干细胞移植前处理治疗椎间盘退行性病变研究进展

干细胞移植前处理治疗椎间盘退行性病变研究进展
殷翰林;邓国英;赵庆华
【摘要】椎间盘退行性病变的治疗方案主要侧重于缓解疼痛症状,但无法阻止退行性病变进程.基于此,干细胞移植治疗成为该领域的研究热点,其中干细胞移植前处理对治疗效果起决定性作用.目前移植前处理方法包括髓核细胞共培养、生长因子处理、低氧处理、转染、组织工程复合体及力学刺激.髓核细胞共培养可促进干细胞向髓核细胞表型分化;生长因子种类及浓度可调控干细胞的生长、分化;低氧环境前处理可显著增强干细胞的抗逆境能力;基因转染可有效调节干细胞分化,并增强其旁分泌能力;组织工程复合体可改善微环境,从而有利于维持干细胞活性;力学刺激可正性调控骨髓间充质干细胞的软骨样分化.该文就干细胞移植前处理治疗椎间盘退行性病变研究进展作一综述.
【期刊名称】《国际骨科学杂志》
【年(卷),期】2017(038)005
【总页数】4页(P299-302)
【关键词】椎间盘退行性病变;干细胞移植;前处理
【作者】殷翰林;邓国英;赵庆华
【作者单位】201620,上海交通大学附属第一人民医院骨科;201620,上海交通大学附属第一人民医院骨科;201620,上海交通大学附属第一人民医院骨科
【正文语种】中文
椎间盘退行性病变是骨科临床常见疾病，可导致严重的腰背痛，不仅给患者个人及家庭带来身心压力及生活中的诸多不便，也给社会造成极大的经济负担。

传统椎间盘退行性病变的治疗手段包括保守治疗和手术治疗，虽有一定的缓解作用，但两者均无法有效恢复椎间盘的功能[1]。

基于此，椎间盘退行性病变的生物学治疗逐渐引起重视，其中干细胞移植治疗凭借取材方便、多向分化潜能、不易发生免疫排斥反应、易于体外扩增等优势而受到广泛关注[2]。

目前干细胞移植面临的主要难题是如何使干细胞在椎间盘特殊微环境中存活、增殖与分化。

干细胞移植前处理可使干细胞适应椎间盘微环境，并促进其增殖分化，进而有效提高干细胞移植效率。

目前干细胞移植研究使用的种子细胞主要是骨髓间充质干细胞(BMSC)和脂肪源性干细胞(ADSC)。

干细胞移植前处理方法可分为髓核细胞(NPC)共培养、生长因子处理、低氧处理、转染、组织工程复合体及力学刺激。

本文就干细胞移植前处理方法作一综述。

与NPC共培养可促进干细胞向髓核样细胞表型分化，有利于适应椎间盘内的微环境。

BMSC与NPC共培养可促进BMSC向软骨样细胞分化，其可能途径有以下两条：①旁分泌刺激途径，NPC分泌的多种细胞因子和生长因子可促进BMSC向类髓核表型转化[3]，同时BMSC旁分泌产生的可溶性细胞因子能抑制核因子(NF)-κB、线粒体信号转导通路以及上调转化生长因子(TGF)-β、胰岛素样生长因子(IGF)-1、表皮生长因子(EGF)、骨形态发生蛋白(BMP)-7和血小板衍生生长因子(PDGF)等表达，不仅对NPC有营养作用，而且可增强其抗衰老、抗凋亡和抗炎能力，从而有利于NPC有丝分裂及组织恢复[4-6]；②细胞融合途径，细胞融合可增强成体干细胞可塑性及组织修复能力。

然而，在BMSC与NPC共培养中细胞融合是否真正发挥作用，仍存在争议。

总的来说，干细胞移植前与NPC共培养可促进细胞外基质合成，诱导干细胞向髓核样细胞转化，最终显著提高治疗成功率。

BMSC分化受到一系列细胞因子如TGF-β1、TGF-β3、生长分化因子(GDF)-5、GDF-6、IGF-1、BMP-2、PDGF、成纤维细胞生长因子(FGF)-2等[5,7]的影响。

TGF-β1可通过提高丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)活性，促进Sox9、Smad-3、Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖等基因表达，从而使多种细胞合成及分泌细胞外基质；TGF-β1也可作为诱导因子，诱导BMSC呈髓核样细胞表型[7-8]。

BMP-2可诱导BMSC分化为髓核样细胞表型，且与TGF-β1具有协同效应。

TGF-β3可促进多种细胞类型软骨样分化[9]。

Tao 等[10]研究TGF-β3和IGF-1对髓核源性干细胞(NPSC)增殖能力、生存能力、向NPC表型分化能力的影响及潜在机制，结果表明TGF-β3与IGF-1能协同提高NPSC生存能力、细胞外基质生物合成水平及向NPC分化能力，其作用机制与MAPK/细胞外信号调节激酶(ERK)信号转导通路的
活化有关。

研究[11]表明，GDF-6诱导BMSC髓核样表型分化及促进基质合成的
能力明显强于TGF-β1和GDF-5，而GDF-5较TGF-β1促进BMSC向髓核样细
胞分化更具优势。

此外，PDGF和FGF对BMSC的增殖以及软骨样分化的促进作用也已得到证实[12]。

在生长因子应用过程中，须注意把控生长因子的浓度，如过高浓度的BMP-2或TGF-β会导致骨生成和肥大[13]。

总之，生长因子处理有利于干细胞髓核样分化和细胞外基质合成，然而也存在失控的风险，但通过合理控制各种生长因子的浓度和比例可以有效避免这种风险的发生，因此生长因子前处理是有效的。

椎间盘是机体最大的无血管组织，存在特殊的低氧环境。

退变椎间盘中，氧气、葡萄糖浓度进一步降低，且基质酸度升高。

这些不利的环境条件可能会严重影响移植干细胞生存和组织修复能力，给椎间盘退行性病变的干细胞移植增加难度[14]。

因此，增强干细胞应对椎间盘微环境的能力显得尤为重要。

目前针对性前处理方式为低氧处理。

低氧处理对干细胞的影响主要有以下3方面。

①提高生存率。

在体内，
缺氧环境会导致BMSC凋亡，这与线粒体功能失调引发天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3活化以及内源性细胞胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)/硫化氢(H2S)系统抑制[15]有关。

而低氧处理后，可诱导BMSC促生存基因大量表达，有利于维持低氧诱导因子(HIF)-1α的稳定性，从而减少缺氧造成的细胞死亡[16]。

②促进增殖分化。

低氧可促进BMSC增殖与分化、调节BMSC旁分泌、促进多种分泌因子如血管内皮生长因子(VEGF)和白细胞介素(IL)-6的表达[16]。

低氧处理还可促进BMSC成软骨相关基因和标志表达，氨基聚糖(GAG)、聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的积累能诱导BMSC向髓核样细胞分化[17-18]，这与低氧环境促进蛋白激酶B(Akt)和p38 MAPK磷酸化及HIF-1α激活有关。

③迁徙归巢。

缺氧条件在BMSC迁徙和归巢中起着不可或缺的重要作用，主要依靠其促进间充质细胞源性因子-1及其受体CXCR4的表达来实现[16]。

总体而言，低氧处理可显著增强BMSC应对椎间盘不利微环境的能力。

基因转染能有效调节细胞分化，增强细胞旁分泌能力以达到提高细胞抗性的最终目的。

Sox9是属于Sox蛋白家族的转录因子，对成软骨和Ⅱ型胶原合成十分关键，被称为软骨表型的关键调控因子。

有研究[19]证实，Sox9转染BMSC有利于其软骨样分化。

Sun等[1]在大鼠模型上研究经腺病毒介导Sox9转染的BMSC移植治疗椎间盘退行性病变的效果，结果观察到转染组细胞外基质增多、髓核结构得到保持，表明Sox9转染可显著增强BMSC对退变椎间盘的修复作用。

此外，许多研究表明Sox5、Sox6和Sox9共转染可诱导ADSC和BMSC的软骨样分化[20]，然而对退变椎间盘的修复作用有待更多体内实验验证。

Bcl-2基因是细胞凋亡通路中的关键调节者之一。

Bcl-2基因过表达可延缓细胞死亡，增强细胞生存力。

Fang等[21]研究经绿色荧光蛋白(GFP)-Bcl-2转染的BMSC在缺氧条件下生存力和功能的改变，结果显示与未转染组相比，转染组凋
亡率更低，Sox9、聚集蛋白聚糖、Ⅱ型胶原和蛋白多糖等与软骨相关基因表达更
旺盛，表明移植前进行GFP-Bcl-2转染可提高BMSC在缺氧条件下的生存力并促进其向髓核样细胞分化。

由此可见，Bcl-2基因转染有利于干细胞在椎间盘微环境中的生存。

Wnt基因已被证实参与BMSC软骨样分化。

研究[22]显示，经Wnt11基因转染
的ADSC中, Sox9、蛋白聚糖和Ⅱ型胶原水平显著升高，表明Wnt11过表达可促使ADSC分化为髓核样细胞。

Wnt转染可作为椎间盘退行性病变的另一潜在治疗
手段。

除了基因过表达之外，还可通过沉默方式实现对干细胞的调控。

有研究表明，沉默抗软骨形成因子miR-221可在体内外高效促进人BMSC软骨化，且该过程不需要软骨诱导因子TGF-β的作用。

Lolli等[23]尝试转染miRNA拮抗剂沉默miR-221，先在3D培养基上探索此方法的可行性，随后在体内模型中进行验证。

然而该方法应用于椎间盘退行性病变修复有待进一步研究。

干细胞移植入椎间盘有3种方式[24]，即直接注入、随支架注入及基因转染后注入。

随支架注入的前提为构建组织工程复合体。

组织工程复合体模拟了细胞外基质的三维框架结构，有利于干细胞移植后的存活、分化及功能维持等，其作用可分为直接作用、间接作用和附加作用。

组织工程复合体能直接促进干细胞黏附与迁徙，进而维持干细胞活性，有利于其存活。

此外，组织工程复合体还能发挥促进细胞外基质合成和干细胞软骨样分化的间接作用。

有学者[25]将透明质酸作为ADSC的支架
植入犬退变椎间盘中，结果观察到Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖基因高表达和细胞外基质显著增多。

与此同时，组织工程复合体又能释放、传送促进细胞定植和祖细胞产生的物质。

影响组织工程复合体作用效果的因素众多。

近期研究[26]表明，种子细胞类型和
3D细胞组态在基质更新和增强细胞适应性方面扮演着关键角色。

支架材料的选择
同样至关重要，目前已有多种生物材料如水凝胶、Ⅰ型胶原、透明质酸、纤维蛋白、藻酸钙、壳聚糖和Ⅱ型胶原等可用于构建组织工程复合体，但何种材料能取得最佳效果仍需进一步研究。

Sun等[27]探究力学刺激条件下ADSC对NPC的影响，将两者置于压力刺激环境下共培养，结果表明ADSC能保护NPC不让其凋亡，其机制有抑制caspase-9、caspase-3活性，上调与细胞外基质相关基因表达，下调基质金属蛋白酶(MMP)
的合成和炎症因子产生。

径向压力更有利于BMSC向纤维环样细胞分化，动态压
力则更利于其向髓核样细胞分化[28]。

因此，干细胞移植前进行适度的力学刺激处理将有利于髓核组织的修复，呈现更好的移植后效果。

近期研究[29]揭示了干细胞如何通过改变其细胞核中DNA组装方式来感知并对外部机械力做出反应：机械力通过关键蛋白质emerin在核被膜上被感知，emerin将细胞核与DNA结构骨架
联系起来，全面变化DNA包装，从而使转录活性发生彻底改变。

ADSC在压力刺激下的分化可能也与之有关。

干细胞移植前处理有助于提高移植疗效，目前干细胞移植前处理治疗椎间盘退行性病变方法包括与NPC共培养、生长因子处理、低氧处理、基因转染、组织工程复合体及力学刺激。

此外，近年来针对关节滑膜源性干细胞(SDSC)、人诱导性多能
干细胞(hiPSC)、肌肉源性干细胞(MDSC)、NPSC、嗅神经干细胞等的研究也逐渐兴起[30-32]。

由此不难发现，干细胞移植前处理在干细胞移植治疗椎间盘退行性
病变中将成为必不可少的组件，具有较强的应用前景。

【相关文献】
[ 1 ] Sun W, Zhang K, Liu G, et al. Sox9 gene transfer enhanced regenerative effect of bone marrow mesenchymal stem cells on the degenerated intervertebral disc in a rabbit
model[J]. PLoS One, 2014, 9(4):e93570.
[ 2 ] Mascarinas A, Harrison J, Boachie-Adjei K, et al. Regenerative treatments for spinal conditions[J]. Phys Med Rehabil Clin N Am, 2016, 27(4):1003-1017.
[ 3 ] Yang SH, Wu CC, Shih TT, et al. In vitro study on interaction between human nucleus pulposus cells and mesenchymal stem cells through paracrine stimulation[J]. Spine (Phila Pa 1976), 2008, 33(18):1951-1957.
[ 4 ] Cao C, Zou J, Liu X, et al. Bone marrow mesenchymal stem cells slow intervertebral disc degeneration through the NF-κB pathway[J]. Spine J, 2015, 15(3):530-538.
[ 5 ] Wang F, Shi R, Cai F, et al. Stem cell approaches to intervertebral disc regeneration: obstacles from the disc microenvironment[J]. Stem Cells Dev, 2015, 24(21):2479-2495. [ 6 ] Hu JQ, Yan Q, Shi CG, et al. BMSC paracrine activity attenuates interleukin-1 beta-induced inflammation and apoptosis in rat AF cells via inhibiting relative NF-kappa B signaling and the mitochondrial pathway[J]. Am J Transl Res, 2017, 9(1):79-89.
[ 7 ] Morigele M, Shao Z, Zhang Z, et al. TGF-β1 induces a nucleus pulposus-like phenotype in Notch 1 knockdown rabbit bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Cell Biol Int, 2013, 37(8):820-825.
[ 8 ] Cui X, Liu M, Wang J, et al. Electrospun scaffold containing TGF-β1 promotes human mesenchymal stem cell differentiation towards a nucleus pulposus-like phenotype under hypoxia[J]. IET Nanobiotechnol, 2015, 9(2):76-84.
[ 9 ] Liang CZ, Li H, Tao YQ, et al. Dual release of dexamethasone and TGF-β3 from polymeric microspheres for stem cell matrix accumulation in a rat disc degeneration model[J]. Acta Biomater, 2013, 9(12):9423-9433.
[10] Tao Y, Zhou X, Liang C, et al. TGF-β3 and IGF-1 synergy ameliorates nucleus pulposus mesenchymal stem cell differentiation towards the nucleus pulposus cell type through MAPK/ERK signaling[J]. Growth Factors, 2015, 33(5/6):326-336.
[11] Clarke LE, McConnell JC, Sherratt MJ, et al. Growth differentiation factor 6 and transforming growth factor-beta differentially mediate mesenchymal stem cell differentiation, composition, and micromechanical properties of nucleus pulposus constructs[J]. Arthritis Res Ther, 2014, 16(2):R67.
[12] Ehlicke F, Freimark D, Heil B, et al. Intervertebral disc regeneration: influence of growth factors on differentiation of human mesenchymal stem cells (hMSC)[J]. Int J Artif Organs, 2010, 33(4):244-252.
[13] Steinert AF, Proffen B, Kunz M, et al. Hypertrophy is induced during the in vitro chondrogenic differentiation of human mesenchymal stem cells by bone morphogenetic protein-2 and bone morphogenetic protein-4 gene transfer[J]. Arthritis Res Ther, 2009, 11(5):R148.
[14] Naqvi SM, Buckley CT. Bone marrow stem cells in response to intervertebral Disc-Like matrix acidity and Oxygen concentration: implications for cell-based regenerative
therapy[J]. Spine (Phila Pa 1976), 2016, 41(9):743-750.
[15] Li C, Guo Z, Guo B, et al. Inhibition of the endogenous CSE/H2S system contributes to hypoxia and serum deprivation-induced apoptosis in mesenchymal stem cells[J]. Mol Med Rep, 2014, 9(6):2467-2472.
[16] Das R, Jahr H, van Osch GJ, et al. The role of hypoxia in bone marrow-derived mesenchymal stem cells: considerations for regenerative medicine approaches[J]. Tissue Eng Part B Rev, 2010, 16(2):159-168.
[17] Naqvi SM, Buckley CT. Extracellular matrix production by nucleus pulposus and bone marrow stem cells in response to altered Oxygen and glucose microenvironments[J]. J Anat, 2015, 227(6):757-766.
[18] Ni L, Liu X, Sochacki KR, et al. Effects of hypoxia on differentiation from human placenta-derived mesenchymal stem cells to nucleus pulposus-like cells[J]. Spine J, 2014, 14(10):2451-2458.
[19] Cao L, Yang F, Liu G, et al. The promotion of cartilage defect repair using adenovirus mediated Sox9 gene transfer of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Biomaterials, 2011, 32(16):3910-3920.
[20] Lee JM, Im GI. SOX trio-co-transduced adipose stem cells in fibrin gel to enhance cartilage repair and delay the progression of osteoarthritis in the rat[J]. Biomaterials, 2012, 33(7):2016-2024.
[21] Fang Z, Yang Q, Luo W, et al. Differentiation of GFP-Bcl-2-engineered mesenchymal stem cells towards a nucleus pulposus-like phenotype under hypoxia in vitro[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2013, 432(3):444-450.
[22] Chen HT, Huang AB, He YL, et al. Wnt11 overexpression promote adipose-derived stem cells differentiating to the nucleus pulposus-like phenotype[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2017, 21(7):1462-1470.
[23] Lolli A, Narcisi R, Lambertini E, et al. Silencing of antichondrogenic MicroRNA-221 in human mesenchymal stem cells promotes cartilage repair in vivo[J]. Stem Cells, 2016,
34(7):1801-1811.
[24] Vadalà G, Russo F, Di Martino A, et al. Intervertebral disc regeneration: from the degenerative cascade to molecular therapy and tissue engineering[J]. J Tissue Eng Regen Med, 2015, 9(6):679-690.
[25] Ganey T, Hutton WC, Moseley T, et al. Intervertebral disc repair using adipose tissue-derived stem and regenerative cells: experiments in a canine model[J]. Spine (Phila Pa 1976), 2009, 34(21):2297-2304.
[26] Ouyang A, Cerchiari AE, Tang X, et al. Effects of cell type and configuration on anabolic and catabolic activity in 3D co-culture of mesenchymal stem cells and nucleus pulposus cells[J]. J Orthop Res, 2017, 35(1):61-73.
[27] Sun Z, Luo B, Liu ZH, et al. Adipose-derived stromal cells protect intervertebral disc cells in compression: implications for stem cell regenerative disc therapy[J]. Int J Biol Sci, 2015, 11(2):133-143.
[28] Dai J, Wang H, Liu G, et al. Dynamic compression and co-culture with nucleus pulposus cells promotes proliferation and differentiation of adipose-derived mesenchymal stem cells[J]. J Biomech, 2014, 47(5):966-972.
[29] Le HQ, Ghatak S, Yeung CY, et al. Mechanical regulation of transcription controls Polycomb-mediated gene silencing during lineage commitment[J]. Nat Cell Biol, 2016, 18(8):864-875.
[30] Liu Y, Rahaman MN, Bal BS. Modulating notochordal differentiation of human induced pluripotent stem cells using natural nucleus pulposus tissue matrix[J]. PLoS One, 2014, 9(7):e100885.
[31] Liu K, Chen Z, Luo XW, et al. Determination of the potential of induced pluripotent stem cells to differentiate into mouse nucleus pulposus cells in vitro[J]. Genet Mol Res, 2015, 14(4):12394-12405.
[32] Chen X, Zhu L, Wu G, et al. A comparison between nucleus pulposus-derived stem cell transplantation and nucleus pulposus cell transplantation for the treatment of intervertebral disc degeneration in a rabbit model[J]. Int J Surg, 2016, 28:77-82.。