定量聚合酶链反应pcr测定技术山东临床检验中心
15-刘义庆-PCR试剂盒选用和质检_15
临床PCR试剂、耗材的选用和质检刘义庆山东省立医院临床医学检验部Kary Mullis PCR 技术最早由美国Cetus公司人类遗传研究室Kary Mullis 及同事于1985年发现并研制成功。
Kary Mullis 因发明了“聚合酶链式反应”而获得1993年度诺贝尔化学奖。
原理PCR是在模板DNA、引物和四种脱氧核苷酸等存在的情况下，DNA聚合酶依赖的酶促合成反应，整个扩增过程分变性、退火、延伸三步。
经过若干循环后使目的DNA得以迅速扩增。
PCR技术自1989年开始被应用于临床检验以来，以其快速、简便、灵敏等优点很快地成为临床实验诊断学的一个技术热点。
目前，临床PCR检验已经广泛使用商品化、规范化的试剂盒。
●PCR试剂盒的质量对测定结果的影响是直接而且是至关重要的●试剂盒的质量不但受到生产过程中质量控制诸要素的影响，原材料的质量、方法学设计、包装、运输和贮存等一系列的环节，都对试剂盒的质量有决定性的影响●如何选择质量好的且符合自己实验室要的试剂盒？●如何保证拿到手里的试剂盒具有好的质量?PCR或RT-PCR试剂盒的组成●核酸提取试剂●核酸扩增或逆转录－核酸扩增试剂●产物检测试剂（有些使用全自动分析仪的PCR 方法因其核酸扩增和检测同时完成，故无专门的产物检测试剂）影响PCR试剂盒质量的因素内在因素: 原材料、核酸提取方法、方法学设计外在因素：试剂盒的运输和贮存外在因素：试剂盒的运输和贮存影响PCR试剂盒质量的因素：核酸扩增所需的原材料●寡核苷酸引物●扩增缓冲液●dNTP●Taq酶以及反转录酶等寡核苷酸引物和探针●引物和探针纯度对试剂盒的质量的影响：纯度的高低可根据260/280吸光度比值来判断，如小于2.0，则需重新纯化。
另一种方法是将其在聚丙烯酰胺凝胶上电泳，如出现一条以上的带或迁移位置错误，则需重新纯化。
●引物和探针的结合特异性：应减少假阳性或假阴性的出现扩增缓冲液和dNTP●缓冲液包括：Tris-HCL(pH8.3~8.8)，KCl或NaCl ，酶保护剂如小牛血清蛋白、明胶、Tween20或DTT●Mg2+ ，过高或过低镁离子浓度均不利于扩增●四种dNTP的终浓度应相等Taq酶以及反转录酶●酶的浓度：酶浓度太高，则会出现非特异扩增；过低时，则靶序列产量很低。
2020年智慧树知道网课《临床分子生物学检验技术(哈尔滨医科大学)》课后章节测试满分答案1
绪论单元测试1【判断题】(20分)临床分子生物学检验技术学科建立在分子生物学学科之前。
A.对B.错2【判断题】(20分)临床分子生物学检验技术是从分子水平研究解决临床诊断与治疗问题。
A.对B.错3【多选题】(20分)现代临床医学的发展方向：（）A.预测医学B.预防医学C.个体化医学D.中西医结合4【多选题】(20分)下列技术为临床分子生物学检验常用检测技术的是（）A.基因测序B.SouthernblotC.分子杂交D.其余均不对5【判断题】(20分)临床分子生物学检验技术学科发展第一阶段的代表性技术为分子杂交技术。
A.错B.对第一章测试1【单选题】(20分)在人类基因组DNA序列中，DNA甲基化主要发生在（）A.鸟嘌呤的N-7位B.鸟嘌呤的C-5位C.胞嘧啶的C-5位D.胞嘧啶的N-4位E.腺嘌呤的N-6位2【单选题】(20分)下列DNA序列中的胞嘧啶（）易发生甲基化修饰的是。
A.5'-CGCGCG-3'B.5'-GGGGCC-3'C.5'-CCCCCT-3'D.5'-GCACAC-3'E.5'-CTCTCCC-3'3【单选题】(20分)某基因位点正常时表达为精氨酸，突变后为组氨酸，这种突变方式为（）A.移码突变B.动态突变C.无义突变D.同义突变E.错义突变4【单选题】(20分)由于突变使编码密码子形成终止密码，此突变为（）A.无义突变B.移码突变C.终止密码突变D.同义突变E.错义突变5【单选题】(20分)下列叙述哪项是的（）A.原核生物基因组具有操纵子结构B.原核生物结构基因是断裂基因C.原核生物结构基因的转录产物为多顺反子型mRNAD.原核生物基因组中含有插入序列E.原核生物基因组中含有重复顺序第二章测试1【单选题】(20分)DNA链的Tm值主要取决于核酸分子的（）A.T－G含量B.A－G含量C.A－C含量D.A－T含量E.G－C含量2【单选题】(20分)Southern杂交通常是指（）A.DNA和RNA杂交B.DNA和蛋白质杂交C.蛋白质和蛋白质杂交D.RNA和RNA杂交E.DNA和DNA杂交3【单选题】(20分)下列哪些不是影响DNA复性的因素（）A.碱基组成B.DNA浓度C.温度D.DNA的分子量E.DNA的来源4【单选题】(20分)探针基因芯片技术的本质就是（）A.基因重组技术B.蛋白质分子杂交技术C.酶切技术D.聚合酶链反应技术E.核酸分子杂交技术5【单选题】(20分)DNA探针的长度通常为（）A.1000～2000个碱基B.400～500个碱基C.<100个碱基D.500～1000个碱基E.100～400个碱基第三章测试1【单选题】(20分)以mRNA为模板合成cDNA的酶是()A.DNA酶B.逆转录酶C.RNA酶D.限制性内切酶E.TaqDNA聚合酶2【单选题】(20分)有关PCR的描述下列不正确的是（）A.引物决定了扩增的特异性B.由变性、退火、延伸组成一个循环C.循环次数越多产物量就越大，可增加循环次数提高产物量D.是一种酶促反应E.扩增的对象是DNA序列3【单选题】(20分)下列关于TaqDNA聚合酶的描述，的是（）A.扩增的DNA片段越长，碱基错配率越低B.催化形成3´,5´-磷酸二酯键C.不具有3´5´外切酶活性D.使DNA链沿5´→3´方向延伸E.以dNTPs为原料4【单选题】(20分)PCR反应过程中，退火温度通常比引物的Tm值（）A.低15℃B.高5℃C.低5℃D.相等E.高15℃5【单选题】(20分)PCR反应中延伸的时间取决于（）A.待扩增片段的长度B.模板的含量C.模板的纯度D.TaqDNA聚合酶的量E.引物长度第四章测试1【单选题】(20分)关于TaqMan探针技术的描述，不正确的是（）A.解决了荧光染料技术非特异的缺点B.R基团与Q基团相距较远，淬灭不彻底，本底较高C.易受到TaqDNA聚合酶5′-3′核酸外切酶活性的影响D.无需进行寡核苷酸熔解曲线分析，减少了实验时间E.操作亦比较简单2【单选题】(20分)以下为比较Ct法的相对定量的描述，不正确的是（）。
浅谈聚合酶链反应在医学检验中的应用
浅谈聚合酶链反应在医学检验中的应用摘要：聚合酶链式反应(pcr)作为一种体外核酸扩增技术，具有高度的特异性和灵敏度,目前已广泛应用于医学检验中。
pcr技术的应用,不但保证了检验结果的准确性和可靠性,而且节省了大量的人力物力,在临床上具有巨大的推广应用价值。
本文就目前pcr技术在临床检验中的应用进行简要论述。
关键词：聚合酶链式反应医学检验应用前景1 聚合酶链反应概述聚合酶链反应（polymerase chain reaction，pcr）是一项模拟dna体内复制过程的体外dna扩增技术,自该技术诞生以来，它在分子生物学及医学的各个领域广泛应用。
它主要是由变性、复性、延伸三个基本步骤组成的循环反应。
变性即利用加热的方法使双链dna解链成两股单链；复性就是降低反应温度使这两股单链按碱基互补的原则分别与引物结合成双链；最后是延伸，在dna聚合酶的作用下，按照碱基互补配对的原则合成互补链；三个步骤完成为一个循环，每完成一个循环完成一次级数倍增，极微量dna经过扩增后可以达到极易检测的水平。
pcr技术其灵敏度高可以达到pg级，同时还能保证被扩增的基因片段与原基因片段保持不变。
pcr技术还具有操作快速简便、易掌握，并且对标本要求不高等优点，使之广泛的应用于临床医学检验。
2 聚合酶链式反应在医学检验中的应用经过近几十年的研究发现，人类许多疾病的发生常与体内的遗传物质的改变有关，比如体细胞的癌基因或抑癌基因突变引发各种肿瘤，性细胞的基因突变则引起各种遗传病，各种病原体可以把它们特异的基因带人人体进而引起各种传染病。
由于医学技术的进步，pcr技术的出现为我们进行基因诊断奠定了基础，这将改变以往对疾病的表型进行诊断的诊断方式，使得我们可以从本质上认识和诊断疾病。
尤其是在感染性疾病、肿瘤、遗传疾病等进行临床检验时，pcr技术具有无可比拟的重要性。
2.1 pcr技术在感染性疾病检验中的应用:利用pcr技术可利用少量的核酸序列对病原体进行检测。
PCR技术在临床检验中的应用
PCR技术在临床检验中的应用聚合酶链反应又叫DNA扩增技术。
进入到21世纪以来，在标本中，分析研究与鉴定检测特定的体外基因扩增技术重要方法就是PCR技術。
近些年以来，这项技术在许多研究领域以及临床的应用中都发挥着重要作用；同时PCR技术在遗传病诊断与传染病病原体鉴定以及癌基因治疗等众多方面均有十分重大的贡献。
本文主要是对PCR技术在临床检验中的应用进行分析和探讨。
标签：PCR技术；临床检验；应用1 PCR技术的概述PCR技术的基本原理是在扩增区域的两端，用两条互补的双链DNA模板引物，利用DNA聚合酶，引物会引发互补的DNA链。
在这个过程中，一条引物所引发的DNA链可以合成另外一条新的DNA链，循环反复多次以后，导致这两条引物之间的DNA大量复制[1]。
PCR技术的循环反应主要是由变性和退火以及延伸这三个基本步骤组成的循环。
PCR技术在基层疾病检测中的应用，是当今社会较为常见的。
对于肝炎病毒、肠道病毒、呼吸道系统感染、性病病原体等检测，PCR技术的敏感度精确度要比传统方法高。
2 PCR 技术在临床检验中的应用2.1PCR技术在传染性疾病检测中的应用目前我国典型的消化系统感染性疾病包括肝炎、胃炎等。
引发肝炎的病原体主要为乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒等。
使用PCR法对血清中的乙肝病毒进行检测的优势主要体现在早期诊断，并且在酶标试剂无法检测的情况下，PCR可以检出，大大缩短窗口前，使得患者能够得到早期诊断和治疗[2]。
2.2 PCR技术在肿瘤方面的应用现阶段，肿瘤的发病分子机制还不是完全的清楚。
PCR技术在肿瘤相关基因和肿瘤病毒病因以及肿瘤相关抑癌基因的研究方面，都已经得到了非常好的成果。
根据相关的资料表明，鼻咽癌与Burkitt 淋巴瘤以及EB病毒是有关系的；泌尿道肿瘤与食管肿瘤等以及人乳头瘤病毒是有关系的[3]；原发性肝癌和乙型肝炎病毒是有关联的。
通过癌基因或者基因变化的检测，人体癌的演变时，可以以肿瘤作为标志物直接应用在临床检测。
PCR在临床检验中是如何应用的
PCR在临床检验中是如何应用的医学临床检验大到可以分为四大类，包括形态学检验、生物化学检验、分子生物学检验以及血清免疫学检验，分别代表了临床上几代实验室检验技术。
在60年代时，出现了DNA双螺旋结构和半保留复制模式；70年代时，出现了基因重组技术以及体外基因克隆技术和分子杂交技术，这些技术的应用也使得分子生物学技术在临床诊断疾病中得到了长足的发展。
尤其是在1985年时，美国科学家Kary Mullis发明的聚合酶链式反应（polymerase chain reaction-PCR）技术，此项技术能够将微量的目的DNA片段扩增100万倍以上，这一技术的出现使得基因诊断技术在医学界真正发挥了举足轻重的作用，此技术被称为体外DNA扩增技术，它的出现成为现代医学发展的重要里程碑。
PCR用于对两段已知序列间的DNA片段进行扩增，这一过程与天然DNA复制过程相似。
PCR技术的优点在于敏感度高、特异性高、产率高以及重复性高，而且操作简单、快捷。
目前已经广泛应用于考古学、体育、法医学、微生物学等领域。
并且，在许多普通实验室中也得到了普及应用，使得传统的分子克隆技术大幅简化，进而能够通过相对简单的方法对目的基因进行分析和鉴定。
用于临床检验的PCR技术有别于传统PCR技术，有其独特的特点。
一般情况下，在处理样品时，多会采取非离子去污剂一次性加热的方式进行处理，此种方法虽然对于DNA的纯化有限，但是对于临床上微量、快速的检测需求而言十分适合。
此外，PCR反应体系中，各个组成成分都会提前预分装到相应的反应管事，这样，即可以使操作者的工作强度得以减轻，又可以在最大程度上降低了污染的风险，因此临床检验中使用价值极高。
一，在临床检验中，PCR检测的应用范围用于疾病的早期诊断、鉴别诊断、确定疾病的病因以及评价临床治疗的效果以及确定治愈标准等。
具体在临床检测中的应用如下：二，PCR在乙肝病毒检测中的应用通常情况下，会应用PCR法对血清中的乙肝病毒进行检测，PCR法检测乙肝病毒时的优势体现在以下几点：①可用于乙肝病毒感染的早期诊断，这是由于PCR扩增的敏感性极高，理论上来讲，PCR法能够检出100CID/mL乙肝病毒感染者血清，而且，早在感染的潜伏期即可被检出。
定量PCR方法及数据分析
定量PCR方法及数据分析定量PCR（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）是一种常用的分子生物学技术，用于测量特定DNA序列的相对数量。
它可以广泛应用于基因表达分析、病原体检测、基因拷贝数和染色体异常等研究领域。
本文将阐述定量PCR的基本原理，实验步骤和数据分析方法。
定量PCR的基本原理是依赖于DNA的扩增过程。
PCR反应需要一对引物，它们特异性地结合在目标DNA序列的两端，通过加热使DNA解旋，然后在适当的温度下引物与目标DNA序列互补结合，在酶的催化下进行扩增。
每一轮的PCR扩增会使目标DNA数量成指数型增加。
由于每一个目标序列的扩增效率可能不同，因此需要标准曲线来进行定量。
定量PCR的实验步骤分为两个阶段：前PCR和qPCR。
前PCR是标准曲线的制备阶段，通过将已知浓度的目标DNA进行PCR扩增，然后根据PCR产物的浓度制备一系列浓度梯度的DNA模板。
qPCR是主要实验阶段，将待测样品与合适的引物和探针（可选）混合，在PCR仪中进行扩增反应。
PCR反应后，根据荧光信号的强度，以及标准曲线计算得出待测样品中目标DNA的相对数量。
对于数据分析，常用的方法有相对定量和绝对定量两种。
相对定量是将待测样品与对照样品进行比较，计算出相对表达量。
这需要选择一个内部参考基因（housekeeping gene），其表达在不同条件下稳定不变。
通过将待测基因和内部参考基因的Ct值（cycle threshold）相减，得出差值。
差值较大表示待测基因表达高，差值较小表示待测基因表达低。
这种方法的优点是操作简单，但存在引物和探针设计的问题，以及内部参考基因选择的问题。
因此，有时候也需要进行多个内部参考基因的选择。
绝对定量是根据标准曲线计算待测样品中目标DNA的绝对数量。
标准曲线可以通过前PCR阶段制备的一系列DNA模板进行构建。
通过将已知浓度的DNA模板进行qPCR测定，得到Ct值和浓度之间的标准曲线。
临床基因扩增检验实验室验收和复审要求
临床实验室生物安全管理研讨会临床基因扩增检验实验室验收和复审要求师志云赵志军魏军宁夏医科大学附属医院医学实验中心750004宁夏医科大学附属医院医学实验中心PCR检测室于2006年7月16日通过卫生部临床检验中心临床摹因扩增检验实验室的技术验收，并获得技术验收合格证书(No．00527)。
目前，本中心PCR检测室搬迁至新的实验室，按照《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》和《临床基因扩增实验室工作规范》文件，需要进行复审验收及换证。
现将临床基因扩增检验实验室技术验收和复审要求做一简单介绍。
1临床PCR技术准入管理背景临床基因扩增检验实验室主要应用PCR(聚合酶链反应)技术于疾病的诊断与治疗监测。
但在上世纪九十年代，我国由于部分医疗机构受利益的驱动，在缺乏技术、设备以及规范化管理的情况下，PCR技术临床应用泛滥，出现大量假阳性和假阴性结果，造成枪验结果和临床意义应用十分混乱，严重扰乱正常医疗秩序。
PCR技术临床应用所出现的一系列问题引起卫生部管理层高度重视，卫生部医政司于1998年F发了卫医发[199819号文件宣布P CR技术暂停应用于临床诊断。
经过近四年反复论证，卫生部2002年1月14日发布“临床基因扩增检验实验室管理暂行办法”(简称暂行办法)，同年2月20日卫生部临床检验中心发布“临床基因扩增实验室工作规范”。
两个文件宣布了PCR技术临床应用解冻，明确规定临床基因扩增检验实验室开展PCR技术必需具备的基本条件：①规范的PCR实验室②编写适合本实验室的质量手册③经PCR专业知识培i)il的技术人员(PCR上岗证)④使用有生产批文的 PCR试剂。
具备条件的二级以上医院可向卫生部或省临床检验中心申请技术验收。
2技术验收要点2．1为什么要进行临床基因扩增检验实验室技术验收? 临床基因扩增实验室采用PCR技术用于临床基因诊断，由于PCR技术对所检测的核酸模板进行大量扩增，容易出现实验室污染导致临床检测标本假阳性结果；另外由于PCR技术要求高、影响因素多(特别是 RNA标本)，实验过程处理不当易导致核酸模板无扩增现象，导致临床标本假阴性结果。
实时荧光聚合酶链反应临床实验室应用指南(WST 230—2024)
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本标准必不 可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版 本适用于本标准；不注日期的引用文件，其最新版本（包括 所有的修改单）适用于本标准。
GB/T 37874 核酸提取纯化方法评价通则 GB/T 40974 核酸样本质量评价方法 JJF 1874 （自动）核酸提取仪校准规范 JJF 1527 聚合酶链反应分析仪校准规范
5 样本采集和处理
5.2 样本采集
5.2.3 采样时效
5.2.3.1 应结合不同检测目的与疾病特点， 明确样本采集的时 效性， 避免因在疾病发生发展过程中样本采集过早或过迟而 导致假阴性结果。 感染性疾病可考虑在病程不同阶段连续采 样送检。
5.2.3.2 手术、 输血、 药物治疗等医疗行为可影响实时荧光 PCR 检测结果， 采样前应明确患者有无接受上述诊疗行为， 如有宜建议推迟采样或在报告中备注相关情况。
性酶促扩增技术。 当存在模板、 底物、 引物和耐热DNA聚合酶 时， 通过调节反应温度引导多次“变性-退火-延伸” 反应循环， 可令痕量DNA模板扩增数百万倍。 3.2 实时荧光聚合酶链反应 real-time fluorescence polymerase chain reaction;real-time PCR 在 PCR 反应体系中引入荧光基团， 利用荧光信号的积累实时监 测整个 PCR 进程， 通过连续监测绘制反应动力曲线， 从而对样 本中被扩增模板 DNA 的初始含量进行计算。 该技术包含定性和 定量检测， 常以qPCR（quantitative polymerase chain reaction） 代 表定量检测。
临床检验仪器第十三章PCR核酸扩增仪习题
第十三章PCR核酸扩增仪一、名词解释1. PCR技术：聚合酶链反应（PCR）是一种体外核酸扩增技术。
2. TaqDNA聚合酶：存在于水生嗜热菌的嗜热DNA 聚合酶，可在74℃复制DNA，在95℃仍具有酶活力。
3. 水浴锅PCR核酸扩增仪：属于第一代PCR基因扩增仪，以不同温度的水浴锅串联成一个控温体系。
4. 压缩机PCR核酸扩增仪：于第二代PCR基因扩增仪，由压缩机自动控温，金属导热。
5.Overshooting:升温过程中，由于一些加热元件，比如半导体、金属块上积蓄的能量仍然会传给PCR体系，造成实际的温度高于设定的温度，即overshooting 现象。
6.Undershooting：在降温过程中也会出现惯性，造成实际的温度短时间内会低于设定温度。
7..半导体PCR核酸扩增仪：属于第三代PCR基因扩增仪，由半导体自动控温，金属导热。
8.离心式空气加热PCR扩增仪：属于第三代PCR基因扩增仪，由金属线圈加热，采用空气作为导热媒介。
9.梯度PCR仪：带梯度PCR功能的基因扩增仪，在反应过程中每个孔的温度控制条件可以在指定范围内按照梯度变化，根据结果，一步就可以摸索出最适合的反应条件。
10 原位PCR仪：带原位扩增功能的基因扩增仪。
11. 原位PCR技术：即在细胞内进行PCR扩增，组织细胞的形态不被破坏，是原位杂交与PCR技术结合而形成的新技术。
12. 荧光实时定量PCR技术：在PCR反应体系中加入特异性的荧光染料或探针，通过检测荧光信号，实时监测整个PCR反应过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。
13. 位置的边缘效应：指PCR基因扩增仪最外周的样品孔温度与中间的样品孔差异，不均一，从而导致外周样品孔的PCR扩增效率不佳。
14. 模块温控模式：仪器根据探测器直接探测的承载样品金属基座温度进行控制，该模式适用于长时间的静态孵育。
15. 反应管温控模式：仪器根据探测器所探到的温控模块的温度由计算机计算出样品管内或PCR板孔内样品液的温度来进行控制。
PCR上岗证考试题及答案(全)
理论考试卷一，填空（每题2分，共20分）1.DNA双螺旋中两条链走向是反向平行的，即一股链是5’→3’走向，另一股链为3’→5’走向；生物合成方向是5’→3’。
2.在极端的PH值或受热条件下，核酸分子中的氢键断裂，双螺旋结构解开，即为核酸变性。
3.核酸分子的杂交其实就是DNA 变性、复性原理的应用。
4.PCR扩增的三个基本阶段是变性、退火、延伸，引物与模板的结合发生在退火阶段5.反转录酶催化的DNA合成反应按5’→3’方向进行，在DNA合成时也需要引物，引物为病毒颗粒中的mRNA 。
6.PCR测定中的“假阳性”的最主要的来源是PCR产物的污染。
7.请填出以下各种微量移液器可取溶液的体积范围P10 P20 2-20ul P100 20-100ul P200 50-200ul如需吸取100ul液体，则最好使用P100 加样器。
8.在基因扩增检验中，使用的带滤塞吸头吸加液体，只要是为了防止标本间交叉污染。
9.TapMan荧光PCR测定原理中的关键点在于利用了Tap酶的5’→3’的外切酶活性，Ct值指的是每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。
10.个体化医学的全面定义：分为疾病风险预测（基因检测）和个体化治疗（基因检测）两个方面，基因预测疾病风险是指根据每个人的疾病基因组信息预测疾病的发生风险。
个体化治疗是指根据每个人的疾病基因组信息对已发生的疾病进行治疗。
二，是非题（正确的后面打√，错误的后面打×，并将错误处划线并改正，每题两分，未改正得1分，共20分）1.DNA双链中，碱基对总是A-T ,C-G配伍，其间以两个氢键相连。
（×）G-C间以三个氢键相连2.使用有防“污染”作用的UNG的PCR试剂盒，PCR实验室就不必严格分区。
（×）UNG酶只对低浓度的产物污染有效3.在全血、骨髓标本的采集时，可使用EDTA、枸缘酸钠或肝素抗凝。
（×）不能使用肝素抗凝4.血清HBeAg的存在是HBV感染及感染程度的确证标志。
分析临床基因扩增检验实验室的质量控制
中国卫生产业[作者简介]时超杰(1994-),男,本科,检验师,研究方向为临床基因扩增技术在临床检验中的应用。
[通信作者]何敖林(1973-),男,硕士,副主任检验师,研究方向为检验医学,E-mail:*****************。
PCR 技术是现代分子生物学检测的先进技术之一,现在的分子诊断都基于这项技术。
它让人类基因组计划得以于2003年初步完成,通过基因组分析,科学家们揭示了人类基因的多态性与许多易感疾病的关系,并延伸到了基因工程药物、基因生物芯片、细胞生物工程等的研究。
此外,通过个体化的基因组表达分析,还能为个体提供一套疾病诊断、治疗、预后的方案,实现真正的精准医疗,PCR 技术实现了个体化检测[1]。
但是,随着技术的迅速发展,外界对于检测结果准确性的质疑也越来越多。
一方面,由于PCR 技术本身的高敏感性,操作不当或是微量的污染都极易导致检测结果的假阳性;另一方面,实验室布局不合理、样本管理不当、试剂耗材管理不当、仪器设备状态不良、人员缺乏培训、质控不在控、扩增污染、异常结果处理不当、检测结果报告错误等,这些都是随时可能发生在实验前、中、后期的。
最后,细节决定成败,由于实验步骤较多,实验人员容易疏忽出错,实验过程中涉及的各个环节都是需要实验人员认真严谨地去对待,只有这样才能为临床提供更可靠的服务。
面对上述这么多的问题,这就要求实验人员在临床检测的工作之前,更要重视实验室的质量管理。
1实验前的质量控制1.1实验室的布局实验室的布局需要满足《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》等相关规定,确保各个分区独立且专用。
1.2实验室的设施环境实验室应该规定人流、物流以及清洁工作的单向流动来防止区间污染。
安排实验人员对实验室的空间、照明、能源、温度、湿度等的监测来满足检测工作的环境要求。
此外,各个区域都应要有紫外灯的设置,包括固定的吊顶紫外灯以及移动紫外消毒车,以满足实验室防止“基因/核酸”污染的要求。
临床聚合酶链反应(PCR)测定的质量控制
Ｌ则 失 去 对 Ｒ ｓ Ｎａｅ的 抑 制 作 用 ，而 使 Ｒ Ａ 迅 速 降 Ｎ
解 。使 用 ＧＩ Ｃ作 为 稳 剂 保 存 标 本 ， 本 可 在 室 温 Ｔ 标 下 稳 定 约 ７天 。 此 外 ， 测 定 的 靶 核 酸 为 血 循 环 中 如
能存 在 的核 酸 酶 失 活 ，可 加 人 Ｃ ａ ｒｐｃ物 质 ， ｈｏｔ ｉ ｏ 最 常 用 的 是 ４ ｌＬ 异 硫 氰 酸 胍 盐 （ ａ ｉｉｉｍ ｍｏ／ Ｇｕ ｎｄｎｕ
１． 标本 采集 部位 的准备 ．１ １
标 本 采 集 部 位 的 清
洁 消 毒 可 去 掉 污 染 的 微 生 物 或 其 它 杂 物 ，但 应 适 度 ， 标 本 采 集 部 位 的 准 备 应 由训 练 有 素 的人 员 进 故
行。
ｉ ｔｉｃ ａ ａ ， Ｇ Ｔ ， 同 时 与 还 原 剂 如 Ｂ 巯 基 ｓ ｈｏ ｙ ｎ ｅ ｏ Ｉ Ｃ） 并 一 标 本 的类 型 和 采 集 乙醇 或 二 巯 基 乙醇 一 起 使 用 。 用 终 浓 度 为 ５ ｌＬ 使 ｍｏ ／ 的 ＧＩ Ｃ， 使 Ｒ ｓ Ｔ 可 Ｎａｅ不 可 逆 地 失 活 ， 浓 度 ＜ ｍｏ 加 ４ ｌ ／
项 目有 ： 核 分 枝 杆 菌 ， 眼衣 原 体 、 型 肝 炎 病 毒 结 沙 乙
Ｄ ＮＡ及 丙 型 肝 炎 病 毒 Ｒ Ａ、 Ａ，临 床 基 因 扩增 实 Ｎ ＨＬ
验 室 开 展 Ｐ Ｒ 检 测 这 些 项 目 ， 其 整 个 检 测 过 程 进 Ｃ 对
人操作者 的头发 ， 皮细胞 、 液等 。如使用玻璃器 表 痰
皿 ，必 须 经 高压 灭 菌 ， 以 使 可 能存 在 的 Ｒ Ａａｅ失 Ｎ ｓ
定量PCR HBV DNA室间质量评价可接受范围的探讨
值表示 ） 比较 ，１ 、１５差值均超过了 ０４ ４个不同浓度样本其 ｓ Ｃ 均超过了允许总误差为 ０４时的 ５ Ｃ 。 １４ １４ ．； 和 Ｖ ． 和 Ｖ
３种评价方式评价实验室成绩合格率分别为 １０ 、８２ 、 ． ％。结论 ０ ％ ８ ．％ ６ ７ ４ 采用组均值 ４ ｓ － 为定量 Ｐ Ｒ Ｂ Ｎ ３ Ｃ Ｈ ＶＤ Ａ 室问质量评价的可接受范 围更合理 ， 更能真实地反 映和监控实验室检测能力。
关键词 ： 乙型 肝 炎 病 毒 ； Ｎ 聚 合 酶 链 反 应 ； 间 质量 评 价 ； 接 受 范 围 Ｄ Ａ； 室 可
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实时荧光定量聚合酶链反应技术
实时荧光定量聚合酶链反应技术实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR）是实时荧光PCR（real-time PCR）的一种。
实时荧光PCR是指在PCR反应体系中加入可以反映PCR扩增进程的荧光基团，并在PCR过程中实时监测荧光信号的变化。
实时荧光定量PCR技术则是将定量PCR的原理应用到实时荧光PCR，通过在实时荧光定量PCR的基础上引入已知浓度的参照基因，或者通过标准曲线来达到对目的基因初始浓度的定量，换句话说，实时荧光定量PCR是指在PCR反应体系中加入荧光基团（如荧光染料、荧光基团标记的探针或引物），并在整个PCR进程中实时监测荧光信号的累积，最后通过参照基因或标准曲线对未知浓度的模板进行定量分析。
实时荧光定量PCR是20世纪90年代初期快速发展起来的可对起始DNA模板浓度精确定量的PCR方法。
在实时荧光定量PCR技术的发展进程中，两个重要的发现起着关键的作用：①在20世纪90年代早期，Taq DNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的发现，它能降解特异性荧光记探针，因此使得间接的检测PCR产物成为可能；②此后，荧光双标记探针的运用使在一密闭的反应管中能实时地监测反应全过程。
随着实时荧光定量PCR技术方法的成熟与稳定，以及配套仪器的不断完善，实时荧光定量PCR已经走向临床，如应用于各种病原体的检测。
一、定量PCR的原理与类别定量PCR是指以参照物为标准，对PCR终产物进行分析或对PCR过程进行监测，从而达到评估样本中靶基因的拷贝数。
定量PCR的可行性定量一般是在PCR扩增的指数期进行。
根据PCR扩增过程中是否加入某种标记物、标记物的种类和最后检测的信号的不同可分为至少4种类型：直接定量检测法、放射性核素标记定量检测法、酶标记定量检测法和实时荧光定量PCR法。
根据反应体系是否设有参照物及其是否与标本在同一管中进行扩增，定量PCR可分为4种方法：（一）有限稀释法也叫倍比稀释法，其参照品的浓度是通过不断稀释直至靶基因不能再扩增为止，然后根据阳性结果的最大稀释度及内参标或外参标的极限检出底线，计算出待检标本中原始模板的分子数。
临床检验仪器第十三章PCR核酸扩增仪习题
第十三章PCR核酸扩增仪一、名词解释1.PCR技术：聚合酶链反应（PCR）是一种体外核酸扩增技术。
2.TaqDNA聚合酶：存在于水生嗜热菌的嗜热DNA聚合酶，可在74℃复制DNA，在95℃仍具有酶活力。
3.水浴锅PCR核酸扩增仪：属于第一代PCR基因扩增仪，以不同温度的水浴锅串联成一个控温体系。
4.压缩机PCR核酸扩增仪：于第二代PCR基因扩增仪，由压缩机自动控温，金属导热。
5.Overshooting:升温过程中，由于一些加热元件，比如半导体、金属块上积蓄的能量仍然会传给PCR体系，造成实际的温度高于设定的温度，即overshooting现象。
6.Undershooting：在降温过程中也会出现惯性，造成实际的温度短时间内会低于设定温度。
7..半导体PCR核酸扩增仪：属于第三代PCR基因扩增仪，由半导体自动控温，金属导热。
8.离心式空气加热PCR扩增仪：属于第三代PCR基因扩增仪，由金属线圈加热，采用空气作为导热媒介。
9.梯度PCR仪：带梯度PCR功能的基因扩增仪，在反应过程中每个孔的温度控制条件可以在指定范围内按照梯度变化，根据结果，一步就可以摸索出最适合的反应条件。
10原位PCR仪：带原位扩增功能的基因扩增仪。
11.原位PCR技术：即在细胞内进行PCR扩增，组织细胞的形态不被破坏，是原位杂交与PCR技术结合而形成的新技术。
12.荧光实时定量PCR技术：在PCR反应体系中加入特异性的荧光染料或探针，通过检测荧光信号，实时监测整个PCR反应过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。
13.位置的边缘效应：指PCR基因扩增仪最外周的样品孔温度与中间的样品孔差异，不均一，从而导致外周样品孔的PCR扩增效率不佳。
14.模块温控模式：仪器根据探测器直接探测的承载样品金属基座温度进行控制，该模式适用于长时间的静态孵育。
15.反应管温控模式：仪器根据探测器所探到的温控模块的温度由计算机计算出样品管内或PCR板孔内样品液的温度来进行控制。
聚合酶链反应系统检测人巨细胞病毒DNA的性能验证及评价
学术论著中国医学装备2023年8月第20卷第8期 China Medical Equipment 2023 August V ol.20 No.8*基金项目：军队生物安全研究专项资助项目(19SWAQ06)“超级细菌生物学特性及防控技术的研究”①解放军总医院第五医学中心南院区检验科 北京 100073*通信作者：*********************；***********作者简介：袁方，女，(1989- )，本科学历，主管技师，从事医院分子诊断技术及研究工作。
[文章编号] 1672-8270(2023)08-0039-05 [中图分类号] R446 [文献标识码] APerformance verification and evaluation of PCR system in detecting HCMV DNA/YUAN Fang, TONG Li-wei, YAN Yan, et al//China Medical Equipment,2023,20(8):39-43.[Abstract] Objective: T o conduct performance verification and evaluation of real-time fluorescent quantitative-polymerase chain reaction (FQ-PCR) system in detecting human cytomegalovirus deoxyribonucleic acid (HCMV DNA) so as to satisfy the demands of clinical detection. Methods: The clinical samples of hospital and the standard samples provided by third party were collected, and the real-time FQ-PCR system was adopted to detect the performance of HCMV DNA reagent and conduct evaluation. The accuracy, measurement precision (intra batch repeatability and inter batch precision), linear interval, detection limit, anti-interference ability, cross reaction and other performance of the detection method of HCMV DNA FQ-PCR system were verified and evaluated according to the corresponding requirements of the series of documents of <Guidance on the Performance V erification for Molecular Diagnostic Procedures (CNAS-CL039)> and <Guidance on the V erification of Quantitative Measurement Procedures used in the Clinical Chemistry (CNAS-GL037)> of China National Accreditation Service for Conformity Assessment, and the EP series files of Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) of American. Results: The accuracy of FQ-PCR system was within the permissible range in detecting HCMV DNA, and the coefficients of variation (CVs) of precision of intra batch repeatability of low and high concentrations samples (1.72E+04copies/ml and 2.74E+09 copies/ml) were respectively 3.90% and 0.11%, and the inter batch precision CVs of them were respectively 4.05% and 0.94%. The linear relationship was favorable within the range between 4.00E+02 and 4.00E+09 copies/ml (R 2=0.999), which met the requirements. The lower limit of detection could reach to 4.00E+02 copies/ml, and the absolute deviations between the detective results of the interferences (total bilirubin, triglycerides and hemoglobin) and the control sample were ≤± log0.4. The detective results of cross reactions of pathogens [hepatitis B virus, hepatitis C virus, herpes simplex virus, human herpesvirus type 4 (EB virus), human papillomavirus type 6 / 11)] were negative. Conclusion: The each performance indicator of the FQ-PCR detection method of HCMV DNA is consistent with the statement of the manufacturer, which can be used in clinical detection.[Key words] Human cytomegalovirus (HCMV); Deoxyribonucleic acid (DNA); Performance verification; Real-time fluorescence quantitation[First-author’s address] Qinghai Provincial Drug Inspection and T esLaboratory, The South Branch of the Fifth Medical Center of Chinese PLA General Hospital, Beijing 100073, China.[摘要] 目的：利用实时荧光定量-聚合酶链式反应(FQ-PCR)系统检测人巨细胞病毒脱氧核糖核酸(HCMV DNA)的性能验证及评价，以满足临床检测需要。
临床基因扩增检验实验室管理暂行办法
临床基因扩增检验实验室管理暂行办法第一章总则第一条为规范临床基因扩增检验实验室管理，保证临床基因扩增检验质量，使临床诊断和治疗更为科学、合理，特制定本办法。
第二条临床基因扩增检验技术指以临床诊断治疗为目的，以扩增检测DNA或RNA为方法的检测技术，如聚合酶链反应（PCR）、连接酶链反应（LCR）、转录依赖的放大系统（TAS）自主序列复制系统（3SR）和链替代扩增（SDA）等。
第三条本办法适用于开展临床基因扩增检验的实验室。
临床基因扩增检验实验室设立在二级以上医院。
第四条临床基因扩增检验实验室必须使用经国家药品监督管理局批准的临床检验试剂开展临床基因扩增检验项目。
第五条卫生部临床检验中心（以下简称卫生部临检中心）和省、自治区、直辖市临床检验中心（以下简称省临检中心）负责对所辖行政区域内临床基因扩增检验实验室的质量监督管理工作。
第二章实验室设置和验收第六条拟设置临床基因扩增检验实验室的医疗机构按照《临床基因扩增检验实验室基本设置标准》（见附件）筹建实验室；筹建完成后，由法定代表人向卫生部临检中心提出技术验收申请。
申请时需提交以下材料：（一）《医疗机构执业许可证》复印件；（二）可行性研究报告；1、拟设临床基因扩增检验实验室机构的所在地医疗卫生资源状况、本机构的基本情况、对临床基因扩增检验的需求以及临床基因扩增实验室运行的预测分析；2、拟设临床基因扩增检验实验室的设置平面图；3、拟设临床基因扩增检验实验室将开展的检验项目、实验设备条件和有关技术人员资料第七条卫生部临检中心和省临检中心共同组织相关专业的专家组（以下简称专家组），按照《临床基因扩增检验实验室基本设置标准》对提出申请的临床基因扩增检验实验室进行技术验收。
验收完成后，在20日内将验收报告寄送至申请机构。
第八条经专家组技术验收合格的医疗机构将本办法第六条规定的材料及专家组验收报告送至省级行政部备案。
在将符合规定的全部材料送达省级卫生行政部门后15日内未收到省级卫生行政部门不同意的意见，方可开展专家组技术验收合格的临床基因扩增检验项目。
PCR检验实验室检查要点指南
PCR检验实验室检查要点指南2016年8月31日，北京市食品药品监督管理局发布了《PCR检验实验室检查要点指南(2016版）》，具体内容如下：聚合酶链反应（PCR）检验实验室检查要点指南（2016版）聚合酶链反应检验实验室是指通过基因扩增的方式检测特定的DNA或RNA的检验实验室。
聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种在体外特异性扩增靶DNA序列的技术，其基本过程为模板双链DNA的变性、引物与模板DNA的退火和在DNA 聚合酶引导下的链延伸反应三个阶段的多次循环。
每一次循环后的扩增产物均可作为下一轮循环的模板，理论上，扩增产物量呈指数形式上升，即经过n个循环后,产物量增加到2n倍。
PCR试剂操作简单，短时间内在体外可获得数百万个特异靶DNA序列的复制，为临床疾病的诊断、治疗监测和预后评估提供了一种极有帮助的实验室辅助手段。
PCR检验实验室是PCR试剂生产企业在产品检验过程中不可缺少的工作环境,其环境控制水平和质量管理水平直接影响着最终产品是否合格,能否放行。
由于该产品本身的特殊性，《医疗器械生产质量管理规范附录体外诊断试剂》、《医疗器械生产质量管理规范体外诊断试剂现场检查指导原则》条款中，明确对PCR试剂的生产和检验环境做出规定。
此外现行卫生行业的法规、标准以及相关文献中对于PCR检验实验室均作出规定，主要涉及《全国临床检验规程》（第三版）、《医疗机构临床基因扩增管理办法》(卫办医政发〔2010〕194号）、《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》及《临床诊断中聚合酶链反应（PCR)技术的应用》（WS/T 230-2002)等行业标准的相关要求.本检查指南旨在帮助北京市医疗器械监管人员增强对PCR检验相关过程的认知和把握，指导全市医疗器械监管人员对PCR检验实验室设计建设与质量控制的监督检查工作。
同时，为PCR试剂生产企业在PCR检验实验室的设计建造和管理要求提供参考。