中国林蛙皮肤胶原蛋白的提取及体外抗氧化活性研究

中国林蛙皮肤胶原蛋白的提取及体外抗氧化活性研究
赵媛媛;王战勇;张晶;苏婷婷;李萍
【摘要】以中国林蛙皮肤为实验原料,采用酶解法水解提取其胶原蛋白.考察了提取次数、料液比、提取时间、提取温度以及酶用量等因素对胶原蛋白提取效率的影响,确定中国林蛙皮肤胶原蛋白的提取条件为:胃蛋白酶提取,提取次数2次,料液比
1:60(g/mL),提取时间36h,提取温度37℃,酶用量1:100.还进一步考察了林蛙皮肤胶原蛋白的体外抗氧化能力.结果显示,林蛙皮胶原蛋白具有较强的羟基自由基清除能力,但实验范围内其超氧自由基和DPPH自由基清除能力较弱.%The collagens from skin of Rana chensinensis were extracted using enzymatic extraction method.The effect factors which include extraction frequency,ratio of liquid to raw material,extraction time,extraction temperature,and amount of enzyme were studied,respectively.The extraction conditions were chosen as follows:enzyme is pepsin,extraction frequency is 2,water to raw material ratio is 60,extraction time is 36 h,extraction temperature is 37 ℃ and amount of enzyme is 1:100.In vitro antioxidant activities of the collagen from skin of Rana chensinensis were assayed.The results showed the collagen from skin of Rana chensinensis has strong scavenging ability of hydroxyl free radical,but the scavenging ability of superoxide anion free radical and DPPH free radical is weak.
【期刊名称】《应用化工》
【年(卷),期】2017(046)004
【总页数】4页(P685-688)
【关键词】林蛙;胶原蛋白;提取;抗氧化
【作者】赵媛媛;王战勇;张晶;苏婷婷;李萍
【作者单位】辽宁石油化工大学化学化工与环境学部,辽宁抚顺 113001;辽宁石油化工大学化学化工与环境学部,辽宁抚顺 113001;辽宁石油化工大学化学化工与环境学部,辽宁抚顺 113001;辽宁石油化工大学化学化工与环境学部,辽宁抚顺113001;辽宁石油化工大学化学化工与环境学部,辽宁抚顺 113001
【正文语种】中文
【中图分类】TQ917
中国林蛙(Rana chensinensis)——黄蛤蟆，一直作为食用兼药用的名贵野生动物之一[1]。

被大家熟知的林蛙油则是雌蛙在其怀卵成熟期的输卵管，林蛙油中含有多种氨基酸、维生素、无机元素和复合多肽，不仅可以滋阴强肾、而且还能提高免疫力。

然而，林蛙加工生产林蛙油后，大量的蛙皮作为废弃物被丢弃，造成了环境污染及生物资源的浪费。

事实上林蛙皮中包含着大量的胶原蛋白，拥有巨大的研究意义和开拓潜力[2]。

胶原蛋白属于生物高分子类物质，遍布于动物体内。

人们发现其不仅具备生物相容性，且抗原性较低，可降解，已将其广泛地应用在医学、滋养保健品以及化妆品等范畴[3]。

郑淼等成功地从废弃的林蛙皮中分离出胶原蛋白[4]，吕玲玲等进一步考察了胶原蛋白的体外抗氧化活性[5]。

在本研究中，利用酶解法提取出胶原蛋白，确定其提取的各种条件，更进一步对其体外抗氧化活性研究。

相关研究有助于林蛙皮类废弃资源的利用开发，更为今后开发相应胶原蛋白制品提供了研究基础。

1.1 材料与仪器
林蛙皮，由抚顺东星抚顺市东星林蛙精品研究所提供；1,1-二苯基-2-苦肼基自由
基(DPPH)，对二甲氨基苯甲醛、柠檬酸、柠檬酸钠、氯胺T、乙二醇甲醚、冰醋酸、碳酸氢钠、无水乙醇均为分析纯。

AR124CN电子天平；UV-2600 紫外可见分光光度计；DFZ-6020 真空干燥箱；ALPHA 1-2LD PLUS冻干机。

1.2 样品的预处理
干燥无菌的林蛙皮用清水浸泡，使其变得柔软、舒展，然后浸泡在10%的
Na2CO3溶液中5 h，除去一些脂肪成分，清洗后再重新浸泡一次。

浸泡好的林
蛙皮经反复清洗至pH 6.0后，真空干燥，粉碎，待用。

1.3 胶原蛋白的提取
称取适量预处理蛙皮，溶于0.5 mol/L冰醋酸溶液中，按设定好的提取次数、料液比、提取时间、提取温度以及酶用量进行提取后，提取液以4 000 r/min的速度
离心15 min。

收集液体、透析，冻干后得到胶原蛋白样品。

1.4 胶原蛋白抗氧化能力考察
1.4.1 清除超氧阴离子自由基(O2-)能力的测试取Tris-HCl缓冲液 (pH 8.2) 4.5
mL于试管中，加入4.2 mL去离子水，混匀后于25 ℃恒温水浴中保温20 min，迅速地加入1 mL待测样品和0.4 mL的邻苯三酚(提前和待测的样品一起预热)，
迅速混合均匀后于25 ℃水浴反应5 min。

最后加入1 mL 8 mmol/L HCl终止反应，于325 nm处测定OD值。

以MillQ-H2O调零，Vc作为阳性对照[6]。

清除率的计算公式为：
清除率
其中，A0为以水为空白组的吸光值；Ai为样品组的吸光值。

1.4.2 DPPH自由基清除能力的测定取0.2 mmol/L的DPPH溶液2 mL，待测样品1 mL，去离子水1 mL，混匀后于室温反应30 min，517 nm下测定吸光值Ai，以MillQ-H2O调零，测定A0。

以抗坏血酸为阳性对照[7]。

DPPH自由基清除率
的计算如下：
清除率
其中，A0为以水为空白组的吸光值；Ai为样品组的吸光值。

1.4.3 羟基自由基(·OH)清除能力的测定依次加入9 mmol/L的水杨酸钠-乙醇溶液、9 mmol/L FeSO4溶液、待测样品1 mL、8.8 mmol/L H2O2溶液各1 mL，摇
匀后37 ℃恒温水浴反应30 min。

在510 nm下测定所有样品吸光值。

以MillQ-
H2O调零，阳性对照为Vc[8]，考察样品清除·OH的能力。

清除率计算公式如下：清除率
其中，A0为空白组吸光值，Ai为样品吸光度值。

2.1 提取条件的考察
2.1.1 不同种类的酶对胶原提取率的影响将处理后的蛙皮称取10 g，在提取1次，料液比1∶60 (g/mL)，提取24 h以及提取温度37 ℃的条件下，观察不同类型的酶对提取率的影响，结果见图1。

由图1可知，3种酶对产率产生的结果不同。

其中胃蛋白酶的分离效果最优，胰蛋白酶相对较弱，而3种酶中分离效果最差的则是木瓜蛋白酶。

因此，选用胃蛋白
酶进行后续胶原的提取。

2.1.2 不同的提取次数对产率的影响称取10 g处理好的蛙皮，在料液比1∶60
(g/mL)，提取24 h以及温度37 ℃的条件下，考察提取次数对产率的影响，结果
见图2。

由图2可知，产率随着实验中次数的增加而提高。

但是当提取2次以后提取率增
幅不明显，可以判断提取次数2次已可以提取出大部分的胶原蛋白成分。

继续增
加提取次数，胶原的产率没有明显提升，且造成提取溶剂和能源的浪费，增加提取过程中的成本。

因此，确定提取次数为2次。

2.1.3 不同的料液比对胶原提取率的影响称取10 g处理好的蛙皮，在提取2次，
提取24 h以及提取温度37 ℃的条件，计算提取液中所含的羟脯氨酸，考察不同
料液比(g/mL)1∶20，1∶40，1∶60，1∶80，1∶100对提取率的影响，结果见
图3。

由图3可知，提取液中羟脯氨酸总量随着料液比的加大而表现出先上升后平缓的
趋势。

当料液比为1∶60 (g/mL)时，羟脯氨酸总量达到最高值；当料液比超过
1∶60 (g/mL)时，羟脯氨酸总量无明显增加。

因为，如果料液比太小，不能更好
地促进胶原溶解，致使原料浪费；但如果料液比太高则会加大成本。

综合考虑，料液比选为1∶60 (g/mL)为宜。

2.1.4 不同提取时间对胶原提取率的影响将处理后的蛙皮称取10 g，在提取2次，料液比1∶60 (g/mL)以及温度37 ℃的条件下，考察提取时间的改变对产率的影响，结果见图4。

由图4可知，产率在12～36 h内逐步提高。

提取时间为36 h，胶原的产率达到
最高。

再增加提取时间，提取率反而降低。

本实验提取36 h胶原成分已经可以被提取出来，继续增大提取的时间可能会破坏胶原的结构进而影响它的活性，另外提取的时间越长各种成本越多，不利于扩大生产。

因此，选定提取时间为36 h。

2.1.5 提取温度对胶原提取率的影响将处理后的蛙皮称取10 g，在提取2次，料
液比1∶60 (g/mL)以及提取36 h的条件下，观察温度对产率的影响，结果见图5。

由图5可知，当温度从20 ℃上升到37 ℃时，提取率也随之提高，当温度在37 ℃时产率最大，而当温度高于37 ℃，胶原的产率表现出稍微的降低。

其主要原因在于升高提取温度可能会导致胃蛋白的活性遭到影响以及胶原结构的破坏，进而降低胶原的生物活性。

因此，选定提取温度为37 ℃进行下一步操作。

2.1.6 酶用量的多少对提取率的影响取10 g处理好的蛙皮，在提取2次，料液比1∶60 (g/mL)，时间36 h以及温度37 ℃的条件下，考察酶用量(酶与原料质量比)对产率的影响，结果见图6。

由图6可知，当加大酶的用量，胶原的提取率先增大，随后又趋于平稳。

其原因
在于加大了酶的用量以后，底物接触酶的概率会增加，可使得单位时间内分子数不断增长，使得胶原能够更快地从溶液中溶解出来，有助于提取。

若继续向实验中加酶，酶、底物之间的作用已经到达最大限度，提取率不再明显的升高。

因此，选定酶的用量为1∶100。

2.2 抗氧化活性研究
2.2.1 超氧阴离子自由基(·O2-)的清除能力分析胶原体外清除·O2-能力的研究效果，见图7。

实验测定浓度范围内胶原清除·O2-的能力相对较弱，仅不到20%，且在
浓度超出8 mg/mL以后清除率几乎无大的转变。

胶原蛋白在测定浓度范围内未检查到EC50值，而作为阳性对照的抗坏血酸在浓度为0.26 mg/mL即达到其EC50值。

2.2.2 DPPH自由基清除能力分析胶原清除DPPH能力的研究结果，见图8。

由图8可知，胶原清除DPPH的能力并不明显，在实验范围内未检查到样品的
EC50值。

而Vc在0.46 mg/mL时，清除率超过90%。

2.2.3 羟基自由基(·OH)清除能力分析由图9可知，胶原对·OH体外的清除作用非
常高，浓度很低就可以清除·OH，当其高出4 mg/mL后，清除率增幅越来越小。

实验范围内所测得的胶原的EC50值为0.96 mg/mL，与Vc的EC50比较相差不大。

随着不断增大胶原的质量浓度，其对·OH 清除率已达95%以上。

本研究以中国林蛙皮肤提取对象，通过酶解法水解提取得到林蛙皮肤胶原蛋白，并考察了胶原蛋白的提取条件及其体外抗氧化活性。

确定胶原蛋白的提取条件为：选用胃蛋白酶，提取2次，料液比1∶60 (g/mL)，提取时间36 h，提取温度37 ℃，酶用量1∶100。

体外抗氧化检测还发现，中国林蛙皮肤胶原蛋白具有显著的羟基
自由基清除能力，有进一步开发为天然抗氧化剂的可能，相关研究将有助于林蛙废
弃资源的深度开发，避免环境污染并促进地方经济发展。

【相关文献】
[1] Yin Y G,Han Y Z,Han Y.Pulsed electric field extraction of polysaccharide from Rana temporaria chensinensis David [J].International Journal of
Pharmaceutics,2006,312(1/2):33-36.
[2] Wang Z Y,Zhao Y Y,Su T T.Extraction and antioxidant activity of polysaccharides from Rana chensinensis skin[J].Carbohydrate Polymers,2015,115:25-31.
[3] Li H,Liu B L,Gao L Z,et al.Studies on bullfrog skin collagen [J].Food
Chemistry,2004,84(1):65-69.
[4] 郑淼，周亚丹，赵敏.东北林蛙皮中胶原蛋白含量的测定及提取工艺[J].东北林业大学学报，2008，36(7)：81-83.
[5] 吕玲玲，金香淑，施溯筠.林蛙皮胶原蛋白的提取及抗氧化性[J].食品研究与开发，2013，
34(10)：20-22.
[6] Je J Y,Qian Z J,Byun H G,et al.Purification and characterization of an antioxidant peptide obtained from tuna backbone protein by enzymatic hydrolysis[J].Process Biochemistry,2007,42(5):840-846.
[7] Jeevithan E,Zhang J Y,Wang N P,et al.Physic-chemical,antioxidant and intestinal absorption properties of whale shark type-II collagen based on its solubility with acid and pepsin[J].Process Biochemistry,2015,50(3):463-472.[8] Li Z R,Wang B,Zhang Q H,et
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