HPLC-MS法测定高温胁迫前后玉米幼苗6种酚酸类化合物含量

１００４ １６５６２０２００５ ０７９５ ０８
ＨＰＬＣ ＭＳ法测定高温胁迫前后玉米幼苗
６种酚酸类化合物含量
任园宇１，魏东伟１ ，孙武勇２，谢娟娟１
（１．河南农业大学生命科学学院，河南　郑州　４５０００２；
２．河南安必诺检测技术有限公司，河南　郑州　４５０００１）
摘要：为研究高温胁迫对不同品种玉米幼苗酚酸类化合物含量的影响，建立了同时测定６种酚酸化合物（没
食子酸、咖啡酸、绿原酸、香草酸、丁香酸和阿魏酸）的三重四级杆高效液相色谱 质谱串联方法（ＨＰＬＣ ＭＳ），
并用于高温胁迫前后不同品种玉米幼苗酚酸类化合物含量的检测。

该方法选用ＡｃｃｕｃｏｒｅＣ１８色谱柱（１５０ｍｍ×
２ １ｍｍ，２ ６μｍ）进行分离，以０ １％甲酸 甲醇溶液为流动相梯度洗脱。

选择电喷雾离子源（ＥＳＩ），在负离子扫
描条件下，采用多反应监测模式（ＭＲＭ）对６种酚酸类化合物进行检测。

结果表明，６种酚酸类化合物均可在
５ｍｉｎ内准确测定，且在５０～３０００ｐｐｂ浓度范围内与峰面积值线性良好，相关系数均大于０ ９９。

该方法的精密
度、重复性以及加标回收率均符合分析要求。

以所选６种酚酸化合物为参考，玉米幼苗体内鉴定出绿原酸、咖
啡酸与阿魏酸３种酚酸。

绿原酸含量最高，在９３ ４７～４０８ ６９μｇ·ｇ－１之间；阿魏酸含量其次，在２４ ０３～
３０ ９μｇ·ｇ－１之间；咖啡酸含量较低，在９ ９６～１５ ６７μｇ·ｇ－１之间。

高温胁迫处理前后，不同品种玉米幼苗各
酚酸含量有不同程度的变化，可能与其对高温胁迫的敏感性有关。

关键词：玉米幼苗；酚酸；高效液相 质谱串联法；高温胁迫
中图分类号：Ｏ６５７ ７ 文献标志码：Ａ
Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｓｉｘｐｈｅｎｏｌｉｃｃｏｍｐｏｕｎｄｓｉｎｃｏｒｎｓｅｅｄｌｉｎｇｓｂｅｆｏｒｅ
ａｎｄａｆｔｅｒｈｉｇｈｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓｔｒｅｓｓｂｙＨＰＬＣ ＭＳ
ＲＥＮＹｕａｎ ｙｕ１，ＷＥＩＤｏｎｇ ｗｅｉ１ ，ＳＵＮＷｕ ｙｏｎｇ２，ＸＩＥＪｕａｎ ｊｕａｎ１
（１．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＨｅｎａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ４５０００２，Ｃｈｉｎａ；
２．ＨｅｎａｎＡｎｂｉｎｕｏＴｅｓｔｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏ．，Ｌｉｄ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ４５０００１，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅａｉｍｉｓｔｏｓｔｕｄｙｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｈｉｇｈｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓｔｒｅｓｓｏｎｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｐｈｅｎｏｌｉｃａｃｉｄｓｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｖａｒｉｅｔｉｅｓｏｆｍａｉｚｅｓｅｅｄｌｉｎｇｓ，ａｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｔｒｉｐｌｅｑｕａｄｒｕｐｏｌｅｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＨＰＬＣ ＭＳ）ｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆ６ｋｉｎｄｓｏｆｐｈｅｎｏｌｉｃａｃｉｄｓ（ｇａｌｌｉｃａｃｉｄ，ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃａｃｉｄ，ｃａｆｆｅｉｃａｃｉｄ，ｖａｎｉｌｌｉｃａｃｉｄ，ｓｙｒｉｎｇｉｃａｃｉｄａｎｄｆｅｒｕｌｉｃａｃｉｄ）ｗａｓｄｅｖｅｌｏｐｅｄ，ｔｈｅｍｅｔｈｏｄｗａｓａｐｐｌｉｅｄｔｏｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｐｈｅｎｏｌｉｃｃｏｍｐｏｕｎｄｓｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍａｉｚｅｓｅｅｄｌｉｎｇｓｂｅｆｏｒｅａｎｄａｆｔｅｒｈｉｇｈｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓｔｒｅｓｓ．ＴｈｅｍｅｔｈｏｄｕｓｅｄＡｃｃｕｃｏｒｅＣ１８ｃｏｌｕｍｎ（１５０ｍｍ×２ １ｍｍ，２ ６μｍ）ｔｏｓｅｐａｒａｔｅｔｈｅｓａｍｐｌｅ，ａｎｄｔｈｅｇｒａｄｉｅｎｔｅｌｕ ｔｉｏｎｓｅｐａｒａｔｉｏｎｗａｓｃａｒｒｉｅｄｏｕｔｗｉｔｈ０ １％ｆｏｒｍｉｃａｃｉｄ ｍｅｔｈａｎｏｌｓｏｌｕｔｉｏｎａｓｍｏｂｉｌｅｐｈａｓｅ．Ｔｈｅｐｈｅｎｏｌｉｃａｃｉｄｓｗｅｒｅｔｈｅｎｉｏｎｉｚｅｄｗｉｔｈ
收稿日期：２０１９ １０ ２３；修回日期：２０１９ １２ ０９
基金项目：河南农业大学自然科学类青年创新基金项目（ＫＪＣＸ２０１５Ａ１４）资助
联系人简介：魏东伟（１９７９ ），女，博士，副教授，主要从事植物资源学研究。

Ｅ ｍａｉｌ：ｗｅｉｄｏｎｇｗｅｉ＠ｈｅｎａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
化学研究与应用第３２卷
ｎｅｇａｔｉｖｅｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ（ＥＳＩ ），ａｎｄｄｅｔｅｃｔｅｄｕｎｄｅｒｍｕｌｔｉｐｌｅｒｅａｃｔｉｏｎｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ（ＭＲＭ）ｍｏｄｅ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ６ｋｉｎｄｓｏｆｐｈｅ ｎｏｌｉｃａｃｉｄｓｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄａｃｃｕｒａｔｅｌｙｉｎ５ｍｉｎ，ａｎｄｇｏｏｄｌｉｎｅａｒｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｆｏｒａｌｌｐｈｅｎｏｌｉｃａｃｉｄｓｉｎｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａ ｔｉｏｎｒａｎｇｅｏｆ５０～３０００ｐｐｂｗｉｔｈｈｉｇｈｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓｏｖｅｒ０ ９９ Ａｌｓｏｔｈｅｐｒｅｃｉｓｉｏｎ，ｒｅｐｅａｔａｂｉｌｉｔｙａｎｄａｄｄｉｎｇｓｔａｎｄａｒｄｒｅｃｏｖ ｅｒｙｗｅｒｅｅｌｉｇｉｂｌｅｆｏｒｔｈｅａｎａｌｙｓｉｓ．Ｔｈｅｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃａｃｉｄ，ｆｅｒｕｌｉｃａｃｉｄａｎｄｃａｆｆｅｉｃａｃｉｄｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｉｎｔｈｅｍａｉｚｅｓｅｅｄｌｉｎｇｓ，ａｓｔｈｅｒｅ ｓｕｌｔｓｏｆｔｈｅ６ｋｉｎｄｓｏｆｐｈｅｎｏｌｉｃａｃｉｄ Ｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃａｃｉｄｗａｓｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔ，ｒａｎｇｉｎｇｆｒｏｍ９３ ４７ｔｏ４０８ ６９μｇ·ｇ－１；ｆｅｒｕｌｉｃａｃｉｄｃｏｎｔｅｎｔｗａｓｓｅｃｏｎｄ，ｂｅｔｗｅｅｎ２４ ０３ａｎｄ３０ ９μｇ·ｇ－１；　ａｎｄｃａｆｆｅｉｃａｃｉｄｃｏｎｔｅｎｔｗａｓｔｈｅｌｏｗｅｓｔ，ｂｅｔｗｅｅｎ９ ９６ａｎｄ１５ ６７μｇ·ｇ－１ Ｔｈｅｐｈｅｎｏｌｉｃａｃｉｄｃｏｎｔｅｎｔｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｖａｒｉｅｔｉｅｓｏｆｍａｉｚｅｓｅｅｄｌｉｎｇｓｖａｒｉｅｄｔｏｖａｒｙｉｎｇｄｅｇｒｅｅｓｂｅｆｏｒｅａｎｄａｆｔｅｒｈｉｇｈｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓｔｒｅｓｓ，ｗｈｉｃｈｗｅｒｅｒｅｌａｔｅｄｔｏｉｔｓｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｔｏｈｉｇｈｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓｔｒｅｓｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｍａｉｚｅｓｅｅｄｌｉｎｇｓ；ｐｈｅｎｏｌｉｃａｃｉｄ；ｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｔｒｉｐｌｅｑｕａｄｒｕｐｏｌｅｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ；ｈｉｇｈｔｅｍ ｐｅｒａｔｕｒｅｓｔｒｅｓｓ
玉米幼苗期是玉米从自养转变成异养的转折期，也是玉米生长发育的基础期。

在此阶段，若环
境温度为３５℃以上会使玉米幼苗的生长高度、干重受到明显影响。

因此，研究高温逆境对玉米幼苗生理代谢的影响，对保障玉米生产安全具有重要作用。

研究表明，高温、干旱等逆境胁迫会导致植物细胞代谢失衡，进而引起氧化胁迫和活性氧积累，最终对植物的生长发育造成严重影响［１］。

酚酸类化合物是一种广泛存在于植物体内的次生代谢产物［２ ３］，其苯环上含有若干个酚羟基，使其具有抗氧化、抗自由基等生理活性，能有效帮助植物减缓生物及非生物胁迫引起的自由基积累［４］。

现有研究表明，温度能够影响植物体内酚酸含量的积累［５］，因此本实验测定了高温胁迫前后四个品种玉米幼苗的酚酸含量，根据高温胁迫前后酚酸含量变化，判断高温胁迫对不同品种玉米幼苗酚酸含量的影响。

目前，酚酸的测定方法主要有分光光度法［６］、高效液相色谱法［７ ８］以及高效液相色谱 质谱串联法［９］等。

分光光度法定性准确性较差，不能区分结构相似的单一酚类物质，且易受样品中其他杂质的影响。

高效液相色谱法可以区分结构类似的单一酚酸类化合物，但分析时间较长。

高效液相色谱 质谱串联法根据目标分析物的离子特性对其进行定性与量化，与高效液相色谱法相比该方法降低了基质干扰和信噪比，且样品用量少，分析速度快而精准，更加适用于多种复杂化合物的同时测定。

如李亭亭等通过高效液相色谱 质谱串联法同时分析出牵牛子生品、炒品中９种酚酸化合物［１０］，黄桂东等利用高效液相色谱 质谱串联法对滁菊提取液的黄酮类及酚酸类化合物进行分离鉴定，测定出１１种酚酸化合物和２１种黄酮类化合物［１１］。

因此本研究采用高效液相色谱 质谱串联法，以所选６种酚酸标准品作为对照，对玉米幼苗体内酚酸化合物进行分析，检测高温胁迫前后不同品种玉米幼苗酚酸类化合物的含量变化，探讨高温胁迫对不同品种玉米幼苗酚酸含量的影响。

１　实验部分
１ １　材料
玉米籽粒：实验选取了四个近年来审定的适宜黄淮海地区种植的不同耐热性的玉米品种，品种选择依据赵霞等［１２］的研究结果。

包括郑单９５８（河南秋乐种业科技股份有限公司），浚单２０（北京屯玉种业有限责任公司），先玉３３５，登海６０５均购自山东登海先锋种业有限公司。

１ ２　仪器与试剂
ＴＳＱ Ｑｕａｎｔｉｓ三重四级杆液相色谱 串联质谱仪（美国ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ公司）；ＡｃｃｕｃｏｒｅＣ１８色谱柱
（１５０ｍｍ×２ １ｍｍ，２ ６μｍ，美国ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ公司）；高速冷冻离心机（德国Ｓｉｇｍａ公司）；ＥＲＡＡ ＨＭ ０１多管涡旋混合仪（上海安谱ＡＮＰＥＬ公司）；ＤＣ ２４氮吹仪（上海安谱ＡＮＰＥＬ公司）；ＩＫＡＭＳ３Ｂａｓｉｃ振荡器（日本岛津企业有限公司）；超声波清
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第５期任园宇，等：ＨＰＬＣ ＭＳ法测定高温胁迫前后玉米幼苗６种酚酸类化合物含量
洗机（宁波新芝公司）；ＵＷ２２０Ｈ电子天平（岛津企业（中国）有限公司）。

没食子酸（Ｇａｌｌｉｃａｃｉｄ，
批号：Ｇ２１３３０６７，合肥博美生物公司）；绿原酸（Ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃａｃｉｄ，批号：ＳＣ８２１０）、咖啡酸（Ｃａｆｆｅｉｃａｃｉｄ，批号：Ｃ８９９０）、香草酸（Ｖａｎｉｌｌｉｃａｃｉｄ，批号：ＳＶ８０２０）、丁香酸（Ｓｙｒｉｎ ｇａｔｅ，批号：ＳＳ８７８０）以及阿魏酸（Ｆｅｒｕｌｉｃａｃｉｄ，批号：
ＳＦ８０３０），均购自北京索莱宝科技公司，以上酚酸标准品均纯度 ９８％。

Ｎ 丙基乙二胺（ＰＳＡ，批号：Ｘ１２５００６０）；ＬＣ Ｃ１８（批号：Ｘ５４６００１５）；石墨化碳黑（
ＧＣＢ，批号：Ｙ４７００１２０）均购自德国ＣＮＷ科技公司。

甲醇（色谱纯Ｍｅｔｈａｎｏｌ，批号：Ｑ／ＢＳＹＺ０１，天津四友精细化学品有限公司）；甲酸（
Ｆｏｒｍｉｃａｃｉｄ，批号：１３ ０１１ ０００３４，天津富宇精细化工有限公司）。

实验用水为ＧＢ／Ｔ６６８２规定的
一级水。

１ ３　实验方法１ ３ １　色谱条件　流动相：０ １％甲酸（Ａ）
和甲醇（Ｂ）。

梯度洗脱程序：０～１ｍｉｎ，５％Ｂ，１～２ｍｉｎ，３０％Ｂ，２～３ｍｉｎ，９５％Ｂ，３～５ ５ｍｉｎ，９５％Ｂ，５ ５～
６ｍｉｎ，５％Ｂ。

流速：０ ３ｍＬ·ｍｉｎ－１。

柱温：３０℃。

进样量：１０μＬ。

１ ３ ２　质谱条件　电喷雾离子源（ＥＳＩ）：负离子
扫描；电喷雾电压３５００Ｖ，离子源温度３５０℃，雾化温度３５０℃，鞘气压力４０Ａｒｂ，辅助气压力１０Ａｒｂ，尾吹气压力０Ａｒｂ。

所选酚酸标准品的质谱参数见
表１。

表１　６种酚酸的质谱采集参数
Ｔａｂｌｅ１　Ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎｐａｒａｍｅｔｅｒｓｏｆ６ｋｉｎｄｓｏｆｐｈｅｎｏｌｉｃａｃｉｄｓ
酚酸保留时间（ｍｉｎ）
分子式
母离子（ｍ·ｚ－１
）定量子离子（ｍ·ｚ－１
）碰撞能量（ｅＶ）辅助定性子离子（ｍ·ｚ－１
）
碰撞能量
（ｅＶ）没食子酸１ ０４Ｃ７Ｈ６Ｏ５１６９ １１２５ １１５７９ １２４绿原酸３ ６８Ｃ１６Ｈ１８Ｏ９３５３ ０１９１ １１７１７３ １，１７９ ０
３１，１４咖啡酸３ ７７Ｃ９Ｈ８Ｏ４１７９ １１１７ １２５１５３１５香草酸３ ８０Ｃ８Ｈ８Ｏ４１６７ １１５２ １１４１０８ １，１２３ １１９，１１丁香酸３ ８３Ｃ９Ｈ１０Ｏ５１９７ １１８２ ０１４１６７ ０２０阿魏酸
４ ０３
Ｃ１０Ｈ１０Ｏ４
１９３ ０
１３４ １
１７
１４９ １，
１７８ ０
１２，
１４
１ ３ ３　
标准品储备液配制　分别称取没食子酸、绿原酸、咖啡酸、香草酸、丁香酸和阿魏酸标准品约１０ｍｇ，用甲醇溶解并定容至１０ｍＬ。

１ ３ ４　混合标准品溶液配制　精密量取各酚酸标准品储备液１ｍＬ，置于同一１０ｍＬ容量瓶中，混匀加甲醇定容，制得浓度为１００ｍｇ·Ｌ－１的混合标准溶液， ２０℃保存备用。

１ ３ ５　样品材料的制备　选取不同品种的玉米籽粒在恒温培养箱中进行水培育苗，待幼苗长至三叶期进行分组处理，一组作为对照组正常培育，一组作为胁迫组进行高温胁迫处理。

高温胁迫处理模仿田间高温状态，调整光照培养箱温度设置，使其从对照温度２８℃开始以２℃·ｈ－１
的速率增至４０℃，并在４０℃维持１ｈ，胁迫时长共６ｈ。

分别将
两组玉米幼苗第一片叶叶基以上部分剪取作为试验材料，并于恒温电热箱６０℃加热２ｈ烘干，经组
织粉碎机打碎过４０目分样筛，
收集粉末，标记后放置干燥器备用。

１ ３ ６　样品提取液的制备　称取玉米叶片样品
０ ５ｇ于５０ｍＬ离心管中，加入２０ｍＬ甲酸∶甲醇（５
∶９５）的提取溶剂，涡旋混匀１０ｍｉｎ，浸渍４ｈ，浸渍
结束后室温下超声提取３０ｍｉｎ，
随后８０００ｒｐｍ离心１０ｍｉｎ，
提取上清液Ａ；按照０ ０２５ｇ·ｍＬ－１
的比例依次称取Ｎ 丙基乙二胺ＰＡＳ、Ｃ１８官能团加入上清液Ａ，再加入适量石墨化炭黑ＧＣＢ（约３匙，），漩涡混匀３ｍｉｎ，于９０００ｒｐｍ离心３ｍｉｎ，收集上清液Ｂ；取１０ｍＬ上清液Ｂ进行氮吹浓缩至粘稠状（约一滴），加入１ｍＬ１０％甲醇复溶，涡旋震荡１ｍｉｎ，过
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化学研究与应用第３２卷
双层０ ２２μｍ（有机系、尼龙）微孔滤膜过滤后置于进样小瓶待测。

１ ４　方法学考察１ ４ １　标准曲线的建立　将１ ３ ４中配制的混合标准品溶液，依次逐级稀释，配置一系列不同浓度梯度的混合标准品溶液，按照１ ３ １与１ ３ ２条件进行检测。

以峰面积值（ｍＡｕ）为纵坐标（Ｙ）
，以待测混合标准品溶液浓度（ｎｇ·ｍＬ－１
）为横坐标（Ｘ）
，绘制标准曲线，计算６种酚酸标准品的线性回归方程和相关系数。

１ ４ ２　精密度　根据１ ３ １与１ ３ ２方法，将混合标准品溶液连续进样６次，计算没食子酸、绿原酸、咖啡酸、丁香酸、香草酸和阿魏酸相应ＲＳＤ值。

１ ４ ３　重复性　按照１ ３ ６方法平行制备六份
样品溶液，按照１ ３ １与１ ３ ２所示方法进样分析，根据测定结果分别计算没食子酸、绿原酸、咖啡酸、丁香酸、香草酸和阿魏酸对应ＲＳＤ值。

１ ４ ４　加标回收率　称取已知酚酸含量的样品６
份，添加定量１ ３ ３方法制备的混合标准品溶液，按照１ ３ ６方法平行制备样品溶液，以１ ３ １与１ ３ ２方法进样分析，
根据测定结果分别计算没食子酸、绿原酸、咖啡酸、丁香酸、香草酸和阿魏酸的相应加标回收率及ＲＳＤ值。

１ ５　样品含量的测定
按照１ ３ ６中方法制备样品待测液，以６种酚酸标准品质谱分析结果作参考，根据１ ３ １与１ ３ ２方法对玉米幼苗样品中各酚酸进行分离鉴定，并采用标准曲线法对各样品酚酸含量进行定量。

２　结果与讨论２ １　色谱条件的优化２ １ １　流动相的选择　洗脱溶剂对玉米叶片中酚酸类化合物成分的保留值以及分离度都有影响，最常用的有机溶剂为甲醇和乙腈。

本试验设计流动相为０ １％甲酸 甲醇溶液体系时，
峰型比０ ５％乙酸 乙腈有明显改善。

因此最终确定
０ １％甲酸为流动相Ａ和甲醇为流动相Ｂ，
优化后的梯度条件为０～１ｍｉｎ，５％Ｂ，１～２ｍｉｎ，３０％Ｂ，２～３ｍｉｎ，
９５％Ｂ，３～５ ５ｍｉｎ，９５％Ｂ，５ ５～６ｍｉｎ，５％Ｂ。

２ １ ２　样品预处理方法的优化　按照１ ３ ６样品提取液制备方法，分别以７０％乙醇（ｐＨ＝３ １）以及甲酸∶甲醇（体积比为５∶９５）两种提取剂来
制备玉米幼苗酚酸提取液。

结果表明，
７０％乙醇（ｐＨ＝３ １）溶液作为提取剂时样品的回收率较低，各酚酸化合物的平均回收率为６７ ２９％，
而甲酸∶甲醇（体积比为５∶９５）溶液作为提取剂时回收率较高，各酚酸化合物的平均回收率为９８ ００％。

因此，
本试验选用甲酸∶甲醇（体积比为５∶９５）体
系作为提取剂。

８
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第５期任园宇，等：ＨＰＬＣ ＭＳ法测定高温胁迫前后玉米幼苗６
种酚酸类化合物含量
图１　６种酚酸标准品的多反应监测模式（ＭＲＭ）色谱图
Ｆｉｇ．１　ＭＲＭｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓｏｆｓｉｘｐｈｅｎｏｌｉｃａｃｉｄｓｔａｎｄａｒｄｓ
２ ２　
方法学考察
２ ２ １　建立６种酚酸标准曲线　根据１ ４ １中方法以峰面积值为纵坐标，以峰面积值（ｍＡｕ）为纵
坐标（Ｙ）
，以待测混合标准品溶液浓度（ｎｇ·ｍＬ－１
）
为横坐标（Ｘ），得到６种酚酸标准品的线性回归方程和相关系数如表２所示。

ＬＯＤ为各酚酸
信噪比为３时对应的质量浓度，即最低检出限。

ＬＯＱ为各酚酸信噪比为１０时标准曲线上对应的最低浓度点，即最低定量限。

结果显示，没食子酸、绿原酸、咖啡酸、丁香酸、香草酸和阿魏酸标准品浓度和相应的峰面积值呈良好的线性关系，相关系数均大于０ ９９。

表２　６种酚酸的线性方程和相关系数
Ｔａｂｌｅ２　Ｌｉｎｅａｒｅｑｕａｔｉｏｎｓａｎｄｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓｆｏｒｓｉｘｋｉｎｄｓｏｆｐｈｅｎｏｌｉｃａｃｉｄｓ
酚酸线性回归方程
Ｒ２线性范围（ｎｇ·ｍＬ－１
）
ＬＯＤ
（μｇ·ｋｇ－１
）
ＬＯＱ
（μｇ·ｋｇ－１
）
没食子酸ｙ＝０ ９７４ｘ＋１１ ２２５１０ ９９８７５０ １０００２６２５０绿原酸ｙ＝１ ０１８３ｘ ２４ １６９６０ ９９４０１００ ３０００２５１００咖啡酸ｙ＝０ ９５２９ｘ＋２０ ２３６９０ ９９６９５０ １０００１９１００香草酸ｙ＝１ ０４１７ｘ １７ ９４７０ ９９７６５０ １０００１５１００丁香酸ｙ＝１ ０２６３ｘ ６ ５６９０ ９９８４５０ ５００３４２５０阿魏酸
ｙ＝０ ９９０１ｘ＋２ ０８８
０ ９９７４
５０ ５００
２８
２５０
２ ２ ２　
精密度检测结果　根据１ ４ ２计算得出
没食子酸、绿原酸、咖啡酸、丁香酸、香草酸和阿魏酸相应ＲＳＤ值如表３所示，分别为４ ７２％、
２ ３３％、１ ８６％、２ ８２％、３ ３６％、４ ９６％，
均在５％以下，表明精密度良好。

２ ２ ３　重复性检测结果　根据１ ４ ３方法的测定结果分别计算没食子酸、绿原酸、咖啡酸、丁香酸、香草酸和阿魏酸对应的ＲＳＤ值如表３所示，分别为５ ８９％、１ ０１％、３ ３９％、５ ８７％、６ ３２％、３ ２８％，均小于７％，重复性良好。

２ ２ ４　
加标回收率检测结果　根据１ ４ ４加标
回收率测定结果计算绿原酸、咖啡酸、丁香酸、香
草酸和阿魏酸的相应加标回收率如表３所示，
分别为８９ ３１％、９９ ０４％、９６ ７１％、９９ ９０％、１１２ １７％，均在８０％～１２０％之间，该加标回收率证明方法可靠。

其中没食子酸回收率达到１９０％，可能是在实验过程中反生化学反应，增加了原物质质量或者是在生成质谱图时受到了杂质峰的干扰。

９
９７
化学研究与应用
第３２卷
表３　６种酚酸的精密度、重复性和回收率（ｎ＝６）
Ｔａｂｌｅ３　Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ，ｒｅｐｅａｔａｂｉｌｉｔｙａｎｄｒｅｃｏｖｅｒｙｏｆｓｉｘｋｉｎｄｓｏｆｐｈｅｎｏｌｉｃａｃｉｄｓ（ｎ＝６）
酚酸精密度（％）重复性（％）样品含量（
ｍｇ·Ｌ－１
）添加量（ｍｇ·Ｌ－１
）测得量（ｍｇ·Ｌ－１
）回收率
（％）ＲＳＤ
（％）
没食子酸４ ７２５ ８９ＮＦ２０３８ １５１９０ ７７５ ８９绿原酸２ ３３１ ０１１２７ ６６２０１４５ ５２８９ ３１５ ６８咖啡酸１ ８６３ ３９５ ７１２０２５ ５２９９ ０４５ ００香草酸２ ８２５ ８７ＮＦ２０１９ ３４９６ ７１５ ８７丁香酸３ ３６６ ３０ＮＦ２０１９ ９８９９ ９０６ ３２阿魏酸
４ ９６
３ ２８
１１ ４０
２０
３３ ８３
１１２ １７
３ ８７
注：“ＮＦ”表示该物质未被检出
２ ３　
样品中酚酸含量测定
玉米幼苗中存在的酚酸种类多样［１３ １５
］，本研究以其中６种酚酸标准品作参考，在四个品种玉米幼苗均只检测出三种酚酸化合物，包括绿原酸、咖啡酸与阿魏酸。

周亚萍［１４
］等酚酸测定结果中郑单９５８、浚单２０玉米幼苗的绿原酸含量与咖啡酸含量均低于本实验同品种玉米幼苗所测结果，但其玉米幼苗酚酸种类鉴定结果多于本实验，除了与玉米样品的生长条件、品种差异有关外，也可能与提取、鉴定方法有关。

采用上述方法建立的酚酸标准曲线对各样品酚酸含量进行定量，单位玉米幼苗样品酚酸含量测定结果如表４所示，四个品种玉米幼苗的绿原
酸含量整体偏高，在９３ ４７～４０８ ６９μｇ·ｇ－１
之间；
阿魏酸含量其次，在２４ ０３～３０ ９μｇ·ｇ－１之间；咖啡酸含量最低，在９ ９６～１５ ６７μｇ·ｇ－１
之间。

表４中胁迫组 对照组表示玉米幼苗酚酸含量在高温胁迫后的含量变化，负值表示含量降低，结果显示，高温胁迫后绿原酸含量除了浚单２０有所降低，其他三个品种均提升，其中以先玉３３５变化绝对值最大，表明先玉３３５玉米幼苗绿原酸含量受高温胁迫影响最大；阿魏酸含量除了登海６０５有所增加，其余三个品种均有所降低；咖啡酸含量除浚单２０含量增加，其余三个品种均降低。

从整体趋势上看，高温胁迫后，除了绿原酸含量有所提升，其他两种酚酸含量均降低。

表４　单位玉米样品酚酸类化合物含量检测结果（ｎ＝３）
Ｔａｂｌｅ４　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓｏｆｐｈｅｎｏｌｉｃｃｏｍｐｏｕｎｄｓｉｎｕｎｉｔｃｏｒｎｓａｍｐｌｅｓ（ｎ＝３
）
玉米处理绿原酸（μｇ·ｇ－１）
咖啡酸
（μｇ·ｇ－１
）
阿魏酸（μｇ·ｇ－１
）
总酚酸含量
（μｇ·ｇ－１
）
对照组２４５ ３８±２ ９７１２ ３４±１ ３９２８ ４３±１ １５２８６ １５郑单９５８胁迫组３０３ ９７±１４ ３６
１１ ３７±０ １６２４ ０３±０ ８６
３３９ ３７胁迫组 对照组５８ ５９ ０ ９７ ４ ４５３ ２２对照组１０４ ４２±１０ ３２１１ ３１±０ ３１２７ ０６±０ ６４１４２ ７８浚单２０胁迫组９３ ４７±１ ３９１１ ９８±０ ４４
２５ ０５±１ ５７１３０ ５胁迫组 对照组 １０ ９５０ ６７ ２ ０１ １２ ２８对照组３１２ ８１±２０ ０１１５ ６７±２ ２０３０ ９±１ １９３５９ ３８先玉３３５胁迫组４０８ ６９±６ ６５
１０ ７８±０ １８２７ ５９±１ ４４４４７ ０６胁迫组 对照组９５ ８８ ４ ８９ ３ ３１８７ ６８对照组２１４ ２±３ ９４１０ ４４±０ ８７２７ １３±０ ６５２５１ ７７登海６０５
胁迫组２３６ ０３±５ ８５
９ ９６±０ ２９２８ ２２±０ ７５
２７４ ２１胁迫组 对照组
２１ ８３
０ ４８
１ ０９
２２ ４４
０
０８
第５期任园宇，等：ＨＰＬＣ ＭＳ法测定高温胁迫前后玉米幼苗６种酚酸类化合物含量
植物体内的酚酸含量易受生长环境的影响［１６
］。

高温胁迫对四个玉米品种３种酚酸含量的影响结果如图２所示，不同品种玉米幼苗高温胁迫前后酚酸含量有不同变化，如耐高温性弱的先玉３３５［１２
］酚酸含量变化最大，证明品种间因对高温敏感性不同而使酚酸含量的变化存在差异，周
亚萍［１４
］等的研究也认为不同耐旱性品种玉米幼苗酚酸含量在干旱胁迫下有不同表达。

此外，高温胁迫下玉米幼苗体内咖啡酸与阿魏酸整体含量降
低，
绿原酸含量增加，表明高温胁迫对玉米幼苗体
内不同酚酸的积累有不同的影响。

图２　高温胁迫对四个玉米品种３种酚酸含量的影响
Ｆｉｇ．２　Ｅｆｆｅｃｔｏｆｈｉｇｈｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓｔｒｅｓｓｏｎｔｈｒｅｅｋｉｎｄｓｏｆｐｈｅｎｏｌｉｃａｃｉｄｓｃｏｎｔｅｎｔｏｆｆｏｕｒｍａｉｚｅｖａｒｉｅｔｉｅｓ
３　
结论
玉米体内酚酸类化合物的分析与定量是研究玉米生理代谢的基础工作之一。

本研究建立了同时测定６种酚酸类化合物的三重四级杆高效液相
色谱 质谱串联方法（ＨＰＬＣ ＭＳ）
，对样品提取方法以及色谱条件进行优化，使６种酚酸类化合物均可在５ｍｉｎ内准确测定，且在５０～３０００ｐｐｂ浓度范围内线性良好，相关系数均大于０ ９９，方法的精密度、重复性以及加标回收率均符合分析要求。

将该方法应用于实验选用的四个不同耐热性品种郑单９５８、
浚单２０、先玉３３５、登海６０５玉米幼苗酚酸种类的鉴定，及高温胁迫前后的酚酸含量测定。

结果表明，四个品种玉米幼苗均只鉴定出绿原酸、阿魏酸与咖啡酸３种酚酸，绿原酸含量最高，在
９３ ４７～４０８ ６９μｇ·ｇ－１之间；
阿魏酸含量其次，在２４ ０３～３０ ９μｇ·ｇ－１之间；
咖啡酸含量最低，在９ ９６～１５ ６７μｇ·ｇ－１
之间。

不同品种玉米幼苗高温胁迫前后酚酸含量有不同变化，说明品种间因对高温敏感性不同而使酚酸含量的变化存在差异。

高温胁迫下玉米幼苗体内咖啡酸与阿魏酸整体含量降低，而绿原酸含量增加，表明高温胁迫对玉米幼苗体内不同酚酸的积累有不同的影响。

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（责任编辑　李　方）
２０８。