脂肪水解后产生脂肪酸可改变培养基的PH，使PH降低，加入培养基的中性红指示剂会使培养基从淡红色变到深红色，说明细胞外存在脂肪酶。

糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应，在肠道细菌的鉴定上尤为重要，绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源，但是它们在分解糖类物质的能力上有很大的差异，有些细菌能分解某种糖产生有机酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和气体（如氢气、甲烷、二氧化碳等），有些细菌只产酸不产气。

例如，大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气；伤寒杆菌分解葡萄糖产酸不产气，不能分解乳糖；普通变形杆菌分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳糖。

发酵培养基含有蛋白胨、指示剂（溴甲酚紫）、倒置的德汉氏小管和不同的糖类。

当发酵产酸时，溴甲酚紫指示剂可有紫色（PH6.8）转变为黄色（PH5.2）。

气体的产生可由倒置的德汉氏小管中有无气泡来证明。

IMViC试验是吲哚（indol test）、甲基红（methyl red test）、伏—普（Voges-Prokauer test）和柠檬酸盐（cirate test）四个试验的缩写。

这四个试验主要是用来快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌，多用于水的细菌检测。

大肠杆菌虽非致病菌，但在饮用水中如超过一定数量，则表示水质受粪便污染。

产气肠杆菌也广泛存在于自然界中，因此检查水时，要将两者分开。

吲哚试验是用来检测吲哚的产生，有些细菌产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸，产生吲哚和丙酮酸。

吲哚与对二甲基氨基苯甲醛结合，形成红色的玫瑰吲哚。

但并非所有的微生物都具有分解色氨酸产生吲哚的能力，因此吲哚试验可以作为生物化学检测的指标。

大肠杆菌吲哚反应阳性，产气肠杆菌为阴性。

甲基红试验是用来检测由葡萄糖产生的有机酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。

当细菌代谢糖产生酸时，培养基就会变酸，会使加入培养基的甲基红指示剂由橙黄色（PH6.3）转变为红色（PH4.2），即甲基红反应。

尽管所有的肠道微生物都能发酵葡萄糖产生有机酸，但这个试验在区分大肠杆菌和产气肠杆菌上任然是有价值的。

这两种细菌的早期均产生有机酸，但大肠杆菌在培养后期仍能维持酸性PH4，而产气肠杆菌则转化有机酸为非酸性末端产物，如乙醇、丙酮酸等，使PH 升至大约6。

因此大肠杆菌为阳性，产气肠杆菌为阴性。

三、实验方法
3.2.1培养基制备
各组分别配置不同的培养基，配好后分给各组同学。

（1）、淀粉水解实验（每组三个平板）
制取淀粉培养基，按照每1000ml水蛋白胨10g、NaCl5g、牛肉膏5g、可溶
性淀粉2g、琼脂15-20g称量物品，配制培养基，配制好后放入三角瓶中准备灭菌。

（2）、油脂水解实验（每组三个平板）
配制油脂培养基，按照每1000ml水蛋白胨10g、NaCl5g、牛肉膏5g、香油
或花生油10g、1.6%中性红水溶液1ml、琼脂15-20g称量物品，配制培养基，调节PH为7.2，配制好后放入三角瓶中准备灭菌。

（3）、糖发酵试验溶液（每种每组五支试管）
配制糖发酵培养基，按照每1000ml蛋白胨水培养基1.6%溴甲酚紫乙醇1-2ml，调节pH为7.6，另配制葡萄糖和乳糖各10ml。

装入试管，将其中的德汉氏小管灌满放入试管，制成培养基。

准备灭菌。

（4）、IMViC试验（每种每组六支试管）
配制蛋白胨水培养基和葡萄糖蛋白胨水培养基，蛋白胨水培养基以每1000ml 蒸馏水蛋白胨10g、NaCl5g、称取物品，调节ph为7.6，配制好后加入试管中，每支试管1/3体积培养基，葡萄糖蛋白胨水培养基为每1000ml蒸馏水中蛋白胨
5g、葡萄糖5g、K2HPO42g，配好后调节PH为7.0-7.2，配好后装入试管中，每支试管1/3体积培养基，准备灭菌。

3.2.2灭菌
将以上制备好的培养基放入高温蒸汽灭菌锅中在121℃灭菌20分钟。

取出后将淀粉培养基与脂肪培养基倒取平板，冷却后将所有培养基分给各组。

3.2.3种菌
（1）淀粉水解实验及油脂水解实验
在培养基平板，在其背面用标签笔画一个十字，将其分为相等的四个区域，再在相应的位置写上要种的菌的名称，分别是大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌，在无菌条件下，将菌种分别接在相应的区域，对于淀粉培养基，在接种时，采取触点接种，对于脂肪培养基，采取画十字接种，接的面积不要太大，以免不同区的水解圈重叠，影响观察。

贴上标签。

（2）糖发酵试验溶液
在无菌条件下，将大肠杆菌、变形杆菌分别接在糖发酵培养基液中，每种菌在葡萄糖和乳糖培养基中各接两支培养基，每种留一支作为对照。

贴上标签。

（3）IMViC试验
在无菌条件下，将大肠杆菌、产气肠杆菌分别接种在蛋白胨水培养基和葡萄糖蛋白胨水培养基中，大肠杆菌、产气肠杆菌分别在蛋白胨水培养基和葡萄糖蛋白胨水培养基中接三支培养基试管。

贴上标签。

3.2.4培养
将以上的接种好的培养基放入37℃培养箱中培养48小时。

3.2.5实验观察
（1）淀粉水解实验
取培养基平板，观察各种细菌的生长情况，打开平板的盖子，滴入少量卢戈氏碘液于平板中，轻轻旋转平板，使碘液均匀铺满整个平板。

观察。

（2）油脂水解实验
取出平板，观察菌苔颜色。

（3）糖酵解实验
取葡萄糖培养基试管观察期中的德汉氏小管中是否有气泡，以及培养基的颜色。

(4)吲哚实验
向培养基中加入3~4滴乙醚，摇动数次，静置1min，待乙醚上升后，沿试管壁徐徐加入2滴吲哚试剂。

在乙醚和培养物之间产生红色环状物为阳性。

(5)甲基红试验
将一支葡糖糖蛋白胨水培养基的培养物内加入甲基红试剂2滴，培养基若变红则为阳性。

四、实验结果及分析
4.1 实验结果
表 2 糖酵解实验结果记录
图
1 微生物理化性质实验结果一览
1-3号为葡萄糖发酵培养液，
依次为对照组（紫色无气泡）
，普通变形杆菌（黄色有气泡）和大肠杆菌（黄色有气泡）。

4-6号为乳糖发酵培养液，依次为对照组（紫色无气泡），普通变形杆菌（紫色无气泡）和大肠杆菌（黄色有气泡）。

7号为产气杆菌的甲基红试验，为阴性；8号为大肠杆菌的甲基红试验，为阳性，红色比产气杆菌颜色深。

9号为产气杆菌的吲哚试验，为阴性；10号为大肠杆菌的吲哚试验，为阳性。

图2 淀粉水解试验图3 油脂水解实验
A.淀粉水解实验中，枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌能水解淀
粉；铜绿假单胞菌不能。

B.油脂水解实验中，大肠杆菌、金黄色葡萄球杆菌能水解油脂，产生红色
的斑点；铜绿假单孢菌、枯草芽孢杆菌不能。

C.糖发酵实验中，大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气；普通变形菌
分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳糖。

D.甲基红实验中，大肠杆菌使培养液变红，是阳性；产气肠杆菌是液体变
黄是阴性。

E.在吲哚试验中，大肠杆菌和产气肠杆菌都能具有分解色氨酸产生吲哚的
能力。

大肠杆菌是阳性；产气肠杆菌是阴性。

五、实验小结
试验中要注意的地方
在淀粉水解实验中，观察各菌生长情况时，滴入少量戈卢氏碘液于平板中，应该轻轻旋转平板，使碘液均匀铺满整个平板。

在油脂水解实验中，制备固体油脂培养基时，应充分摇荡，使油脂均匀分布。

在大分子物质的水解实验，注意在接种前用记号笔做标记，接种时一定要认真检查标记，对号接种，以免接错菌种，造成混乱。

在糖发酵试验中，在接种后，应轻摇试管，使其均匀，防止倒置的小管进入气泡，否则会造成假象，得出错误结果。

吲哚试验中，注意加入3~4滴乙醚，摇动数次，静置1min，待乙醚上升后，再沿试管壁徐徐加入2滴吲哚试剂。

否则就会观测不到在乙醚和培养物之间产生的红色环状物。

甲基红实验中，应该注意甲基红试剂不要加的太多，以免出现假阳性。

参考文献
✧沈萍，陈向东.微生物学.第二版.北京:高等教育出版社，2006
✧沈萍，陈向东.微生物学实验.第4 版.北京:高等教育出版社，2007。