7.17.27.3蛋白质含量测定

凯氏定氮法所测得的含氮量为食品的总氮量，其中还包括少量的 非蛋白氮，如尿素氮、游离氨氮、生物碱氮、无机盐氮等，由凯氏定氮法 测得的蛋白质称为粗蛋白质。
2.试剂和材料

除非另有规定，本方法中所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682 规定的三级水。


4.1 硫酸铜（CuSO4· 5H2O）。
一、测定蛋白质含量的常规方法（5种） 1、凯氏定氮法 2、乙酰丙酮比色法？ 3、双缩脲比色法等， （这些方法均存在着样品需要预处理、操作繁琐耗时等缺点。 但凯氏定氮法和乙酰丙酮比色法作为我国食品卫生标准检测 方法，分析成本低，测定结果准确，应用十分广泛。） 4、近红外光谱技术是20世纪80年代后期迅速发展起来的一 项物理测试技术。近红外透射或反射光谱具有分析样品用量 少、分析速度快和结果稳定等优点，在食品分析领域已经逐 步得到了应用。 5、杜马斯燃烧法比凯氏定氮法还早，近年来杜马斯燃烧法 测定饲料、肥料等农产品中氮含量在我国也有了应用。

4）结果处理

X
试验中蛋白质含量 ，g/100g（旧标准中有g/100 mL）
V1 试样消耗硫酸或盐酸标准滴定溶液的体积，mL
V2 空白消耗硫酸或盐酸标准滴定溶液的体积，mL V3 吸取消化液的体积，单位为毫升（mL）


c
m
硫酸或盐酸标准滴定溶液的浓度，mol/L
试样质量，g

0.0140 1.0 mL 硫酸[c (1/2H2SO4)＝1.000 mol/L]或盐酸[c (HCl) ＝1.000 mol/L]标准滴定溶液相当的氮的质量，单位为克 （g）； M 试样的质量，单位为克（g）； F 氮换算为蛋白质的系数。一般食物为6.25；纯乳与纯乳 制品为6.38；面粉为5.70；玉米、高粱为6.24；花生为5.46； 大米为5.95；大豆及其粗加工制品为5.71；大豆蛋白制品为 6.25；肉与肉制品为6.25；大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83； 芝麻、向日葵为5.30；复合配方食品为6.25。
3.从回收率的角度看，半微量要稍好。
半微量凯氏定氮装置
微量凯氏定氮装置
微量、半微量差别在装置上，二者 皆属于水蒸汽蒸馏操作，只是前者 把蒸汽直接导入反应室内，后者把 蒸汽导入反应室外加热。
常量凯氏定氮装置
分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵，然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后 以硫酸或者盐酸标准滴定溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为 蛋白质的含量。其反应方程式如下：
3）基酸氨基酸与金属离子的整合作用
许多重金属离子和氨基酸作用产生螯合物。
4）氨基酸的脱氨基、脱羧基反应
脱氨基反应与脱羧基反应是食品腐败，产生毒性和臭味的 原因。
5）褐变反应（美拉德反应）
氨基酸和糖在加热过程中生成类黑色 物质的反应。 是食品加工中常见的化学反应。 应用：赋予食品焙烤香味和色泽。
第二部分 基础知识
项目七 蛋白质和氨基酸含量的测定
项目内容： 一、蛋白质含量测定 7.1 乳粉蛋白质含量测定（实验准备） 7.2 乳粉蛋白质含量测定-样品消化
7.3 乳粉蛋白质含量测定-消化液蒸馏及滴定
二、氨基酸含量测定 7.4 氨基酸含量测定
7.1
蛋白质含量测定-实验准备
第一部分 课题引入
一、蛋白质的重要性
1. 蛋白质是生物体内必不可少的重要成分
☆酶 ☆肌肉 ☆抗体 ☆激素 ☆血液 ☆表皮、毛发
3. 蛋白质有营养功能，在加工过程中起到重要作用
在食品加工的过程中，蛋白质除了表现出营养 方面的重要性，在食品的品质、 结构、形态以及色、香、味 等方面均具有重要作用.
二、蛋白质的组成
蛋白质是一类含氮有机化合物，除含有碳、氢、氧 外，还有氮和少量的硫。
二、凯氏定氮法

GB 5009.5-2010 食品中蛋白质检测方法
第一法：凯氏定氮法
第二法：分光光度法 第三法：燃烧值法
凯氏定氮法是1883年Kjeldahl发明，当时凯氏只使用H2SO4来分解试 样，来定量谷物中的蛋白质，后来由Gunning加入改进，在消化时加入 K2SO4使沸点上升，加快分解速度，凯氏定氮法至今仍在使用。


乳制品中蛋白质的含量要结合具体的产品标准进行转换和计 算。

结果表示：以重复性条件下获得的两次独立测定结果的 算术平均值表示，蛋白质含量≥1 g/100 g 时，结果保留 三位有效数字；蛋白质含量＜1 g/100 g 时，结果保留两 位有效数字。 精密度：在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝 对差值不得超过算术平均值的10 %。
疏水性R基团AA 不带电荷极性R基团的AA
带电荷R基团的AA
3）必需氨基酸
在人体内不能合成，只能由食物提供的氨基酸。
人体所需的八种必需氨基酸
赖氨酸(Lys) 缬氨酸(Val)
：
蛋氨酸e) 苏氨酸(Thr) 苯丙氨酸(Phe)
婴儿时期所需:

3.仪器和设备：如前所述
4.实验步骤
1）样品处理

称取充分混匀的固体试样0.2 g-2 g、半固体试样 2 g-5 g 或液体 试样10 g-25 g（约相当于30 mg-40 mg 氮），精确至0.001 g， 移入干燥的100 mL、250 mL 或500 mL 定氮瓶中，加入0.2 g 硫 酸铜、6 g 硫酸钾及20 mL 浓硫酸，轻摇后于瓶口放一小漏斗， 将瓶以45°角斜支于有小孔的石棉网上。小心加热，待内容 物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微 沸，至液体呈蓝绿色并澄清透明后，再继续加热0.5 h-1 h。




4.14 亚甲基蓝乙醇溶液（1 g/L）：称取0.1g 亚甲基蓝，溶 于95%乙醇，用95%乙醇稀释至100 mL。
试剂和材料

4.15 溴甲酚绿乙醇溶液（1 g/L）：称取0.1g 溴甲酚绿，溶 于95%乙醇，用95%乙醇稀释至100 mL。 4.16 混合指示液：2 份甲基红乙醇溶液（4.13）与1 份亚甲 基蓝乙醇溶液（4.14）临用时混合。也可用1 份甲基红乙醇 溶液（4.13）与5 份溴甲酚绿乙醇溶液（4.15）临用时混合。
蛋白质存在于所有的生物细胞中，是构成生物体最基本的结构物质和功 能物质。
蛋白质占干重: 人体中（中年人）: 人体 45% 水 55% 细菌 50%~80% 蛋白质 19% 真菌 14%~52% 脂肪 19% 酵母菌 14%~50% 糖类 ＜1% 白地菌 50% 无机盐 7%
2. 蛋白质在生命活动中具有举足轻重的作用 蛋白质是生命活动的物质基础，它参与了 几乎所有的生命活动过程。
碳 (C) 50% 氢 (H) 6% 氧 (O) 19%～24% 氮 (N) 16% 硫 (S) 0%～4% 少量的磷 (P) 、铁 (Fe) 、 铜 (Cu)、锌 (Zn) 和碘 (I)等
一般样品含氮量平均在16%, 取其倒数100/16=6.25，即 为蛋白质换算系数，其含 义是样品中每存在1g元素 氮，就说明含有6.25g 蛋 白质）
COOCα R H
非解离形式
两性离子形式
与羧基相邻的α-碳原子上都有一个氨基，故称为α-氨基酸 天然存在的氨基酸均为 L-α-氨基酸（除甘氨酸），各种 氨基酸的 R 侧链各不相同。
2）氨基酸的分类
按R基团的酸碱性分 按R基团的化学结构分 按R基团的电性质分
中性AA 酸性AA 碱性AA
脂肪族AA 芳香族AA 杂环族AA
1. 原理：食品与硫酸和硫酸铜、硫酸钾一同加热消化，使蛋白质分解，
蛋白质+ H2SO4 → （NH4）2SO4 （NH4）2SO4+NaOH=NH4OH+Na2SO4 NH4OH → H2O + NH3 → NH4OH 2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4 NH3+(标准) H2SO4→（NH4）2SO4 （NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O (标准) H2SO4+NaOH→Na2SO4+H2O 一定要用浓硫酸（98%）
组氨酸(His)
2、氨基酸的化学性质
1）氨基酸的等电点 当溶液浓度为某一 pH 值时，氨基酸分子中所含的 -NH3+和-COO-数目正好相等，净电荷为0。这一pH值即 为氨基酸的等电点，简称pI。 氨基酸的离解性质:
COOH - H H3N
+
+
COO H3N
+
-
C R
H
pK1 ' +H
+
C R
H
-H pK2 ' +H

3）接收、滴定

蒸馏10 min 后移动蒸馏液接收瓶，液面离开冷凝管下端，再 蒸馏1 min。然后用少量水冲洗冷凝管下端外部，取下蒸馏 液接收瓶。
以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定至终点，其中2 份甲基红乙 醇溶液与1 份亚甲基蓝乙醇溶液指示剂，颜色由紫红色变成 灰色，pH 5.4；1 份甲基红乙醇溶液与5 份溴甲酚绿乙醇溶液 指示剂，颜色由酒红色变成绿色，pH 5.1。同时作试剂空白。

取下放冷，小心加入20 mL 水。放冷后，移入100 mL 容量瓶中， 并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混 匀备用。同时做试剂空白试验。
2）蒸馏

按图装好定氮蒸馏装置，向水蒸气发生器内装水至2/3 处， 加入数粒玻璃珠，加甲基红乙醇溶液（1 g/L）数滴及数毫 升硫酸，以保持水呈酸性，加热煮沸水蒸气发生器内的水并 保持沸腾。 向接收瓶内加入10.0 mL 硼酸溶液及1-2 滴混合指示液并使 冷凝管的下端插入液面下，根据试样中氮含量，准确吸取 2.0 mL-10.0 mL试样处理液由小玻杯注入反应室，以10 mL 水洗涤小玻杯并使之流入反应室内，随后塞紧棒状玻塞。将 10.0 mL 氢氧化钠溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其缓缓流入 反应室，立即将玻塞盖紧，并加水于小玻杯以防漏气。夹紧 螺旋夹，开始蒸馏。