实验6_细胞冻存与复苏

合集下载

细胞冻存和复苏的概念

细胞冻存和复苏的概念嘿，朋友们！今天咱来聊聊细胞冻存和复苏这个神奇的事儿。

你说细胞冻存啊，就好像是给细胞们安排了一场冬眠！想象一下，冬天到了，好多小动物都找个暖和地方睡大觉去了，等春天来了再出来活动。

细胞冻存也差不多是这个道理呀！我们把细胞小心翼翼地保存起来，让它们在低温的环境里安静地待着，等到需要的时候再把它们唤醒。

那怎么冻存呢？这可不是随随便便把细胞扔到冰箱里就行的哦！这可是个技术活儿。

得先给细胞准备好合适的“小窝”，也就是冻存液，这就像是给它们盖了一层厚厚的棉被，保护它们不受伤害。

然后呢，慢慢地把温度降下来，让细胞舒舒服服地进入“睡眠”状态。

等过了一段时间，需要这些细胞发挥作用了，那就得让它们复苏啦！这就像是春天来了，小动物们揉揉眼睛，伸伸懒腰，开始新的生活。

复苏也不简单呢，得掌握好温度和时间，不能太着急，也不能太慢了。

要是不小心出了差错，那细胞可能就醒不过来了，或者醒来也没精神啦！细胞冻存和复苏的好处可多啦！比如说，有些珍贵的细胞，我们可以把它们好好保存起来，以后随时都能用。

就像你有个宝贝，放在一个安全的地方，啥时候想用了就拿出来。

再比如说，在医学研究里，我们可以把一些细胞保存起来，以后用来做实验，这样就能不断地探索新的发现啦！你想想，要是没有细胞冻存和复苏技术，那得有多少宝贵的细胞资源被浪费呀！这就好比你有一堆好吃的，要是不放进冰箱里，那不就都坏了嘛！所以说呀，这个技术可太重要啦！咱平时生活中可能不太能直接用到这个技术，但它在很多领域都发挥着巨大的作用呢！像医学、生物学，都离不开它。

它就像是一个幕后英雄，默默地为科学进步做贡献。

总之呢，细胞冻存和复苏是个很神奇又很有用的技术。

它让我们能更好地利用细胞资源，为人类的健康和科学研究提供了有力的支持。

咱可得好好感谢那些研究出这个技术的科学家们，是他们让我们的生活变得更美好呀！大家说是不是呀！。

细胞的冻存和复苏实验原理

细胞的冻存和复苏实验原理细胞的冻存和复苏实验主要是为了在需要时能够保存活性细胞，以便以后使用。

此过程主要涉及到细胞的冷冻、保存和复苏等环节。

细胞的冻存过程主要包括细胞培养、准备细胞冻存液、细胞冷冻和冷冻保存。

首先，培养细胞是实验的第一步。

细胞可以来自动物组织、细胞系、细胞株等，根据不同的细胞类型和需要，选取合适的培养基和条件进行细胞培养。

培养基中一般含有营养物质、生长因子、激素等，提供细胞生长所需的基础条件。

接下来，要准备细胞冻存液。

细胞冻存液是用于维持细胞的生命状态和保护细胞免受冻融损伤的溶液。

常用的细胞冻存液成分包括冻存液基础培养基、血清、DMSO(二甲基亚砜)等。

其中，冻存液基础培养基可以提供细胞生长所需的营养物质和生长因子，血清则包含有细胞生长因子、蛋白质、维生素等，可以提供细胞所需的生长因子；DMSO作为一种保护剂，可以降低细胞因冻融过程中的机械损伤。

然后进行细胞的冷冻。

将细胞培养物中的细胞用生长基础培养液洗涤去除残存的细胞培养液和旧的培养基，然后加入适量的细胞冻存液，混匀后分装于冷冻管中，最后将细胞冷冻管放入低温冰箱或液氮罐中。

低温环境下，细胞的代谢活动明显减慢，可以有效降低细胞死亡率。

细胞的冷冻保存是将细胞保存在低温条件下，通常为-80或更低的温度。

在低温下，细胞的代谢活动几乎停止，能够大大延缓细胞的老化和死亡，从而实现长期保存。

冷冻保存期间，细胞内部的水分被DMSO等冻存液成分替代，以防止细胞因冻结而受到损伤。

细胞的复苏是将被冷冻保存的细胞通过逐渐升温，使其从低温环境中恢复到生理温度并重新开始生长的过程。

复苏过程中需要进行一系列的操作，其中最关键的是将细胞从冷冻状态逐渐恢复到室温。

一般情况下，将冷冻管放入37水浴中，然后缓慢将温度逐渐升高。

此外，为了减小细胞受到冻融损伤，可以将细胞冻存液缓慢滴入含有细胞培养基的离心管中，将细胞悬浮液转移到细胞培养器皿中进行培养。

总之，细胞的冻存和复苏实验的主要原理是通过低温环境延缓细胞的代谢活动，同时使用合适的冻存液来保护细胞免受损伤，从而实现细胞的长期保存和生存能力的恢复。

细胞学堂｜细胞冻存与复苏的技术原理和操作步骤

细胞学堂｜细胞冻存与复苏的技术原理和操作步骤细胞冻存与复苏是一种常用的细胞保存方法，用于长期保存细胞并保持其生理活性。

下面将详细介绍细胞冻存与复苏的技术原理和操作步骤。

技术原理：细胞冻存是通过将细胞在低温下快速冷冻，并加入保护剂以减少冷冻引起的细胞损伤，从而降低细胞的新陈代谢活动，保持细胞的生命特性。

具体原理如下：1.冷冻缓慢升温原理：冷冻过程中细胞内水分形成冰晶，容易损伤细胞结构。

为了降低损伤，冷冻时的降温速率应尽量缓慢。

而复苏时，也需要采取缓慢升温的方法，以避免溶解冰晶时造成的细胞破坏。

2.保护剂的添加：在冷冻过程中，加入一定浓度的保护剂能够防止细胞水分快速冻结而形成冰晶，从而减少冷冻引起的细胞膜和细胞器损伤。

一般常用的保护剂有甘露醇、二甘醇和甘油等。

操作步骤：下面将介绍细胞冻存与复苏的具体操作步骤：1.细胞选择与培养：选择要冻存的细胞，并保证细胞处于健康和活跃状态。

采用无菌操作，将细胞培养在适当的培养基中，并严格控制培养条件。

2.细胞冻存液的配制：将适当的冻存液配制好。

一般的冻存液组成包括培养基、胎牛血清/胎儿犊牛血清、20%-50%的甘油或其他保护剂。

保护剂的浓度取决于细胞的类型和耐受性。

3.细胞冻存：将培养好的细胞用冻存液冷冻保存。

首先，用培养基洗涤细胞，去除残留的培养基。

然后，添加冻存液，将细胞悬浮均匀。

最后，将细胞悬液装入标记好的冻存管中，并缓慢冷冻至-80℃或液氮中。

4.细胞复苏：将冷冻的细胞迅速取出，用温暖的手掌加热，迅速溶化冰晶。

将细胞悬液转移到离心管中，并加入预先配制好的培养基。

然后，用离心机离心，除去冻存液或保护剂。

最后，加入适当的培养基，将细胞继续培养。

5.细胞复苏后培养条件的控制：在细胞复苏后的培养过程中，需要严格控制培养条件，包括温度、CO2浓度、培养基成分和营养物质的供给等，以确保细胞能够正常生长和繁殖。

总结：细胞冻存与复苏是一种常用的细胞保存技术，可以长期保存细胞并保持其生理活性。

细胞复苏与冻存

细胞冻存与复苏原则：慢冻快融在超低温的液氮中进行冻存（-196度）。

在冻存过程中，随着温度的改变，细胞内部结构讲发生一系列的变化。

细胞快速冻存时，将会受到很大的损伤，甚至导致细胞的死亡。

温度急速下降时细胞脱水少，还会使细胞内结冰。

细胞内冰晶的形成会造成蛋白质和酶的变性，以及细胞器的损伤，并最终导致细胞的死亡。

因此，冰冻细胞时，应使温度缓慢下降，从而使细胞内水分渐渐脱出，使细胞内不结冰。

由于冰冻细胞体中的冰晶体很小，融化时必须快，以防这些微小晶体转化为较大的冰晶体。

因此，细胞的冻存和融化过程要在缓冰速融”下进行。

一般冷冻时，在-30度之前药缓慢降温，速度控制在每分钟下降1度，—30度以下可快速冷冻，使温度降至—196度。

冰冻时还要加入5〜10 %的甘油或二甲基亚砜作为冷冻保护剂。

因为二者分子量小，容易穿透细胞降低细胞内的冰点，并提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冻存，可使细胞内的水分渗出在细胞外形成冰晶，从而避免细胞损伤。

在细胞复苏过程中，必须快速溶解,否则容易造成细胞外溶解的水分进入细胞内重新形成冰晶，造成细胞死亡。

一、细胞复苏如果冻存前细胞状态好，而且冻存时间长，复苏用的培养液没问题的话，复苏细胞出现问题最可能的原因是解冻时间过长和解冻后没有及时稀释接种KEY：1．冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死亡。

2．细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常（例如产生单株抗体或是其它蛋白质）。

Protocal（以贴壁细胞系tsA201 为例）1. •准备材料：37C〜40 C水浴，37 C预热培养液，离心管、血球计数盘与盖玻片2. 细胞实验室进行常规消毒，紫外照射30 min 以上，超净台开启通风10 min。

培养液孵温至于37 °C3. 培养液回温后喷以70 % 酒精并擦拭，移入无菌操作台内。

将7-10 ml 左右新鲜培养基移入离心管中，备用。

细胞的冻存与复苏

细胞的冻存与复苏为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。

冻存的温度一般用液氮的温度为－196℃，将细胞收集至冻存管中加入含保护剂（一般为二甲亚砜或甘油）的培养基，以一定的冷却速度冷冻后，最终保存于液氮中。

在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。

冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。

复苏一般采用快速融化方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放入37℃水中，使之在一分钟内迅速融解，然后将细胞转入培养器皿中进行培养。

一、细胞的冻存（一）仪器、用品与试剂细胞培养箱、液氮罐、普通冰箱、－80℃超低温冰箱、离心机、冻存管、离心管、冻存盒、倒置显微镜、吸管、废液缸、添加有0.02%EDTA 的0.25%胰蛋白酶消化液、细胞冻存液（10ml体系：含7ml培养基、2ml FBS、1ml 甘油或DMSO）、细胞培养基（如添加有10％FBS的RPMI1640）等。

（二）方法1、取旺盛生长的、已基本上快要长满细胞的培养瓶，小心吸干瓶内培养液。

给每个培养瓶中加入1-2ml胰蛋白酶消化液，37℃消化细胞。

2、待大部分细胞从瓶壁脱落下来后，加入3-5ml细胞培养基终止消化。

3、1000rpm 离心5分钟，收集细胞沉淀。

4、加入适量细胞冻存液，调整细胞密度在1-10×106个/ml。

5、将上述细胞悬液小心分装入冻存管中，拧紧冻存管盖子，标注清楚细胞名称、冻存日期等内容。

6、置4℃普通冰箱中预冷30min或者1h。

7、将冻存管放入冻存盒中，立即转移入－80℃超低温冰箱过夜。

8、将冻存管转移入液氮罐中，在记录本上记录清楚细胞冻存管的位置、名称等信息。

（三）注意事项1、冻存细胞的生长状态要好，建议在冻存前24小时内对培养基进行换液，冻存前培养瓶中细胞的密度不宜过高。

2、冻存液的配方可根据细胞种类之不同进行适当调整，血清的浓度可以更高一些，甘油和DMSO的浓度也可在5-20%之间调整。

细胞复苏与冻存

慢冻快溶
细胞复苏的操作步骤：
1：从液氮保存罐中取出冻存管，立即放入37度水浴中，一般用烧杯倒入蒸馏水，然后放入水浴锅中预热，防止水浴锅中水污染细胞，将冻存管竖起，快速摇晃，直至冻存液完全融化。

2：将细胞悬液移入离心管，缓慢加入4ml 培养液，离心1000转每分钟，离五分钟。

3：将离心后的上清液吸出，加入PBS 清洗一下细胞，减少DMSO 对细胞的毒性作用，缓慢捶打均匀，然后离心。

4：将上清吸出，用培养液混匀沉淀的细胞，调整细胞密度，将细胞悬液吸入培养瓶中，再加入新的培养液培养，等细胞贴壁后即换液，以去掉死细胞。

细胞冻存的步骤：
1：将细胞从培养瓶上消化下来，然后加入培养液，混匀后计数，要按照每管冻存管中含有2×10 6个细胞。

2：然后将细胞悬液吸入5ml 离心管中，离心
3：将上面液体吸走，然后按计算结果加入DMEM 缓慢混匀。

4：冻存液的配制，1ml ；600ul10％DMEM 细胞悬液+300ul 血清+100ulDMSO ，
5：然后将混好的液体吸入2ml 冻存管中，冻存，先放入4度冰箱中，然后再放入-20度，最后放入液氮中保存。

干细胞冻存及复苏步骤

干细胞冻存及复苏步骤
一、干细胞冻存及复苏步骤
1.提取干细胞
(1)首先，从捐赠者身体组织中提取干细胞，比如从头发根部提取毛发内的细胞，或从脐带血中提取干细胞。

(2)使用双曲线增殖诱导方法，通过对提取的干细胞进行双曲线增殖诱导，使其变成能够细胞分裂的干细胞。

2.干细胞细胞系建立
细胞分裂时，可以分离出更多干细胞，将这些干细胞细胞分离出来，再放入相应的培养基中，建立起细胞系。

3.干细胞冻存
(1)在细胞分离时，应当尽快进行冻存，以防止细胞活性下降。

(2)将细胞放入冰淇淋箱，将其温度降至-80℃，然后将其冻存，一般可以保存2-3年。

(3)将细胞放入低温液氮坩埚中冻存，可以保存更久，约10年。

4.干细胞复苏
(1)将细胞从低温冰箱中取出，将其温度升至4℃，然后将其放入相应的培养基中，缓慢地升温，使其复苏。

(2)缓慢地加入相应的培养液，适当的调节成分，使其复苏，并且保持活性。

(3)观察复苏的细胞，观察其繁殖情况，确保细胞复苏的质量。

5.细胞发展
(1)可以使用双曲线增殖诱导方法，结合培养基中的生长因子，诱导细胞进行分化，用于后续的发展。

细胞冻存与复苏步骤原理及注意事项

细胞冻存与复苏步骤原理及注意事项细胞冻存是指将活体细胞暂时停止其代谢活动，并在低温下保存，以便今后可以复苏和继续进行研究。

这项技术对于维持细胞的长期保存和保护遗传材料非常重要。

步骤：1.细胞培养和准备：选择合适的细胞培养基和培养条件，使细胞处于最佳状态。

2.冻存液制备：制备一种含有细胞生长因子、保护剂（例如DMSO或甘油）以及缓冲剂（例如BSA或EDTA）的冻存液。

3.细胞收集和离心：将培养好的细胞通过离心来收集细胞沉淀。

4.细胞冻存和保存：将收集到的细胞与冻存液混合，将混合液分装到冷冻管中，并在极低温下保存（通常为-80°C或液氮温度）。

复苏：1.细胞溶解和补充：将冷藏的细胞迅速解冻，并将其加入到预先准备好的培养基中。

2.培养和观察：将复苏后的细胞转移到培养皿中，并在适当的条件下培养。

观察细胞的生长和形态变化。

原理：细胞冻存的原理是通过降低细胞内温度来减缓或暂时停止细胞代谢活动。

冷冻液中的保护剂可减少细胞冷冻过程中的冻伤，防止细胞膜的破裂和细胞器的破坏。

细胞冷冻过程中，细胞内的水会形成冰晶，但保护剂的存在可以防止冰晶对细胞结构的破坏。

当细胞需要复苏时，通过迅速解冻并将细胞转移到适当的培养基中，细胞可以恢复其生理功能并继续生长和分裂。

注意事项：1.使用无菌的实验室条件和器具来避免细胞冻存和复苏过程中的污染。

2.选择适当的冻存液和培养基，以确保细胞的最佳保护和生长条件。

3.控制冷冻和解冻速率，过快或过慢的速率都可能对细胞造成伤害。

通常使用准备好的细胞冷冻容器或慢速冷却设备来控制速率。

4.正确选择适合冷冻保存的细胞类型。

不同细胞可能对冷冻敏感性有所差异。

5.注明冷冻细胞的信息，例如细胞类型、冷冻日期、冻存液配方等，以便于后续的管理和查询。

细胞复苏、传代、冻存过程

细胞复苏、传代、冻存过程引言细胞复苏、传代和冻存是细胞实验中常见的操作流程。

细胞复苏指的是从冻存状态下恢复细胞的生长和功能，传代是将细胞进行繁殖，冻存则是将细胞保存在极低温下，以便长期保存和后续使用。

下面将详细讨论这些过程。

细胞复苏 Process of Cell Revival材料和设备•冻存管：包含冻存细胞的管子•暖水槽：设置在37°C的恒温水槽内•柱塞：用于搅动和混合细胞悬液•无菌培养皿•无菌培养基步骤1.将冻存管取出放在暖水槽中，快速融化冰冻细胞。

2.将融化的细胞悬液转移到无菌培养皿中。

3.加入预热的培养基，使细胞悬液与培养基充分混合。

4.将细胞培养皿放入培养箱中，维持37°C的恒温和5% CO2的含氧条件。

5.定期观察细胞的生长情况。

细胞传代 Process of Cell Passage材料和设备•细胞培养皿：含有生长的细胞•无菌培养基•显微镜•无菌移液器•15ml离心管•离心机步骤1.将培养皿放在显微镜下，观察细胞的生长情况和密度。

2.用无菌移液器将培养基吹洗细胞，移除老化细胞和细胞碎片。

3.将细胞用预热的无菌培养基均匀混合。

4.用无菌移液器将细胞和培养基移入新的细胞培养皿中。

5.定期检查和记录细胞的生长情况和数量。

冻存细胞 Process of Cell Cryopreservation材料和设备•细胞培养皿：含有生长的细胞•冻存液：包含细胞冻存所需的成分•冻存管•冷冻容器：用于储存冻存管的液体氮罐•标签：用于标记冻存管步骤1.将培养皿放在显微镜下，观察细胞的生长情况和密度。

2.用无菌移液器吹洗细胞，并移除老化细胞和细胞碎片。

3.用预热的无菌培养基将细胞均匀混合。

4.将混合的细胞和冻存液按照特定比例混合。

5.将混合液转移至冻存管中，并封闭管盖。

6.标记冻存管上的信息，包括细胞类型、传代数和日期。

7.将冻存管放入冷冻容器中，迅速冷冻至-80°C或更低温度。

细胞冻存和细胞复苏的方法步骤

细胞冻存和细胞复苏的方法步骤细胞冻存是将细胞保存在极低的温度下，以延缓其新陈代谢过程，从而达到长期保藏的目的。

细胞复苏则是将冻存的细胞重新恢复到正常生活状态的过程。

下面将详细介绍细胞冻存和细胞复苏的方法步骤。

细胞冻存的方法步骤：1.细胞培养：首先，需要获得足够数量和质量的细胞进行冻存。

通过细胞培养技术，将细胞培养在含有适当营养物质的培养基中，使其生长繁殖。

2.细胞分离和检测：将细胞从培养基中分离出来，并进行质量检测，确保细胞的纯度和活力。

3.冻存液的制备：制备适当的冻存液，通常是含有细胞保护剂的冻存液，可以起到保护细胞免受低温伤害的作用。

4.冻存管的准备：准备干净的冻存管，并确保管内没有污染物。

5.细胞冻存：将细胞悬浮液和冻存液混合，将混合液加入冻存管中。

随后，将管子放入冷冻器中，逐渐降低温度，使其达到细胞存活所需的最低温度，通常为液氮温度（-196℃）。

6.冻存管理：冻存后的细胞需要进行管理，包括记录存储位置、维护存档和监测保存条件等。

细胞复苏的方法步骤：1.细胞解冻：将冻存管从液氮中取出，迅速放入37℃的温水中，并轻轻摇晃，以加快冻存液的溶解。

待细胞解冻完成后，立即将细胞转移到含有培养基的离心管中。

2.细胞复苏培养：将细胞悬浮液转移到培养基中，然后放入培养箱中进行培养。

培养基的组成与之前的培养条件相似，以帮助细胞适应新的环境。

3.细胞复苏检测：在细胞复苏后的一段时间内，需要对细胞进行监测和检测，包括细胞存活率、生长状况、形态特征等。

4.细胞复苏管理：对细胞进行管理和维护，包括定期更换培养基、检测细胞的多项指标、记录细胞的生长状态等，以确保细胞的健康状态和长期保存。

细胞冻存和细胞复苏的方法步骤需要严格控制和执行，以保证细胞的活性和质量。

冻存和复苏过程中的温度、冻存液的配方、时间等因素都会对细胞的生存和恢复产生影响，因此，在实施这些方法时需要权衡各种参数，并根据具体情况进行调整和优化。

同时，冻存和复苏过程中的操作要保持无菌、无污染，以保证细胞的无菌状态和纯度。

细胞冻存(Cell Freezing)和复苏技术原理和操作步骤

细胞冻存（Cell Freezing）和复苏技术原理和操作步骤一、原理在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。

如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。

在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。

贮存在－130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。

细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的－5～0℃，细胞仍能生长，活力受损不大。

目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。

二、操作步骤（一）冻存1、消化细胞，将细胞悬液收集至离心管中。

2、1000rpm离心10分钟，弃上清液。

3、沉淀加含保护液的培养，计数，调整至5×106/ml左右。

4、将悬液分至冻存管中，每管1 ml。

5、将冻存管口封严。

如用安瓿瓶则火焰封口，封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。

6、贴上标签，写明细胞种类，冻存日期。

冻存管外拴一金属重物和一细绳。

7、按下列顺序降温：室温→4℃（20分钟）→冰箱冷冻室（30分钟）→低温冰箱（－30℃ 1小时）→气态氮（30分钟）→液氮。

注意：操作时应小心，以免液氮冻伤。

液氮定期检查，随时补充，绝对不能挥发干净，一般30立升的液氮能用1～1.5月。

（二）复苏1、准备一个茶缸或1000ml的烧坏，内装2/3杯37℃的温水。

2、从液氮中取出冻存管、迅速置于温水中并不断搅动。

使冻存管中的冻存物在1分钟之内融化。

3、打开冻存管，将细胞悬液吸到离心管中。

4、1000rpm离心10分钟，弃去上清液。

5、沉淀加10ml培养液，吹打均匀，再离心10分钟，弃上清液。

（细胞数量少的情况下，复苏时可省略步骤5。

）6、加适当培养基后将细胞转移至培养瓶中，37℃培养，第二天观察生长情况。

三、试剂和器材器材：液氮罐、冻存管（塑料螺口专用冻存管或安瓿瓶）、离心管、吸管、离心机等。

细胞冻存与复苏步骤

细胞冻存与复苏步骤一、细胞冻存步骤1.细胞准备：选择需要保存的细胞，如细菌、真核细胞或植物细胞等。

确保细胞在保存前是健康和活跃的。

2.细胞培养：将细胞培养在适当的培养基中，提供足够的营养物质供细胞生长和增殖。

3.预冷处理：在冰箱中对细胞进行预冷处理，以适应环境的改变，减少冷冻过程中对细胞的伤害。

4.冷冻介质配制：配制适合冷冻细胞的冷冻介质。

常见的冷冻介质包括甘油、DMSO（二甲基亚砜）等。

5.细胞冷冻：将培养好的细胞与冷冻介质混合均匀，并分装到冷冻管或冻存袋中，然后将其放入液氮罐中进行冷冻。

6.冷冻保存：将冷冻好的细胞保存在液氮罐中，温度通常保持在-196℃以下。

二、细胞复苏步骤1.预备工作：首先需要准备好细胞复苏所需的培养基和试剂。

培养基通常包括适当浓度的多糖、氨基酸和生长因子等。

2.细胞解冻：将冷冻的细胞从液氮罐中取出，迅速放入37℃的水浴中解冻，避免长时间暴露在室温。

3.细胞离心：解冻后将细胞离心，以去除残留的冷冻介质和杂质。

4.细胞重悬：将离心得到的细胞重悬于预先准备的培养基中。

5.细胞培养：将细胞转移至培养皿中，放入恒温培养箱中，通常为37℃，5%CO2的条件下继续培养。

6.细胞观察：观察培养皿中细胞的生长情况，通过显微镜观察细胞形态和数量的变化。

1.选择适当的冷冻介质：不同细胞类型对冷冻介质的耐受性不同，需要选择能够保护细胞完整性和生物活性的冷冻介质。

2.控制冷冻速率：过快或过慢的冷冻速率都可能导致细胞冻存失败。

通常使用控制冷冻速率的设备，如液氮罐或冷冻机。

3.防止细胞冻伤：冻存过程中细胞易受到冻伤的伤害，应尽量减少或避免冻伤的发生。

例如，在细胞冷冻前使用细胞保护剂可以提高细胞的存活率。

4.保存条件控制：细胞冷冻保存时，需要精确控制温度，确保保存温度稳定，以防止细胞失活或变异。

液氮罐中的细胞保存时间通常可以达到数年以上。

细胞冻存与复苏技术的发展为细胞研究和应用提供了更多的可能性，同时也为人类疾病的治疗和预防带来了希望。

细胞冻存、复苏及传代

细胞冻存步骤
1、将细胞冻存液（10%DMSO+90%FBS)配好并放置冰箱预冷；
2、当10 cm培养皿中的RBMSC细胞汇合到80%-90%时，用胰蛋白酶将细胞消化下来，1200 rpm离心，去上清；
3、加入PBS重悬细胞，以洗去残留的胰蛋白酶，1200 rpm离心，去上清；
4、加入1ml细胞冻存液重悬后，将细胞重悬液放入冻存管中，并快速将冻存管放入冻存盒中(冻存盒需先复温),再将冻存盒放入-80℃冰箱中过夜，再转移至液氮中保存。

细胞复苏步骤
1、先将培养基配好并复温，在15ml离心管中加入3ml培养基
2、将从液氮罐取出的冻存细胞置于37℃水浴锅中1-2min溶解后，立即将细胞悬液转移至
15ml离心管中，1200 rpm离心3 min，弃上清；
3、加入6ml培养基重悬细胞，并将细胞悬液转移至6cm培养皿中培养，贴壁12h后换液。

4、复苏的细胞应传代2-3代后方可用于实验。

细胞传代步骤
1、当培养皿或培养瓶内的细胞增殖为80-90%时，可进行传代。

2、弃上清，PBS洗2-3次，6cm（10cm）培养皿中加入600μl（800 μl）胰蛋白酶消化1-2min
后，在显微镜下观察细胞是否变成圆形，当细胞变成圆形后，应立即加入培养基终止消化，以免细胞消化过度。

3、1200 rpm离心3min，弃上清，加入1ml培养基重悬，将细胞重悬液转移至含有培养基
的6cm培养皿中进行培养。

细胞冻存与复苏

细胞冻存与复苏细胞冻存与复苏细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。

细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。

细胞的冻存【用品】（1） 5%胰蛋白酶（2）含10%~20%血清培养液（3） DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油（15磅蒸汽高压消毒）（4）吸管、离心管、冻存管【步骤】（1）从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞，已经长满的细胞冻存后生存率低。

在冻存前一天最好换一次培养液。

（2）用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则不需处理。

依据传代方法把消化好的细胞收集于离心管并计数，离心。

（3）去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入配制好的冻存培养液（含10%DMSO或甘油），冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml~1×107/ml。

用吸管轻轻吹打使细胞均匀，然后分装入无菌冻存管中。

（4）装完细胞后的冻存管即可直接冻存。

以本教研室对L929的冻存程序作为大家进行细胞冻存的参考：将冻存管放入4℃冰箱 2hr；-20℃冰箱2hr；液氮表面过夜。

以后取出冻存管移入液氮容器内。

在放入液氮时，要带手套操作以免冻伤。

细胞在液氮中储存时间理论上是无限的，但为妥善起见，特别是很多为被冻存过的细胞在首次冻存后要在短期内复苏一次观察细胞对冻存的适应性。

已建系的细胞最好也每年取一支复苏一次后，再继续冻存。

细胞的复苏【用品】培养液，吸管，离心管，培养瓶，37℃温水【步骤】（1）从保存冻存管的支架中取出冻存管应直接投入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。

如果冻存管密封不严，在保存过程中液氮进入冻存管中，从液氮罐中取出时由于温度升高导致液氮急速气化而爆炸，可能会危及面部等。

因此，存取冻存管时都要佩戴眼镜和手套。

（2）从37℃水浴中取出冻存管，用酒精消毒后，拧开冻存管，用吸管吸出细胞悬液，注入离心管并滴加10倍以上培养液，混合后低速离心，除去上清液，在重复用培养液洗一次。

细胞冻存和复苏的原则

细胞冻存和复苏的原则
1.保护细胞膜：细胞膜是细胞内部和外部环境之间的重要屏障，保护
细胞膜是冻存和复苏的关键。

冻存前，必须将细胞放入适当的保护剂中，
例如甘油、DMSO等，保护细胞膜免受冷冻过程中的损伤。

在复苏过程中，使用适当的解冻缓冲液缓慢地回温，避免细胞膜急剧收缩或破裂。

2. 控制冷冻速度：细胞冷冻的速度必须缓慢，以避免冻结引起的细
胞破坏。

最佳的冷冻速度取决于细胞类型和冷冻条件，通常应在-
1°C/min以下。

可以使用特殊的冷冻器进行控制，或通过降低温度梯度
来减缓细胞的冷冻速度。

3.恢复培养环境：在冻存的细胞复苏过程中，必须立即将细胞恢复到
培养环境中。

这包括向培养基中添加适当的营养物，例如葡萄糖、氨基酸、维生素等，在适宜的温度、氧气和二氧化碳条件下培养。

4.检测细胞的活力和质量：冷冻和复苏过程都会对细胞产生损伤，因
此必须定期检测细胞的活力和质量。

这可以通过测量细胞增殖率、形态、
细胞周期及细胞凋亡等生化和形态指标来评估。

总之，一个成功的细胞冻存和复苏过程需要考虑多个因素，包括保护
细胞膜、控制冷冻速度、恢复培养环境和检测细胞活力和质量。

只有通过
精心设计和执行这些步骤，才能最大限度地减小细胞冻存和复苏过程中的
损伤和质量损失。

生化实验细胞冻存和复苏

• 大结晶会造成细胞膜、细胞器损伤和破裂。 • 复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰
晶，即冰晶的重结晶。
第一节细胞冻存
低温保护剂的应用
• 在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提高冻存效果。
• 常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高细胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在细胞外形成冰晶，细胞内冰晶减少，从而减少对细胞的损伤。
细胞冻存方法
• 1.预先配制冻存液：含20%血清培养基
•
10% DMSO
• 2 .取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液, 用吸管吹打制成细胞悬液（1×106 ～ 5 ×106细胞/ml)
• 3 .加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。
• 4. 1年后，存活率可达80％一90％。DMSO液用
培养液配好，避免因临时配制产热而伤害细胞。对人造血干细胞的研究证
慢冻程序
• 标准程序：
• 当温度在-25 ℃以上时， 1～2 ℃/min • 当温度达-25 ℃以下时， 5～10 ℃/min • 当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中 •
• 简易程序：
•
将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋
内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，
• 按每分钟温度下降1～2 ℃的速度，在40分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投
人液氮中。
• 冻存过程： • 1. 4℃冰箱4小时液氮容器的气相液氮1小时
液相液氮（-196℃）中冻存， • 2. 细胞冻存盒放置于-80℃冰箱或干冰中，经过2-3
小时液氮液相内。（实验室常用） • 1年后，存洁率可达80％。 • DMSO液用培养液配好，避免因临时配制产热而伤

细胞冻存及复苏步骤

细胞的复苏步骤1.实验前准备（1）将水浴锅预热至37℃。

（2）用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。

（3）在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。

2.取出冻存管（1）根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。

（2）从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。

3.（1）迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。

（2）约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。

4.离心：放入离心机中1000r/min离心4min。

（一般800即可，对于较小细胞可适当增加转速，一般不超过1000r）5.制备细胞悬液（1）吸弃上清液。

（2）向离心管内加入12ml培养液，吹打制成细胞悬液。

6.细胞计数细胞浓度以5×105/ml为宜。

（依照细胞类型而定）7. 培养贴壁细胞的冻存的步骤准备：从冰箱取出各药品在室温下放置，紫外照射超净台30min，配置5%DMSO的冻存液1.收集各管中培养液与一个大的离心管中，吸取1ml培养液加入已标记的EP管中用于支原体的检测，其余用于终止酶解反应。

2.加入5mlPBS洗卡氏瓶除去血清，防止酶解反应受影响。

注意：要在卡氏瓶的反面加液，防止把细胞冲掉。

加入2ml胰酶，使细胞从瓶壁上脱落下来。

3.酶解完全后迅速加入含血清的培养基终止酶解反应。

4.收集各瓶中的细胞悬液，并计算其体积，取出一部分于EP管中用于计数，计算冻存支数。

5.离心800r每分钟，4min。

在超净台中取出冻存管并做好标记（名称株号冻存人日期）6.去除上清，并用适量（依冻存支数而定，每支1ml）的冻存液使其悬浮，加入冻存管中，每管1ml7.放入冻存盒（标注放入日期有使用次数限制），在-80冰箱中过夜后放入液氮罐并作好记录。