棘皮动物弧菌诱导中间球海胆免疫致敏现象分析

第39卷第2期大连海洋大学学报Vol.39No.2 2024年4月JOURNAL OF DALIAN OCEAN UNIVERSITY Apr.2024
DOI:10.16535/ki.dlhyxb.2023-196文章编号:2095-1388(2024)02-0266-09棘皮动物弧菌诱导中间球海胆免疫致敏现象分析
殷维骏,刘岩松,田文卓,欧凡江,刘雷,丁君,张伟杰∗,常亚青∗
(大连海洋大学农业农村部北方海水增养殖重点实验室,辽宁大连116023)
摘要:为探究中间球海胆(Strongylocentrotus intermedius)是否存在免疫致敏现象,使用棘皮动物弧菌
(Vibrio echinoideorum)对中间球海胆进行重复感染(首次㊁二次菌浓度分别为103㊁104CFU/mL),检测并
比较了两次注射感染后不同时间点中间球海胆体腔细胞密度㊁吞噬能力㊁酸性磷酸酶(ACP)活力㊁活性
氧(ROS)含量㊁总抗氧化能力(T-AOC)等相关免疫指标的变化,以及二次感染后免疫致敏组和对照组
间成活率的差异㊂结果表明:与首次感染相比,二次感染时诱导致敏组的体腔细胞总密度㊁吞噬细胞密
度㊁ACP㊁ROS和T-AOC等均出现显著上升(P<0.05),且响应时间明显缩短,达到峰值的时间分别提前
了36㊁36㊁84㊁12㊁36h,且各指标的峰值均显著高于首次感染(P<0.05);二次感染后,诱导致敏组在
6h时的吞噬率(45.41%ʃ6.39%)显著高于对照组(33.17%ʃ1.94%);经过棘皮动物弧菌低浓度诱导
后,诱导致敏组存活率(43.33%ʃ10.00%)显著高于未经诱导的阳性对照组(7.78%ʃ10.71%)(P<
0.05)㊂研究表明,低浓度棘皮动物弧菌能诱导中间球海胆产生免疫致敏现象,此结果可为中间球海胆的
疾病防控提供新思路㊂
关键词:中间球海胆;棘皮动物弧菌;免疫致敏;免疫指标
中图分类号:S947.9㊀㊀㊀㊀文献标志码:A
㊀㊀中间球海胆隶属于棘皮动物门(Echinodermata)海胆纲(Echinoidea)正形目(Camarodonta)球海胆科(Strongylocentrotidae)球海胆属(Strongylocen-trotus),1989年由大连海洋大学从日本引入国内,因其性腺色泽好㊁味甜,深受消费者喜爱[1]㊂2020年中国海胆产量为7952.53t,2021年产量上升至13600t[2],增长率高达70%㊂随着养殖规模的不断扩大,各养殖区经常发生掉棘病㊁红斑病和黑嘴病等细菌性疾病[3],严重影响了海胆养殖业的健康发展㊂随着研究人员对海胆疾病病原研究的逐渐深入,对黑嘴病等疾病的发病规律及防治策略也有了新的认识[4-5],但限于自然海域养殖的特殊性,海胆养殖中仍然缺乏有效的疾病治疗方法,目前抑制疾病暴发最有效的方法仍是预防㊂
在水产养殖中,已经有多种途径可提高养殖物种的免疫力,以预防疾病和降低损失㊂例如在饲料中添加免疫增强剂[6-7]和中药提取物[8],在饲料或养殖水体中施加噬菌体[9]或益生菌[10-11],以及开展抗病育种[12]等㊂由于海胆属于啃食的摄食方式,在饲料中添加免疫增强剂㊁中药提取物等会因
海胆摄食速度慢㊁饲料溶蚀严重而降低效果;又由
于海胆的主要养殖方式为基于开放海域的筏式养殖
或底播增殖,无法向养殖水体施加噬菌体㊁益生菌
等制剂㊂因此,已广泛应用于水产动物中的大部分
增强免疫方式在海胆养殖中难以实现㊂长期以来,
人们认为无脊椎动物不存在获得性免疫,随着对无
脊椎动物免疫研究的不断深入,研究人员发现,许
多无脊椎动物在重复感染病原后,体内非特异性免
疫指标显著高于首次感染[13],但由于无脊椎动物缺乏与脊椎动物相似的免疫元件,为了与脊椎动物
的适应性免疫进行区分,将无脊椎动物的适应性免
疫现象称为免疫致敏[14]㊂如Milutinovic'等[15]发现,红棕象甲(Rhynchophorus ferrugineus)口服苏云金芽孢杆菌培养液(过滤除菌)后,能够显著提高苏云金芽孢杆菌攻毒后红棕象甲的存活率㊂虾蟹类能够通过改变唐氏综合征细胞黏附分子的可变
㊀收稿日期:2023-09-05
㊀基金项目:辽宁省教育厅基本科研面上项目(LJKZ0702);辽宁省海洋经济发展项目(20220001);2023中央财政对辽宁渔业补助项目;
大连市重点研发计划项目(2022YF16SN067);农业农村部农业科研杰出人才及创新团队项目
㊀作者简介:殷维骏(1999 ),男,硕士研究生㊂E-mail:420601462@
㊀通信作者:张伟杰(1984 ),男,高级实验师㊂E-mail:zhangweijie@
常亚青(1967 ),男,博导,教授㊂E-mail:yqchang@(并列通信作者)
剪切应对病原或灭活病原的重复刺激,提高机体的抗病能力并参与免疫致敏过程[16]㊂Zhang等[17]㊁王伟林[18]发现,长牡蛎(Crassostrea gigas)在面对灿烂弧菌重复感染时,可以通过快速增殖淋巴细胞来特异性地增强对病原的抵抗能力㊂Burciaga 等[19]使用大肠杆菌重复感染东非蜂(Apis mellif-era)发现,免疫记忆组相较对照组获得了更高的存活率和溶菌活力㊂免疫致敏现象的发现,为开发无脊椎动物病害防控新方法提供了新的思路,即通过免疫致敏,可使动物体内产生类似于抗体作用的免疫能力,尤其是对于存在上述技术难点的海胆来说,免疫致敏的利用更为重要㊂然而,中间球海胆中是否存在免疫致敏现象尚不明确㊂
本课题组前期对中间球海胆黑嘴病病原菌进行鉴定发现,该病原为棘皮动物弧菌(Vibrio echi-noideorum)[4]㊂本试验中,使用棘皮动物弧菌对中间球海胆进行重复感染,对吞噬细胞吞噬作用等相关免疫指标及感染后的存活率进行了比较分析,探究了中间球海胆的免疫致敏现象,并探讨了利用该现象进行疾病防控的可行性,以期为海胆养殖的疾病防控提供理论和技术参考㊂
1㊀材料与方法
1.1㊀材料
试验用中间球海胆取自大连海洋大学农业农村部北方海水增养殖重点实验室同批次人工繁育群体,挑选壳径为2~3cm的健康个体作为试验材料㊂病原菌为本实验室分离纯化的棘皮动物弧菌[4]㊂
1.2㊀方法
1.2.1㊀吞噬作用相关免疫指标免疫诱导试验㊀试验设计:本课题组前期研究表明[4-5],使用浓度为102CFU/mL的棘皮动物弧菌在13ħ水温下感染中间球海胆,即可使海胆患病㊂在后续研究中作者发现,棘皮动物弧菌对中间球海胆的感染效果受水温极显著影响(数据待发)㊂本次免疫诱导试验在20ħ下进行,经预试验发现,浓度为103~ 104CFU/mL的棘皮动物弧菌均不能使中间球海胆感染㊂因此,本试验使用103CFU/mL低浓度棘皮动物弧菌进行首次免疫诱导,为保证样本数量,使用略高但不致死的104CFU/mL菌浓度进行二次感染㊂具体试验过程为:将120只中间球海胆随机分配至8个40L塑料水槽中,每个水槽中放置15只㊂试验分对照组和诱导致敏组,每组设4个平行㊂试验开始前将海胆在水槽中暂养3d㊂首次感染时,诱导致敏组采用无菌注射器注射90μL103CFU/mL 的棘皮动物弧菌菌液+10μL荧光微球(天津倍乐思,直径1μm),对照组注射90μL无菌海水+ 10μL荧光微球㊂首次感染结束4d后开始二次感染㊂二次感染时,诱导致敏组采用无菌注射器注射90μL104CFU/mL的棘皮动物弧菌菌液+10μL荧光微球,对照组注射90μL无菌海水+10μL荧光微球㊂分别在首次感染前(0h)和首次感染后6㊁12㊁24㊁48㊁96h,以及二次感染前(0h)和二次感染后6㊁12㊁24㊁48㊁96h进行吞噬作用相关免疫指标取样㊂
取样方法:从每个水槽随机取2只海胆,解剖后从每个个体等量吸取600μL体腔液进行混合作为1个样本,每个时间点上免疫致敏组和对照组各获得4个体腔液样本㊂在每个体腔液样本中分别加入2.8mL抗凝剂(20mmol/L Tris-HCl+0.5mol/L NaCl+70mmol/L EDTA,pH7.5),混匀振荡后分装入8个1.5mL离心管中,每支离心管装入0.5mL体腔液㊂随机取3管体腔液用于体腔细胞分类计数㊂本课题组前期研究[5]表明,中间球海胆感染棘皮动物弧菌后,体腔液上清液吞噬作用相关免疫指标变化不显著,因此,本试验中仅测定体腔细胞的免疫参数㊂将剩余5管体腔液于4ħ下以3000r/min离心10min,收集体腔细胞,于-80ħ下保存,用于后续免疫参数的测定㊂
体腔细胞分类计数:使用血球计数板对体腔细胞进行分类计数,分类依据参考Deveci等[20]的体腔细胞分类方法,将每个样本3次计数获得的各细胞密度取平均值,乘以稀释倍数(3.3倍)后获得该样本各细胞的实际密度㊂
吞噬相关免疫参数检测:体腔细胞中酸性磷酸酶(ACP)活力㊁活性氧(ROS)含量㊁总抗氧化能力(T-AOC)等免疫参数均采用碧云天生物技术(上海)有限公司相关试剂盒测定,所有检测步骤均按照试剂盒说明书操作㊂
体腔细胞吞噬能力检测:分别从各组随机取3只海胆,使用荧光显微镜对吞噬细胞总数㊁参与吞噬的细胞数及被吞噬的荧光微球数进行计数,并计算吞噬率和吞噬指数,即
㊀吞噬率=参与的吞噬细胞数/总吞噬细胞数ˑ㊀㊀㊀100%,(1)㊀吞噬指数=吞噬荧光微球数/吞噬细胞总数㊂(2) 1.2.2㊀致死试验㊀经预试验发现,在5ħ水温下,
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第2期殷维骏,等:棘皮动物弧菌诱导中间球海胆免疫致敏现象分析
103CFU/mL的棘皮动物弧菌不能感染中间球海胆,而104CFU/mL可以使其感染㊂因此,本次致死试验在5ħ下进行㊂致死试验过程:将180只海胆平均放入6个40L水槽中,分为阳性对照组㊁诱导致敏组,每个水槽放30只海胆㊂诱导阶段:致敏组使用无菌注射器刺破海胆围口膜,然后向水槽中加入棘皮动物弧菌,使其终浓度为103CFU/mL,对海胆进行免疫诱导,阳性对照组只损伤海胆围口膜,不加菌液诱导;诱导24h后换水一次,此后每两天换水一次㊂攻毒阶段:5d后对海胆进行攻毒处理,均向诱导致敏组和阳性对照组水槽中加入棘皮动物弧菌,使其终浓度为104CFU/mL,攻毒后24h时记录海胆存活率㊂
1.3㊀数据处理
试验数据以平均值ʃ标准差(meanʃS.D.)表示,采用SPSS26.0软件对中间球海胆存活率㊁各免疫参数进行单因素方差分析(one-way ANOVA),采用LSD法进行组间多重比较,显著性水平设为0.05㊂
2㊀结果与分析
2.1㊀棘皮动物弧菌感染后体腔细胞密度的变化
免疫诱导试验中,两次感染过程中,免疫致敏组和对照组均未出现患病和死亡㊂
从图1可见:在首次感染后,对照组细胞总密度在试验期间无显著性变化,而诱导致敏组则呈现先降低后升高的变化趋势,并在48h时达到峰值[(232.56ʃ21.04)ˑ104cells/mL];与对照组相比,诱导致敏组在6㊁12㊁24h时显著降低(P< 0.05),在48㊁96h时显著升高(P<0.05)㊂在二次感染后,对照组细胞总密度总体上略呈降低趋势,而诱导致敏组呈波动变化,并在12㊁96h时出现两次峰值,诱导致敏组细胞总密度在所有时间点均显著高于对照组(P<0.05)㊂两次感染比较显示:对照组二次感染后细胞总密度在大部分时间点均显著低于首次感染(P<0.05),而诱导致敏组则相反,除48h外,在其他时间点均显著高于首次感染(P<0.05);诱导致敏组二次感染后细胞总密度在12h时达到第一个峰值,达峰时间较首次感染提前了36h,且峰值也显著提高(P<0.05)㊂从图2可见:在首次感染后,对照组吞噬细胞密度在试验期间无显著性变化,而诱导致敏组则呈现先下降后上升的趋势,并在48h时达到峰
值
x轴中s表示二次感染㊂∗表示同一时间点上,诱导致敏组与对照组间有显著性差异(P<0.05);标有不同小写字母者表示对照组各时间点间有显著性差异(P<0.05);标有不同大写字母表示诱导致敏组不同时间点间有显著性差异(P<0.05),下同㊂
The s in the abscissa denotes the secondary infection.∗indicates significant difference between the induced immune priming group and the control group at the same time point(P<0.05).The means with different letters are significantly different among time points in control group(P<0.05).The means with different capital letters are significantly different among time points in induced immune prim-ing group(P<0.05),et sequentia.
图1㊀两次棘皮动物弧菌感染后中间球海胆体腔细胞密度的变化
Fig.1㊀Changes in coelomocyte cell density in the sea urchin exposed to twice challenge with Vibrio
echinoideorum
图2㊀两次棘皮动物弧菌感染后中间球海胆吞噬细胞密度的变化
Fig.2㊀Changes in phagocytic amoebocyte density in the sea urchin exposed to twice challenge with Vibri-
o echinoideorum
[(106.94ʃ15.84)ˑ104cells/mL];与对照组相比,诱导致敏组在6h时显著降低(P<0.05),在48㊁96h时显著升高(P<0.05)㊂在二次感染后,对照组吞噬细胞密度呈下降趋势,而诱导致敏组则呈波动变化,诱导致敏组吞噬细胞密度在所有时间点均显著高于对照组(P<0.05)㊂两次感染比较显示:对照组二次感染后吞噬细胞密度整体低于首次
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感染,而诱导致敏组则相反,除48h 外,在其他时间点均显著高于首次感染(P <0.05);诱导致敏组二次感染后吞噬细胞密度在12h 时达到第一个峰值[(135.33ʃ7.10)ˑ104cells /mL],达峰时间
较首次感染提前了36h,且峰值也显著提高(P <
0.05)㊂
从图3可见:在首次感染后,对照组红色桑葚
细胞密度呈现先升高后下降的趋势,在12h 时达到峰值[(36.17ʃ8.65)ˑ104cells /mL],而诱导致
敏组红色桑葚细胞密度则呈现逐渐上升的趋势,并在96h 时达到峰值[(29.55ʃ13.27)ˑ104cells /
mL];诱导致敏组红色桑葚细胞密度在6h 时显著
低于对照组(P <0.05)㊂在二次感染后,对照组与诱导致敏组红色桑葚细胞密度均呈下降趋势,对照组整体无显著性变化,而诱导致敏组红色桑葚细胞密度在12h 时达到峰值[(42.78ʃ4.10)ˑ
104cells /mL];除48h 外,诱导致敏组在其余各
时间点均显著高于对照组(P <0.05)㊂两次感染比较显示:对照组二次感染后红色桑葚细胞密度除在12㊁96h 时显著低于首次感染外(P <0.05),在其
余时间点与首次感染均无显著性差异性(P >
0.05);诱导致敏组二次感染后在0~12h 时红色
桑葚细胞密度均显著高于首次感染(P <0.05),达峰时间较首次感染提前了84h,且峰值也显著提高
(P <0.
05)㊂
图3㊀两次棘皮动物弧菌感染后中间球海胆红色桑葚细
胞密度的变化
Fig.3㊀Changes in red spherual cell density in the sea
urchin exposed to twice challenge with Vibrio
echinoideorum
2.2㊀棘皮动物弧菌感染后细胞吞噬能力的变化由于荧光微球在体腔注射24h 后发生淬灭,
所以只对两次感染后6㊁12h 的吞噬能力进行分
析㊂从图4可见:在两次感染后,对照组与诱导致
敏组吞噬细胞的吞噬率均无显著性变化;在首次感染后,诱导致敏组吞噬率与对照组无显著性差异(P >0.05);在二次感染后,诱导致敏组吞噬率在6h 时显著高于对照组(P <0.05)㊂两次感染比较
显示,对照组二次感染后的吞噬率在所有时间点均显著低于首次感染(P <0.05),而诱导致敏组的吞噬率则略高于首次感染(P >0.
05)㊂
图4㊀两次棘皮动物弧菌感染后细胞吞噬率的变化Fig.4㊀Changes in coelomocy phagocytosis in the sea
urchin exposed to twice challenge with Vibrio
echinoideorum
从图5可见:在首次感染后,对照组的吞噬指数随感染时间的延长显著降低,而诱导致敏组则无显著性变化,在6h 时,诱导致敏组显著低于对照
组(P <0.05);在二次感染后,对照组的吞噬指数随感染时间的延长无显著性变化,而诱导致敏组则显著下降,在12h 时,诱导致敏组的吞噬指数显
著低于对照组(P <0.
05)㊂
图5㊀两次棘皮动物弧菌感染后中间球海胆吞噬指数的
变化
Fig.5㊀Changes in phagocytic index in the sea urchin
exposed to twice challenge with Vibrio echi-noideorum
2.3㊀棘皮动物弧菌感染后体腔细胞免疫酶活力的
变化
从图6可见:在首次感染后,对照组体腔细胞
ACP 活力在试验期间无显著性变化,诱导致敏组ACP 活力在48㊁96h 时显著高于对照组(P <
9
62第2期殷维骏,等:棘皮动物弧菌诱导中间球海胆免疫致敏现象分析
0.05);在二次感染后,对照组ACP 活力呈先降低
后升高的趋势,至96h 时达到峰值,而诱导致敏
组ACP 活力则呈波动变化,分别在12㊁96h 出现两次峰值;诱导致敏组ACP 活力在所有时间点均显著高于对照组(P <0.05)㊂两次感染比较显示:对照组二次感染后ACP 活力整体与首次感染无显著性差异,而诱导致敏组在12㊁24㊁96h 时均显
著高于首次感染(P <0.05);诱导致敏组二次感染后ACP 活力在12h 时达到第一个峰值,达峰时间
较首次感染提前了84h,且峰值也显著提高(P <
0.
05)㊂
图6㊀两次棘皮动物弧菌感染后中间球海胆酸性磷酸酶
活力的变化
Fig.6㊀Changes in acid phosphatase activity (ACP )in
the sea urchin exposed to twice challenge with
Vibrio echinoideorum
从图7可见:在首次感染后,对照组与诱导致敏组ROS 水平均呈现先升高后降低的趋势,对照组与诱导致敏组变化幅度大致相同,在大多数时间点二者间均无显著性差异(P >0.05);在二次感染后,对照组ROS 水平在各时间点变化不大,诱导致敏组则呈现先升高后降低的趋势,并在12h 时
达到第一个峰值[(109.25ʃ5.74)ˑ105
],诱导致
敏组在所有时间点均显著高于对照组(P <0.
05)㊂
图7㊀两次棘皮动物弧菌感染后中间球海胆活性氧的变化Fig.7㊀Changes in reactive oxygen species (ROS )in
the sea urchin exposed to twice challenge with
Vibrio echinoideorum
两次感染比较显示,二次感染后对照组ROS 水平整体低于首次感染,而诱导致敏组则相反㊂从图8可见:在首次感染后,对照组T-AOC
活力呈现先上升后下降的趋势,在6h 时显著升高
(P <0.05),而诱导致敏组则呈现先下降后上升的趋势,并在48h 时达到峰值(3.28U /mg ʃ
0.24U /mg);与对照组相比,诱导致敏组T-AOC
在6h 时显著降低(P <0.05),在12㊁48㊁96h 时
显著升高(P <0.05)㊂在二次感染后,对照组与诱导致敏组T-AOC 活力变化均比较平稳,对照组在6㊁12h 时显著降低(P <0.05),而诱导致敏组在
大部分时间点均无显著性差异;诱导致敏组在所有时间点均显著高于对照组(P <0.
05)㊂
图8㊀两次棘皮动物弧菌感染后中间球海胆总抗氧化能
力的变化
Fig.8㊀Changes in total antioxidant capacity (T-AOC )
in the sea urchin exposed to twice challenge with
Vibrio echinoideorum
2.4㊀两次棘皮动物弧菌感染后存活率的变化
致死试验中,首次感染时,阳性对照组㊁诱导致敏组均未出现死亡;二次感染时,阳性对照组㊁诱导致敏组攻毒后24h 时海胆存活率分别为
(17.78%ʃ10.71%)㊁(43.33%ʃ10.00%),诱导致敏组的存活率较阳性对照组显著提高25.6%(P <0.05)㊂
3㊀讨论
3.1㊀重复感染后中间球海胆免疫指标的变化及免
疫致敏现象
海胆的体腔细胞是棘皮动物面对病原感染的第
一道防线,是机体免疫屏障的重要组成部分,因此,在重复感染病原后,体腔细胞密度的变化可作为评价中间球海胆存在免疫致敏现象的重要标准㊂本研究发现,二次感染棘皮动物弧菌后,同时间点
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上,中间球海胆总体腔细胞密度㊁吞噬细胞密度及红色桑葚密度均较首次感染和对照组有明显升高,这说明首次感染诱导后的中间球海胆再次感染病原时,其体腔免疫细胞有更强的应对策略㊂变形吞噬细胞是行使免疫功能的主要细胞,可通过接触㊁捕获㊁吞噬外来粒子,将其降解后排出体外㊂红色桑葚细胞能够在海胆机体发生损伤后,通过阿米巴样运动移动到损伤部位附近并完成损伤修复[21],并可与吞噬细胞共同完成凝集反应[22],释放有抑菌能力的棘胞色素A[23]从而参与免疫应答过程㊂二
次感染后,吞噬细胞密度和红色桑葚细胞密度的增加,说明机体较首次感染进一步增强了对病原的吞噬作用㊁杀菌作用和修复作用,即可能在免疫细胞层面上存在着免疫致敏现象㊂一般认为,免疫致敏存在两种诱导模式:第一种模式是致敏的抗原诱导了持久的防御,从而导致宿主体内相关免疫效应分子数量较长时间保持较高水平,这种情况可能会与第二次感染时的免疫反应相结合,导致机体更强的免疫反应;另一种模式是诱导过程启动的免疫反应随时间的推移而减弱,第二次感染时引发更强或更快的免疫反应,促进病原的快速清除[24]㊂本研究中,对首次感染进行了96h的监测,之后又间隔4d进行了二次感染,诱导致敏组二次感染0h时,体腔细胞密度㊁吞噬细胞密度和红色桑葚细胞密度均显著高于首次感染0h㊂海胆体腔细胞保持较长时间高数量的这种现象不同于中华绒螯蟹(Erio-cheir sinensis)[25],但与第一种免疫致敏模式相符合,且在二次感染后,海胆体腔细胞密度出现更高水平的增长,仍符合第一种免疫致敏模式所描述的更强免疫反应,这与对黄粉虫(Tenebrio moli-tor)[26]㊁黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)[27]等无脊椎动物的研究结果类似㊂由此可见,中间球海胆在细胞层面上的免疫致敏现象可能属于第一种免疫致敏模式,而中华绒螯蟹等无脊椎动物的免疫致敏现象则可能属于第二种免疫致敏模式㊂
吞噬作用在无脊椎动物的免疫应答中居于重要地位[28],能够有效清除入侵体内的微生物㊂吞噬作用的强弱可以通过吞噬细胞密度㊁吞噬率及吞噬指数的高低进行判断㊂本研究中,利用荧光微球来检测中间球海胆的吞噬率和吞噬指数,由于荧光微球会随时间延长而发生淬灭,故仅在感染后6㊁12h进行了检测㊂相对于吞噬细胞数量的增幅(免疫致敏组vs对照组),吞噬率和吞噬指数的增幅较低,在二次感染12h时吞噬指数甚至出现了显著下降㊂即便如此,仍可推测出二次感染后中间球海胆的吞噬作用得到了加强,即诱导致敏组较对照组在6h时,吞噬细胞数提高了2.7倍,吞噬率提高了1.4倍;在12h时,吞噬细胞数提高了5.4倍,吞噬率提高了1.2倍,尽管吞噬指数降低了20%,仍可推测出整个机体的吞噬作用有所提高㊂从吞噬作用整体角度考虑,本研究中对中间球海胆的重复感染仍然诱导了其机体的免疫致敏㊂Zhang等[17]在长牡蛎的免疫致敏研究中观察到相似的现象:吞噬细胞密度和吞噬率显著上升而吞噬指数未显著上升㊂而曹家旺[29]对中国对虾(Fen-nerpenaeus chinensis)免疫致敏的研究中则观察到三者均显著上升的结果㊂这可能是不同物种面对病原感染时其吞噬作用的应对策略有差异引起的㊂由此推测,中间球海胆在重复感染病原诱导免疫致敏过程中,机体吞噬作用的提升倾向于首先依靠提高吞噬细胞的密度,其次是提高吞噬率,最后是提高吞噬指数㊂
酸性磷酸酶在两次感染期间的变化与体腔细胞数量的变化有所不同,区别在于ACP在二次感染前0h已与正常水平间无显著性差异,而相同点是二次感染后上升至更高的水平,这与Cong等[14]对栉孔扇贝免疫致敏现象的研究结果相似,该研究中栉孔扇贝(Chlamys farreri)的ACP在二次感染前恢复至正常水平,而二次感染后上升至更高的水平,这说明中间球海胆ACP的变化更接近于第二种免疫致敏模式㊂ACP是吞噬作用发生时一种重要溶酶体标志酶[30]㊂破损细胞或破损病原体及不溶性颗粒物质进入吞噬细胞后与初级溶酶体结合且被消化时,能够引起ACP的释放[31]㊂在刺参(Apostichopus japonicus)中,ACP能够消化细胞中由异物颗粒形成的吞噬体,也可直接对病原进行杀灭[32]㊂中间球海胆中ACP酶活的免疫致敏可能在二次感染后吞噬细胞内病原菌的清除过程中发挥重要作用㊂ROS在两次感染期间的变化与ACP相似,即ROS的变化仍属于第二种免疫致敏模式㊂王晶晶[25]在中华绒螯蟹免疫致敏诱导过程中同样发现,中华绒螯蟹ROS的变化符合第二种免疫致敏模式㊂ROS是伴随吞噬作用的呼吸爆发产生的活性物质,对病原的磷脂双分子膜㊁蛋白质乃至核酸均会产生严重的损伤[33],但同时也会对机体自身造成氧化损伤㊂ROS的免疫致敏现象有利于二次感染后吞噬细胞内病原菌的清除,在清除病原后恢复正常水平则有利于降低对自身的氧化损伤㊂为降低ROS对自身的氧化损伤,动物机体会提升自身的T-AOC㊂本研究中,免疫致敏组T-AOC在首次
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