滑菇肽对青春双歧杆菌的益生作用

滑菇肽对青春双歧杆菌的益生作用
张业尼;钱磊;刘逸寒;刘金福;张志军
【摘要】研究滑菇肽对青春双歧杆菌的体外益生作用.将滑菇肽添加到青春双歧杆菌液体培养基中,测定发酵和贮存过程中活菌数变化.结果表明,滑菇肽在添加量为0.5 g/L～4.0 g/L时对青春双歧杆菌生长具有促进作用,发酵12小时后活菌数最高可达1.78×109 cfu/mL,为对照组的2.88倍(P<0.05).滑菇肽能够增强青春双歧杆菌对酸性环境的耐受力,4℃冷藏28天后,活菌数仍维持在80％以上.添加1.0 g/L 滑菇肽对青春双歧杆菌的促生长作用优于低聚果糖,发酵12小时后活菌数可达1.18×109 cfu/mL,为对照组的2.04倍(P<0.05).滑菇肽能够促进青春双歧杆菌生长,作为双歧因子应用于青春双歧杆菌产品具有潜在价值.
【期刊名称】《食品研究与开发》
【年(卷),期】2019(040)002
【总页数】5页(P162-166)
【关键词】滑菇;肽;青春双歧杆菌;益生作用
【作者】张业尼;钱磊;刘逸寒;刘金福;张志军
【作者单位】天津农学院食品科学与生物工程学院,天津300384;天津市林业果树研究所,天津300384;天津市农产品采后生理与贮藏保鲜重点实验室,天津300384;天津科技大学生物工程学院,天津300457;工业发酵微生物教育部重点实验室,天津300457;天津农学院食品科学与生物工程学院,天津300384;天津市林业果树研究所,天津300384;天津市农产品采后生理与贮藏保鲜重点实验室,天津300384
【正文语种】中文
益生元是一种可被选择性发酵且专一性地改变肠道中对宿主健康有益菌群的组成和活性的配料[1]。

食用菌含有几丁质、半纤维素、甘露糖、木聚糖等碳水化合物，
具有不易消化性，价格便宜且来源丰富，赋予了它作为益生元来源的潜力[2]。

国内外对食用菌的益生作用进行了研究，发现香菇[3-4]、猴头菇[5-6]、平菇[7-9]、柳松菇[10]、姬松茸[11-13]、鸡腿菇[14]、虎奶菇[15]等食用菌提取物可促进益生菌增殖。

王芳等[3]发现香菇浸提液对嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌均有促进作用，1%添加量使酸奶中球菌和杆菌分别提高了5.5%和3.2%。

李科德等[5]发现在双歧杆菌培养基中添加2%猴头菇抽提物使双歧杆菌提高到109个/mL，效果优于低聚异麦芽糖和低聚果糖。

闫丽莉等[11]发现姬松茸多糖可促进嗜酸乳杆菌产酸，使对数期提前和平稳期延长，活菌数达1010个/mL以上。

食用菌提取物不仅在体外能够促进有益菌群增殖，还能够对健康的或肠道失调的动物或人发挥益生元效应[16-20]。

Oyetayo等[21]将凤尾菇粉添加到大鼠膳食中，发现粪便中乳杆菌数量显著高于空白组。

Giannenas等[22]在正常仔鸡膳食中添
加20 g/kg双孢菇，发现粪便中双歧杆菌和乳杆菌数量均增加。

蔡文辉等[23]发
现灵芝孢子粉能够扶植肠道中双歧杆菌和乳酸杆菌的生长，对重症急性胰腺炎引起的肠道紊乱和细菌易位有调节作用。

双歧杆菌具有生物屏障、营养作用，以及免疫增强、抗肿瘤、抗衰老等功能，随着年龄增长，人体内双歧杆菌逐渐减少，而服用抗生素、放疗、化疗等不利因素进一步导致肠道菌群失调。

促进体内双歧杆菌增殖的方法有两种，一是直接摄入含有双歧杆菌的酸奶、饮料或微生态制剂，二是摄入双歧因子促进人体固有双歧杆菌增殖。

本研究以青春双歧杆菌作为被试菌，考察了不同剂量滑菇肽的添加对发酵和贮藏过程中青春双歧杆菌生长的影响，为将滑菇肽作为双歧因子应用于青春双歧杆菌产品
提供理论依据。

1 材料与方法
1.1 材料与试剂
青春双歧杆菌：天津科技大学生物工程学院提供；滑菇子实体干品：福建省古田县亲联食品有限公司，粉碎，过 60 目筛，备用；碱性蛋白酶（100 U/mg）、风味蛋白酶（20 U/mg）：天津市诺奥科技发展有限公司；其他试剂：国产分析纯。

1.2 培养基
脱脂乳培养基：脱脂奶粉10 g，蒸馏水定容至100 mL，105℃灭菌 15 min。

双歧杆菌培养基：胰蛋白胨5 g，大豆蛋白胨5 g，酵母粉10 g，葡萄糖10 g，
L-半胱氨酸盐酸盐0.05 g，吐温80 0.1 mL，盐溶液4 mL，固体培养基另加琼脂15g，蒸馏水定容至1000mL，pH 7.0，115℃灭菌 20 min。

盐溶液：CaCl20.2 g/L、K2HPO41 g/L、KH2PO41 g/L、MgSO4 0.48 g/L、NaHCO310 g/L、NaCl 2 g/L。

磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液：磷酸氢二钠6 g，磷酸二氢钾4.5 g，吐温80 1 mL，L-半胱氨酸盐酸盐0.5 g，蒸馏水定容至1 000 mL，pH 7.0，105℃灭菌15 min。

1.3 仪器与设备
卧式恒温摇床（HNY-211C型）：天津欧诺仪器股份有限公司；超声波细胞粉碎
机（JY92-IIDN型）：宁波新芝生物科技股份有限公司；型电热恒温水浴锅（DK-320S）：上海精宏实验设备有限公司；磁力加热搅拌器（HJ-6型）：常州国华电器有限公司；真空冷冻干燥机（LGJ-10C型）：北京四环科学仪器厂有限公司；
高速冷冻离心机（GL-20C型）：上海安亭科学仪器厂；厌氧培养箱（YQX-I型）：上海跃进医疗器械有限公司；电子天平（BS224S型）：北京赛多利斯仪器系统有限公司；酸度计（PHS-3C型）：上海精密科学仪器有限公司；氨基酸自动分析仪
（L-8900型）：日本日立公司。

1.4 方法
1.4.1 滑菇肽的制备
根据文献[24]从滑菇子实体干品中提取粗蛋白。

配制底物浓度3%的粗蛋白溶液，置于超声波细胞粉碎机中，在功率300 W、温度40℃下处理20 min；置于55℃水解反应器中，调节pH值至9.0，加入3 500 U/g碱性蛋白酶，水解3.5 h；水
解结束后80℃处理20 min，灭酶，冷却，6 000 r/min离心20 min，取上清；
置于55℃水解反应器中，调节pH值至7.0，加入3 000 U/g风味蛋白酶，水解1.5 h；水解结束后80℃处理20 min，冷却，6 000 r/min离心20 min，取上清，浓缩，冷冻干燥，即滑菇肽。

1.4.2 测定方法
1.4.
2.1 活菌数测定
采用倾注平板法。

以磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液作为稀释液，将菌液以10倍
梯度稀释，选取适当稀释梯度倾注双歧杆菌固体培养基，每个样品2个稀释度，
每个稀释度3个平行，37℃厌氧培养48 h，计数。

1.4.
2.2 氨基酸组成分析
根据文献[25]，取滑菇肽10 mg于水解管中，加入盐酸（6 mol/L）10 mL，置于真空冷冻干燥机中，抽真空，充氮气，反复3次，封口；110℃水解22 h，冷却；滤膜过滤，取滤液500 μL于容量瓶中，50℃干燥，加入盐酸（0.05 mol/L）1
mL溶解，滤膜过滤，氨基酸自动分析仪测定。

1.4.3 培养方法
1.4.3.1 滑菇肽对凝乳时间的影响
向脱脂乳培养基中添加不同浓度（0.5、1.0、2.0、4.0 g/L）的滑菇肽，以未加滑
菇肽的脱脂乳培养基为对照，按5%接种量接入青春双歧杆菌，37℃发酵至凝乳，
观察凝乳时间的变化。

1.4.3.2 滑菇肽对青春双歧杆菌生长的影响
向双歧杆菌液体培养基中添加不同浓度（0.5、1.0、2.0、4.0 g/L）的滑菇肽，以未加滑菇肽的双歧杆菌液体培养基为对照，按5%接种量接入青春双歧杆菌，37℃厌氧培养12 h，每隔2小时取样1次，测定活菌数，研究滑菇肽对青春双歧杆菌
生长的影响。

1.4.3.3 滑菇肽对pH值的影响
向双歧杆菌液体培养基中添加不同浓度（0.5、1.0、2.0、4.0 g/L）的滑菇肽，以未加滑菇肽的双歧杆菌液体培养基为对照，按5%接种量接入青春双歧杆菌，37℃厌氧培养12 h，每隔2小时取样1次，测定pH值，研究滑菇肽对pH值的影响。

1.4.3.4 滑菇肽对冷藏过程中活菌数的影响
向脱脂乳培养基中添加不同浓度（0.5、1.0、2.0、4.0 g/L）的滑菇肽，以未加滑菇肽的脱脂乳培养基为对照，按5%接种量接入青春双歧杆菌，37℃发酵至凝乳，然后4℃贮存28 d，每隔7天取样1次，测定活菌数，研究滑菇肽对冷藏过程中
活菌数的影响。

1.4.3.5 滑菇肽和低聚果糖对青春双歧杆菌促生长作用的比较
向双歧杆菌液体培养基中分别添加1.0 g/L的滑菇肽和低聚果糖，以未加滑菇肽或低聚果糖的脱脂乳培养基为对照，按5%接种量接入青春双歧杆菌，37℃厌氧培养12 h，每隔2小时取样1次，测定活菌数，比较滑菇肽和低聚果糖对青春双歧杆
菌的促生长作用。

1.5 数据处理
试验数据以平均值±标准偏差表示，采用Excel 2010软件绘图，SPSS 17.0软件
进行统计分析，所有试验3次平行。

2 结果与分析
2.1 对发酵乳凝乳时间的影响
以脱脂乳培养基为对照，添加不同浓度的滑菇肽，发酵培养青春双歧杆菌，观察凝乳时间的变化，结果见表1。

表1 滑菇肽对发酵乳凝乳时间的影响Table 1 Effect of ko peptides on curing time of fermented milk浓度/（g/L）凝乳时间/min 0 720±45 0.5 600±35 1.0 570±30 2.0 540±25 4.0 480±15
由表1可知，添加不同浓度的滑菇肽均可缩短凝乳时间，随着浓度增大，凝乳时间逐渐缩短，表明滑菇肽对青春双歧杆菌生长具有促进作用。

2.2 对青春双歧杆菌生长的影响
以双歧杆菌液体培养基为对照，添加不同浓度的滑菇肽，发酵培养青春双歧杆菌，研究发酵过程中活菌数的变化，结果见图1。

图1 滑菇肽对青春双歧杆菌生长的影响Fig.1 Effect of ko peptides on growth of B.adolescentis
由图1可知，在0～12 h发酵过程中，各处理组与对照组均是4 h左右进入对数生长期，8 h左右进入平稳期。

与对照组相比，各处理组活菌数显著提高（P＜0.05），发酵12小时后，对照组活菌数对数值为8.79，而各处理组活菌数对数值分别为8.93、9.05、9.17、9.25，表明滑菇肽在0.5 g/L～4.0 g/L浓度范围内对青春双歧杆菌生长具有促进作用。

2.3 对pH值的影响
以双歧杆菌液体培养基为对照，添加不同浓度的滑菇肽，发酵培养青春双歧杆菌，研究发酵过程中pH值的变化，结果见图2。

由图2可知，各处理组的产酸性能高于对照组，且与发酵过程中活菌数变化趋势一致，随着浓度增大pH值逐渐降低。

在0～12 h发酵过程中，0～2 h各组pH 值差异不大，2 h～8 h各处理组与对照组pH值明显降低。

发酵12小时后，对照
组pH值为4.51，各处理组pH值分别为 4.39、4.21、4.13、4.01。

图2 滑菇肽对pH值的影响Fig.2 Effect of ko peptides on pH
2.4 对冷藏过程中活菌数的影响
将各处理组和对照组分别培养至凝乳，4℃贮存28 d，每隔7天取样1次，测定活菌数，结果见表2。

表2 滑菇肽对冷藏过程中活菌数的影响Table 2 Effect of ko peptides on viable counts during cold storage注：*与初始值比较差异显著，P＜0.05。

时间/d对照组/（活菌数：×108cfu/mL）滑菇肽组/（活菌数：×108cfu/mL）0.5 g/L 1.0 g/L 2.0 g/L 4.0 g/L 0 6.23±0.21 8.45±0.29 10.95±0.33
13.58±0.43 16.45±0.53 7 6.37±0.23 8.57±0.33 11.03±0.35 13.75±0.53 16.79±0.57 14 6.05±0.17 8.03±0.27 10.73±0.35 13.09±0.47 16.05±0.39 21
5.03±0.15* 7.65±0.25 9.87±0.33 12.37±0.41 15.13±0.43 28 3.79±0.11*
6.93±0.23* 9.05±0.27* 11.35±0.37* 14.28±0.37*
由表2可知，随着贮存天数的增加，活菌数呈先上升后下降的趋势。

从凝乳到冷藏7 d，青春双歧杆菌继续缓慢生长，活菌数略有上升。

冷藏7 d～28 d，pH值逐渐降低，不利于青春双歧杆菌生长，活菌数逐渐下降，但各处理组比对照组下降趋势缓慢。

冷藏28天后对照组活菌数为最初的60.8%，而各处理组活菌数分别为最初的82.0%、82.6%、83.6%、86.8%。

由于起始活菌数较高，28天后2.0 g/L 和4.0 g/L处理组活菌数仍维持在109cfu/mL以上。

2.5 滑菇肽和低聚果糖对青春双歧杆菌促生长作用的比较
以双歧杆菌液体培养基为对照，分别添加1.0 g/L的滑菇肽和低聚果糖，发酵培养青春双歧杆菌，研究发酵过程中活菌数的变化，结果见表3。

由表3可知，与对照组相比，低聚果糖和滑菇肽处理组活菌数明显提高（P＜
0.05），发酵12小时后，对照组活菌数为5.78×108cfu/mL，而低聚果糖和滑菇
肽处理组活菌数分别为9.05×108、1.18×109cfu/mL，表明滑菇肽和低聚果糖对青春双歧杆菌均有促生长作用，且滑菇肽的促生长作用优于低聚果糖。

表3 滑菇肽和低聚果糖对青春双歧杆菌促生长作用的比较Table 3 Comparison
of the prebiotic effects of ko peptides and fructooligosaccharides
on B.adolescentis注：*与对照组比较差异显著，P＜0.05；#与低聚果糖组比较
差异显著，P＜0.05。

时间/h对照组/（活菌数：×108cfu/mL）0.10 0.10 0.10 2 0.13±0.01 0.17±0.01* 0.15±0.01 4 0.19±0.01 0.35±0.02* 0.33±0.02*6
0.65±0.03 1.47±0.07*# 1.09±0.05*8 2.37±0.13 6.35±0.27*# 5.29±0.23*10 4.09±0.19 9.37±0.33*# 7.07±0.31*12 5.78±0.23 11.79±0.37*# 9.05±0.27*
低聚果糖组/（活菌数：×108cfu/mL）0滑菇肽组/（活菌数：×108cfu/mL）
2.6 氨基酸组成
滑菇肽的氨基酸组成如表4所示。

研究表明，Met、Lys是双歧杆菌生长的必需氨基酸，Asp、Arg、Glu、Leu 等能够促进双歧杆菌生长，而滑菇肽含有较高含量的 Asp、Glu、Leu、Arg和 Lys，
这可能是滑菇肽被双歧杆菌分解成氨基酸后易被菌体利用，从而促进菌体生长的重要原因。

表4 滑菇肽氨基酸组成Table 4 Amino acid composition of ko peptides氨基酸含量/% 氨基酸含量/% 氨基酸含量/%天冬氨酸（Asp）
11.03±0.66 丙氨酸（Ala）3.07±0.12 酪氨酸（Tyr）6.05±0.30苏氨酸（Thr）3.25±0.13 缬氨酸（Val）5.13±0.26 苯丙氨酸（Phe）5.03±0.25丝氨酸（Ser）3.79±0.15 蛋氨酸（Met）2.89±0.12 赖氨酸（Lys）9.05±0.45谷氨酸（Glu）15.27±0.92 异亮氨酸（Ile）3.03±0.12 组氨酸（His）2.73±0.11脯氨酸（Pro）4.75±0.19 亮氨酸（Leu）12.75±0.77 精氨酸（Arg）9.65±0.48甘氨酸（Gly）2.53±0.10
3 结论
在本研究的试验条件下，滑菇肽在0.5g/L～4.0 g/L的浓度范围内，对青春双歧杆菌的生长具有促进作用，发酵12小时后活菌数最高可达1.48×109cfu/mL。

滑菇肽的添加不仅可以提高产酸性能，缩短凝乳时间，还可以提高青春双歧杆菌活力，增强其对酸性环境的耐受力，冷藏28天后活菌数仍维持在80%以上。

滑菇肽对青春双歧杆菌的促生长作用优于低聚果糖，这可能与滑菇肽作为蛋白质水解产物而不是纯寡聚糖类物质有关，因此，滑菇肽中双歧杆菌促生长因子的具体成分及其作用机制还有待进一步研究。

参考文献：
【相关文献】
[1] Aida FMNA，Shuhaimi M，Yazid M，et al.Mushroom as a potential source of prebiotics：a review[J].Trends in Food Science and Technology，2009，20(11/12)：567-575
[2] 兰玉菲，安秀荣，王庆武，等.蕈菌作为益生元新来源的潜力研究[J].中国食用菌，2011，30(2)：52-54
[3] 王芳，马俪珍，孙卫青.香菇浸提液对乳酸菌生长的作用[J].山西农业大学学报(自然科学版)，2002，22(2)：159-161
[4] 郭红珍，张燕.金针菇与香菇酸奶的研制[J].中国乳业，2005，25(9)：37-39
[5] 李科德，韩木兰.猴头菇抽提物对乳酸菌生长的影响[J].微生物学杂志，2000，20(2)：34-35
[6] 王世强，屈艳.猴头菇复合保健酸奶的研制[J].中国酿造，2009，28(10)：166-167
[7] 张功，王瑞君，峥嵘.平菇浸汁促进嗜酸乳杆菌生长的研究[J].微生物学通报，2001，29(4)：
65-67
[8] 韩雪，张兰威.双歧杆菌增殖因子的筛选及培养基的优化[J].食品与生物技术学报，2005，24(4)：69-72
[9] Synytsya A，Mícˇková K，Synytsya A，et al.Glucans from fruit bodies of cultivated mushrooms Pleurotus ostreatus and Pleurotus eryngii：Structure and potential prebiotic activity[J].Carbohydrate Polymers，2009，76(4)：548-556
[10]刘丹，潘道东.柳松菇抽提物对乳酸菌发酵性状的影响[J].中国乳品工业，2005，33(12)：12-
15
[11]曹荣安，韩建春，孔保华，等.巴西菇对嗜热链球菌生长影响的研究[J].食品工业科技，2006，27(1)：79-80
[12]闫丽莉，韩建春.姬松茸多糖对乳酸菌生长的影响[J].中国乳品工业，2008，36(12)：7-10
[13]赵伯菁.三种食用菌提取物对乳酸菌生长的影响[J].食品科技，2009，34(12)：261-264
[14]王芳，马俪珍.鸡腿菇浸提液对乳酸菌生长的作用[J].山西农业大学学报(自然科学版)，2003，
23(4)：342-344
[15]Gao S，Lai CKM，Cheung CKP.Nondigestible carbohydrates isolated from medicinal mushroom sclerotia as novel prebiotics[J].International Journal of Medicinal Mushrooms，2009，11(1)：1-8
[16]Guo FC，Williams BA，Kwakkel RPK，et al.Effects of mushroom and herb polysaccharides，as alternatives for an antibiotic，on the cecal microbial ecosystemin broiler chickens[J].Poultry Science，2004，83(2)：175-182
[17]Willis WL，Isikhuemhen OS，Ibrahim SA.Performance assessment of broiler chickens given mushroom extract alone or in conbination with probiotics[J].Poultry Science，2007，86(9)：1856-1860
[18]Willis WL，King K，Iskhuemhen OS，et al.Administration of mushroom extract to broiler chickens for bifidobacteria enhancement and Salmonella reduction[J].Journal of Applied Poultry Research，2009，18(4)：658-664
[19]傅祖良，王康宁，吴仿琪，等.银耳孢子发酵物及与pGRF基因质粒合用对断奶仔猪生长、部分免疫指标及肠道菌群的影响[J].动物营养学报，2009，21(5)：777-783
[20]李好，于世军，王伟，等.富硒猴头菇对小鼠肠道菌群的调节作用[J].中国微生态学杂志，2010，22(8)：697-700
[21]Oyetayo VO，Oyetayo FL.Preliminary study of the health promoting potentials of Lactobacillus fermentum OVL and Plerotus sajor caju administered to rats[J].Pakistan Journal of Nutrition，2005，4(2)：73-77
[22]Giannenas I，Tontis D，Tsalie E，et al.Influence of dietary mushroom Agaricus bisporus on intestinal morphology and microflora composition in broiler
chickens[J].Research in Veterinary Science，2010，89(1)：78-84
[23]蔡文辉，杨景云，王亚贤，等.灵芝孢子粉对重症急性胰腺炎大鼠肠道微生态失调的调整作用[J].中国微生态学杂志，2008，20(2)：140-142
[24]钱磊，张志军，周永斌，等.酶法水解滑菇蛋白制备抗氧化肽的工艺优化[J].食品工业科技，2017，38(20)：72-76
[25]蔡露阳，张蓓蕾.大米肽对嗜酸乳杆菌的促生长作用[J].食品科技，2017，42(3)：10-14。