RNA isolation
试剂盒--总RNA_提取__SV_Total_RNA_Isolation_System_Kit
总RNA 提取（SV Total RNA Isolation System Kit，Promega）1.低于30mg的样品中加入175µl裂解缓冲液(SV RNA Lysis Buffer＋BME)，充分匀浆。
2.加入350µl蓝色的RNA 稀释缓冲液（SV RNA Dilution Buffer），颠倒3-4次使样品充分混合。
3.放入70℃水浴中裂解3min。
注：温育时间不要超过3分钟，否则可能破坏RNA的完整性。
4.14，000g 离心10 min。
小心用移液器将上清液转移到新的Eppendorf管中。
注：①若是组织中脂肪含量较高，需重复几次此步骤；②避免吸到颗粒物。
5.加入95%的乙醇200µl于上清液，用枪头冲吸3-4 次。
6.将其全部转移到带有滤膜的微型柱中，14,000g, 离心1min，弃滤液。
7.加入600µl冲洗缓冲液（SV RNA Wash Solution）, 14,000g, 离心1min，弃滤液。
注：确保SV RNA Wash Solution已用乙醇稀释过。
8.按样品数量准备DNA 酶Ⅰ混合液，用于降解DNA。
每样需40µl黄色缓冲液, 5µl 0.09M的MnCl2和5µl DNA 酶Ⅰ配制的DNA 酶Ⅰ混合液。
注：①DNA 酶Ⅰ必须在冰上解冻；②温柔用移液器混合，不可涡旋。
9.确保加50µl DNA 酶Ⅰ混合液到滤膜中间，室温保持15 min。
10.加入200µl终止反应缓冲液（SV DNase Stop Solution），14,000g, 离心1 min，不必弃滤液。
注：确保SV DNase Stop Solution中已加入乙醇。
11.加入600µl 冲洗缓冲液（SV RNA Wash Solution），14,000g，离心1 分钟，弃滤液。
12.再加入250µl冲洗缓冲液洗一次（SV RNA Wash Solution），14,000g，离心2 min，弃滤液，转移微型柱到新的洗脱管中。
罗氏RNA提取试剂盒使用指南说明书
Step 1: Sample Preparation & Nucleic Acid IsolationFor great results, use (click product names to learn more):Roche High Pure RNA Isolation KitRoche High Pure FFPET RNA Isolation KitRoche High Pure miRNA Isolation KitRoche RealTime ready Cell Lysis KitFrom which source (animal, organ, tissue) does the examined material originally come from? Which volume or mass or cell number was used for nucleic acid preparation?My MIQE Guide*Empowering results that matter Sponsored by Roche Applied Science Experiment title:Performed by:Date:Institution:Experimental design: How did you choose and set up your study (number of treated samplesand controls)Handling: Which tools or methods were used to obtain and process the primary samples (e.g., micro-dissection, macrodissection)?Method of processing and preservation: How was the sample treated and stored?If frozen – how and how quickly?If fixed – with what, and how quickly?If stored for longer: how and how long? (especially for FFPE samples)Extraction method:Which kit or instrument was used to extract/isolate the DNA/RNA from the starting material? Roche High Pure RNA Isolation Kit, High Pure FFPET RNA Isolation Kit, High Pure miRNA Isolation Kit, RealTime ready Cell Lysis Kit, or other (Please specify)Was the vendor’s protocol modified (If Yes, when, and how? e.g. by using additives)Did you do a DNAse or RNAse treatment? (If Yes, when?)Did you check for nucleic acid purity and integrity? If Yes: By using which instrument and method? What was the resulting purity (A260/A280)? What was the resulting yield? If No: Why not?Did you check for the presence of PCR inhibitors? If Yes: By using what (e.g. Cq dilutions, spike or other (please specify)If No: Why not?Final storage solution (e.g., buffer, H2O) for the purified total RNA:Storage time and temperature of the purified total RNA before use in RT-qPCR:Step 2:Reverse TranscriptionFor optimal results, use:Roche Transcriptor First Strand cDNA Synthesis KitRoche Transcriptor Universal cDNA MasterAmount of RNA and reaction volume:Priming oligonucleotide (if using gene specific primers) and concentration: Reaction temperature and time:Manufacturer of reverse transcription reagent(s) and catalogue number(s): Reverse transcriptase type and used concentration:Storage conditions of cDNA:Step 3:PCR Amplification and AnalysisFor best results, use:LightCycler® 480 Probes MasterFastStart Essential DNA Probes MasterFastStart Universal Probe Master (Rox)Target sequence and amplicon information: Target gene database sequence accession number:Location of amplicon:Amplicon length:Result of in silico specificity screen (BLAST, etc.):Information on pseudogenes, retropseudogenes or other homologs: Secondary structure analysis of amplicon:Determined by which method?Location of each primer relative to exons or introns (if applicable): Targeted splice variants:RTPrimerDB Identification Numbers: Manufacturer of oligonucleotides: Purification method:For probe-based assays: Probe type:qPCR reaction conditionsReaction volume and amount of cDNA/DNA per reaction: Primer, (probe), Mg2+ and dNTP concentrations: Polymerase identity:Buffer/kit manufacturer and identity (e.g., catalog number)Manufacturer and catalog number of plates or tubes and catalog number:Complete thermocycling parameters:Reaction setup: Was it manual or robotic? If robotic: Using which robot?Equipment: Which Real-Time PCR instrument was used? (Which Roche LightCycler® System or other (please specify)?)Validation of qPCR runs:Are you running a multiplex assay? If yes, please describe efficiency and limit of detection foreach assay:How did you check for specificity of amplification for each target (e.g., on a gel, by sequencing, melt-ing curve analysis or digest):For SYBR Green I assays: Cq of the non-template control reaction:Standard curve characteristics (slope and y-intercept):How many replicates did you use to establish the standard curve?(xx replicates per standard concentration)What was the lower and the upper limit of the standard curve?PCR efficiency calculated from slope:Confidence interval for PCR efficiency or standard error:r2 of standard curve:Information on linear dynamic range:Cq variation at lower limit: Confidence intervals throughout range:Evidence for limit of detection:How many reactions per run were used for controls? (please specify positive and negative controls, controls without template and No RT controls, e.g. Positive controls: 3 reactions in 5 replicates per 96 well plate)Data analysis:Vendor software: Which software type, version and algorithm provided by the PCR machine supplier was used to analyze the data?Specialist software: Which (if any) additional software was used? Self-developed algorithms,or other (please specify)Normalisation: Which reference gene(s) were used to calculate the relative expression of the studied genes?What was the reason for choosing these particular genes?Which algorithm (e.g., geNorm, bestkeeper, normfinder) was used to normalize for reference gene(s)Which principle was used for Cq calling?What was the number and of biological replicates used?How was their concordance?How many technical replicates were used, and at which step (RT or qPCR)? What was the observed repeatability (intra-assay variation)?What was the observed reproducibility (inter-assay variation, %CV)The MIQE guidelines empower results that truly matter. And so does Roche.Visit to discover all the materials you need for truly remarkable research results.* modified based on the list in the original MIQE guidelines publication with permission of the MIQE authors.For life science research only. Not for use in diagnostic procedures. LIGHTCYCLER and FASTSTART are trademarks of Roche.All other product names and trademarks are the property of their respective owners. NOTICE: This product may be subject to certain use restrictions. Before using this product, please refer to the Online Technical Support page () and search under the product number or the product name, whether this product is subject to a license disclaimer containing use restrictions.Published byRoche Diagnostics GmbH Sandhofer Straße 116 68305 Mannheim Germany© 2013 Roche Diagnostics. All rights reserved.*********** 1012。
碧云天RNAeasy动物RNA抽提试剂盒说明书
碧云天生物技术/Beyotime Biotechnology 订货热线: 400-1683301或800-8283301 订货e-mail :****************** 技术咨询: ***************** 网址: 碧云天网站 微信公众号RNAeasy ™动物RNA 抽提试剂盒(离心柱式)(试用装)产品简介：碧云天的离心柱式RNAeasy ™动物RNA 抽提试剂盒(RNAeasy ™ Animal RNA Isolation Kit with Spin Column)是一种基于离心柱法从动物组织或培养的动物细胞中安全、快速、便捷、稳定、高效、高质量地抽提长度大于200个核苷酸(nucleotide, nt)的RNA 的试剂盒。
抽提获得的大于200个核苷酸的RNA(也常被称为总RNA)可以用于各种常规用途。
本试剂盒抽提得到的RNA 可用于反转录、RT-PCR 、qPCR 、Northern 、点杂交(Dot Blot)、纯化mRNA 、体外翻译、RNase protection assay 、cDNA 克隆等下游实验；也可用于基因表达芯片分析(microarray)、高通量测序(high throughput sequencing)等对RNA 质量要求较高的情况。
碧云天的三款离心柱式及Trizol 法RNA 抽提试剂盒的主要特点和差异如下：动物组织或细胞中的RNA 按照长度可以分为长链RNA(long RNA)和小RNA(small RNA)，长链RNA 通常大于200nt ，而小RNA 通常小于200nt 。
长链RNA 按照是否编码蛋白或多肽可以分为长链非编码RNA(long noncoding RNA, lncRNA)和mRNA 。
小RNA 主要包括非编码的5.8S rRNA(ribosomal RNA)、5S rRNA 、tRNA(transfer RNA)、microRNA(miRNA)、siRNA(small interfering RNA)、piRNA(Piwi-associated small RNA)、tsRNA(tRNA-derived small RNA)、srRNA(small rDNA-derived RNA)等。
FOREGENE植物总RNA提取试剂盒说明书
Version Number:1.1Plant Total RNA Isolation Kit PlusCat.No.RE-05021/05024For total RNA purification from general plant samples containing high polysaccharide and polyphenol componentsFor research use only Store at room temperature目录产品介绍 (3)产品特点 (3)试剂盒应用 (4)RNA的应用 (4)RNA的储存 (4)产品质量控制 (4)试剂盒内容 (5)产品信息 (5)储存条件 (5)DNA-Cleaning Column特性 (6)RNA-Only Column特性 (6)RNA提取得率与纯度 (7)RNA完整性 (7)RNA洗脱回收效率 (8)注意事项 (9)操作前准备事项 (10)实验材料和设备 (10)自备试剂 (10)安全性 (10)操作指南 (11)样本选取和保存 (11)样本初始用量 (11)植物组织破碎 (12)RNA污染预防 (12)基因组DNA污染及清除 (12)操作步骤 (13)RNA浓度及纯度检测 (15)DNA污染及检测 (15)快速操作示意图 (16)问题分析指南 (17)该试剂盒采用本公司研制的离心柱和配方，可以从各种多糖多酚含量高的植物组织中高效率的提取得到高纯度高质量的总RNA。
提供DNA-Cleaning Column能轻松的让上清液和组织裂解物分离，去除样品中的DNA，操作简便、省时；RNA-Only Column 能高效的结合RNA，搭配独特的配方，可以同时处理大量样品。
全体系RNase-Free，使得提取的RNA无降解；Buffer PRW1、Buffer PRW2缓冲液洗涤体系，使得获得的RNA纯度极高。
产品特点◆全程常温(15-25°C)操作，无需冰浴和低温离心。
氯化锂沉淀rna原理
氯化锂沉淀rna原理一、引言RNA（核糖核酸）是生物体内一类重要的核酸分子，具有传递遗传信息、调控基因表达等重要功能。
为了研究RNA的结构和功能，科学家们开展了许多RNA的提取和纯化研究。
其中，氯化锂沉淀RNA是一种常用的方法之一。
二、氯化锂沉淀RNA的原理氯化锂沉淀RNA的原理是利用氯化锂与RNA中的磷酸根结合形成沉淀，从而将RNA分离出来。
具体步骤如下：1. 细胞破碎：将待提取的RNA的细胞破碎，使RNA释放到溶液中。
2. 细胞裂解液处理：加入细胞裂解液，使细胞内的蛋白质、DNA等杂质被裂解。
3. 加入氯化锂溶液：加入氯化锂溶液，使细胞裂解液中的RNA与氯化锂结合形成沉淀。
4. 沉淀处理：通过离心将沉淀与上清液分离开来。
5. 沉淀洗涤：利用乙醇洗涤沉淀，去除杂质。
6. RNA溶解：将沉淀中的RNA用适当的溶液进行溶解，得到纯化的RNA溶液。
三、实验操作1. 提取RNA的样品准备：准备待提取RNA的样品，可以是细菌、真核生物细胞等。
2. 细胞破碎：使用细胞破碎液将细胞破碎，使细胞内的RNA释放到溶液中。
3. 细胞裂解液处理：加入细胞裂解液，使细胞内的蛋白质、DNA等杂质被裂解。
4. 加入氯化锂溶液：根据实验所需的RNA浓度，加入适量的氯化锂溶液，使RNA与氯化锂结合形成沉淀。
5. 沉淀处理：将混合物进行离心，使沉淀与上清液分离开来。
6. 沉淀洗涤：用75%乙醇洗涤沉淀，去除杂质。
7. RNA溶解：用适当的溶液（如RNase-free水）将沉淀中的RNA 溶解，得到纯化的RNA溶液。
四、注意事项1. 实验操作时应注意严格遵守无菌操作规范，以保证RNA的纯度和完整性。
2. 实验过程中应避免RNase的污染，如需使用工具、试剂等，应先进行RNase去污处理。
3. 实验室中的仪器和试剂应保持干净，以避免杂质对RNA提取的干扰。
4. 操作过程中应注意个人安全，如需使用有毒试剂，应戴好防护手套和口罩。
五、总结氯化锂沉淀RNA是一种常用的RNA提取和纯化方法，其原理是利用氯化锂与RNA中的磷酸根结合形成沉淀。
Promega Total RNA 提取说明书
••••••••••••••••••••••••Spin Protocol1.Place 1175µl R N A L y s i s B u f f e r (R L A )(+ BME) in an autoclaved tube.2.Prepare sample for lysis.3.Immediately place sample into LL y s i s B u f f e r . Mix thoroughly by inversion.N o t e :Ensure proper ratio of Lysis Buffer to sample. See Table 1 of the standard protocol.*4.Add 3350µl R N A D i l u t i o n B u f f e r (RDA, blue). Mix by inverting 3–4 times. N o t e :Refer to the appropriate lysate preparation section in the Technical Manual #TM048 to determine whether the sample should be heated at 70°C for 3 minutes. 5.Centrifuge for 10 minutes. Transfer the cleared lysate to a fresh tube.6.Add 2200µl 95% e t h a n o l to cleared lysate and mix well (pipet). The Spin and Vacuum Protocols are identical up to this point.7.Transfer mixture to Spin Basket Assembly and centrifuge for 1 minute.Discard eluate.8.Add 6600µl of R R N A W a s h S o l u t i o n (R W A )(+ ethanol). Centrifuge for 1 minute and discard the eluate.9.Prepare D D N a s e i n c u b a t i o n m i x using the table below:S o l u t i o nV o l u m e×N u m b e r o f P r e p s= T o t a lYellow Core Buffer 40µl MnCl 2, 0.09M 5µl DNase I 5µlMix gently (pipet); do nn o t vortex. 10.Apply 550µl of DNase mix to membrane. Incubate at RT for 15 minutes. 11.Add 2200µl D N a s e S t o p S o l u t i o n (DSA) (+ ethanol)and centrifuge for 1 minute.12.Add 6600µl R N A W a s h S o l u t i o n (R W A );centrifuge for 1 minute. Empty.13.Add 2250µl R N A W a s h S o l u t i o n (R W A ); centrifuge for 2 minutes. Transfer Spin Basket to Elution Tube.14.Add 1100µl N u c l e a s e -F r e e W a t e r to membrane. Centrifuge for 1 minute to elute the RNA and store at –70°C.RT: room temperatureCentrifugation: 12,000–14,000 × g (at RT)*Additional protocol information is available in Technical Manual #TM048,available online at: ww w w .p r o m e g a .c o m ORDERING /TECHNICAL INFORMATION: • Phone 608-274-4330 or 800-356-9526 • Fax 608-277-2601Elute RNA.DNase Stop, centrifuge and wash 2X.DNase treat.Wash.Transferlysate to Spin Basket Assembly.Add EtOH to lysate.2859M A 02_0AVacuum ProtocolElute RNA.Assemble Spin Basket/Collection Tube.Wash, DNase treat.DNase Stop and wash 2X.Transfer lysate to Spin Basket Assembly.Add EtOH to lysate.2860M A 02_0APrinted in USA. Revised 3/09.••••••••••••••••••••••••••N o t e :For the Vacuum Protocol, follow Steps 1–6 of the Spin Protocol.7.Attach Vacuum Adapter with Luer-Lok ®fitting to one manifold port.Gently press SV RNA Spin Basket into adapter and transfer mixture toSpin Basket. Apply vacuum. NN o t e :Label Collection Tube and save for Step 13.8.Add 9900µl R N A W a s h S o l u t i o n (R W A ). Apply vacuum until solution has passed through. Stop vacuum source and open unused port to vent manifold. Release all vacuum pressure before continuing!9.Prepare D D N a s e i n c u b a t i o n m i x using the table below:S o l u t i o n V o l u m e × N u m b e r o f P r e p s = T o t a lYellow Core Buffer 40µl MnCl 2, 0.09M 5µl DNase I 5µlMix gently (pipet); do nn o t vortex. 10.Apply 550µl of DNase incubation mix to membrane. Incubate at RT for 15minutes.11.Add 2200µl D N a s e S t o p S o l u t i o n (DSA) (+ ethanol)to Spin Basket. Close open port and apply vacuum.12.Add 9900µl R N A W a s h S o l u t i o n (RWA).Repeat wash.13.Release vacuum pressure. Place Spin Basket in Collection Tube (from Step 7). Centrifuge Spin Basket/Collection Tube for 1 minute.14.Transfer Spin Basket to Elution Tube, add 1100µl N u c l e a s e -F r e e W a t e r and centrifuge for 1 minute. Store purified RNA at –70°C.RT: room temperatureCentrifugation: 12,000–14,000 × g (at RT)Additional protocol information is available in Technical Manual #TM048,available online at: ww w w .p r o m e g a .c o m ORDERING /TECHNICAL INFORMATION: • Phone 608-274-4330 or 800-356-9526 • Fax 608-277-2601。
第四讲-RNA Isolation & RT-PCR
DNA
α-bound mRNA pellet
Best methods for removing DNA contamination
DNase 1. degrade contaminating DNA with Dnase 2. disable / remove DNase
Steps to RT-PCR (RT-PCR的步骤） 的步骤） 的步骤
该探针具有发夹结构， 该探针具有发夹结构 ， 5′ 端标记报告荧光染料， 端标 端标记报告荧光染料 ， 3′端标 记淬灭染料。 记淬灭染料。
●
探针与靶序列杂交结合， 探针与靶序列杂交结合， 报告荧光染料与淬灭染料分离， 报告荧光染料与淬灭染料分离， 发出荧光。 发出荧光。
●
③ SYBR Green染料法 染料法
RT-PCR实验的结果分析 实验的结果分析
• 1）RNA质量 质量——关键 ） 质量 关键 • 浓度测定： 浓度测定：260/280: 1.8~2.0 • 电泳： 电泳：28S, 18S, 5S, 28S/18S, 1.2-1.5 • 2）cDNA合成 ） 合成
aaaaaaaaa ttttttttttttt ttttttttttttt ttttttttttttt ttttttttttttt ttttttttttttt
TNFα
GAPDH
RT-PCR验证 验证G-Rh2诱导 验证 诱导 TNFαmRNA表达上调 表达上调
2. Realtime RT-PCR
• PCR体系加入一种双色荧光标记的 体系加入一种双色荧光标记 体系加入一种双色荧光标记的 寡核苷酸探针，根据探针上荧光信 寡核苷酸探针，根据探针上荧光信 的变化，计算模板 模板DNA的含量。 的含量。 号的变化，计算模板 的含量 • 实时 实时PCR应用：用于基因 应用： 应用 用于基因DNA拷贝 拷贝 数和mRNA表达定量分析。 表达定量分析。 数和 表达定量分析
抽提流程中文详解-SV Total RNA Isolation System,promage
所有试剂用前均须充分混匀，所有tip均用RNA级在超净台内无菌操作（做分子生物学实验勿开风机），TotalRNA抽提流程—(SV Total RNA Isolation System,promage Cat# Z3100)细胞（1.5×103－5×106）或组织（<30mg）放入1.5mleppendorf中（总体积<1.2ml，Ep管DNA级消毒级即可）300g离心5’（室温）用冰浴、无菌PBS洗涤一次，300g离心5’,弃上清（倒）（用过火灭菌镊开盖）加入175μl Lysis buffer（冰浴的，（已加BME）悬空加，勿碰管壁）,充分vortex至变清为止,用力颠倒混匀后，用力甩（若组织标本至此步后样本可臵－80℃保存）2ml针筒抽吸4－5次（以打断DNA）（不同样本，换注射器）加入（悬空加，否则换tip）350μl Dilution buffer（蓝色）(用前混匀液体，敲盖让液体下去)颠倒混匀后于70℃水浴3’（不能超过3’，否则易降解；但也不能少于3’，否则总RNA释放不完全，导致得率下降——OD260值低以及重复性差）离心12000-14000g，室温10’吸取上清移至另一eppendorf（从此步起，必须RNA级）中（避免吸取沉淀，有时在液体顶层会有一层固形物，可用tip将其拨开后再吸取上清）加入200μl 95%乙醇（分装后臵－20℃，用RNA级Ep管保存），吸打4－5次，混匀将液体移入分离柱中离心12000－14000g 1’后，将下层漏出液（蓝色）弃去加入600μl Wash solution（混匀，敲）离心12000－14000g 1’后，将下层漏出液弃去加入（看好，直接加在膜上，勿加至壁上）冰浴的DNA酶体系（40μl buffer（黄色，4℃贮存，其实室温即可）+5μlMncl2+5μlDNase（0.2mlEp管分装，－20℃贮存，用前短时离心），（按顺序加，Dnase的融化始终在冰浴上进行，Mncl2和Dnase要分开放，临用前再混匀，轻轻吸打混匀，不要vortex）臵于室温（20—25℃）15’加入200μl Dnase stop solution离心12000－14000g 1’，弃去下层液加入600μl Wash solution离心12000－14000g 1’，弃去下层液加入250μl Wash solution离心12000－14000g 2’，弃去下层管及液体将新eppendorf（RNA级，试剂盒提供）管放于分离柱下，加入100μlRNasefree（－20℃贮存）水12000-14000g 2’a将溶解的RNA存于－80℃。
润基 外泌体 RNA 分离试剂盒 说明书
产品使用说明书外泌体RNA 分离试剂盒Exosome RNA Isolation KitCat.#辽宁润基生物科技有限公司Liaoning Rengen Biosciences Co.,Ltd.Version 2.001/01/2020EXORNA50C-1EXORNA30C-1目录保存和应用 (2)产品介绍 (3)试剂盒组成和说明 (3)操作方法 (4)相关产品信息 (6)常见问题 (7)技术支持 (8)保存与应用【保存条件】本试剂盒低温下运输，室温或2-8℃下保存至少一年（按照试剂盒不同成分分别保存），使用前请详细阅读说明书。
【应用范围】本产品只用于科学研究，不能用于临床诊断。
产品介绍外泌体（Exosome）是由不同细胞分泌的直径30-150nm的胞外膜性囊泡（Extracellular Vesicles，EVs）。
外泌体普遍存在于多种体液中，其内容物丰富，包括蛋白质、脂质和核酸等，在细胞间信息交流中发挥着重要作用，主要参与免疫抗原呈递，神经递质传递，脂类代谢及细胞信号转导等过程，并与多种疾病的发生、发展、治疗及预后密切相关。
研究表明，胞外膜性囊泡（包括外泌体）内容物中富含不同类型RNA（mRNA、microRNA、LncRNA、CircRNA等）。
microRNA（miRNA）在基因转录和转录后调节方面起重要作用，与疾病的发生、发展密切相关，因此，某些外泌体miRNA （exo-miRNA)可以作为疾病的新的治疗靶标和诊断生物标记物。
外泌体RNA分离试剂盒（Exosome RNA Isolation Kit）采用酚/胍盐方法提取已分离的外泌体中总RNA（含有miRNA），这里外泌体分离方法可以包括超速离心、化学沉淀、免疫捕获和分子大小排阻等，接下来采用核酸特异吸附柱（Spin Columns），可方便、快捷地纯化和洗脱外泌体RNA，可直接用于下游应用，如RT-qPCR，Northern blot，芯片表达谱，NGS测序等。
Affymetrix基因表达谱芯片操作指南(中文版)
7
地址：上海市张江高科技园区李冰路 151 号
电话：021-51320288 传真：021-51320266
杂交
终体积
体积 终浓度或量
91μl
30μl
1×
3μl 200μM each
1μl
10U
4μl
40U
1μl
2U
130μl
4
地址：上海市张江高科技园区李冰路 151 号
电话：021-51320288 传真：021-51320266
3. 混匀。稍微离心，16℃放置 2 小时。 4. 加 2μl 10U/μl T4 DNA 聚合酶。 5. 16℃放置 5 分钟。 6. 加 10μl 0.5M EDTA 终止反应。 7. 继续纯化 cDNA 步骤，或-20℃储存。
体积 4μl 2μl 1μl
c) 第一链合成 z 1-8 μg总RNA: 1 μL SuperScript II z 8.1-15 μg总RNA: 2 μL SuperScript II z 每1μg mRNA加1 μL SuperScript II. z 少于1μg mRNA 加1 μL SuperScript II. 在反应管中加入相应体积的 SuperScript II，混合均匀，42℃温浴 1 小时，反应结 束放置冰上至少 2 分钟。
反应试剂 T7-(d7)24 primer 50μM
RNA 稀释的 Poly-A Control
DEPC 水
体积(1-8 μg RNA) 2μl（100pmol）
1-8μg 2μl
到 12μl
体积(8.1-16 μgRNA) 2μl（100pmol） 8.1-16μg 2μl 到 11μl
3
invitrogen_Trizol提取中文说明书
TRIZOL® ReagentCat. No. 15596-026 Size: 100 mlStore at 2 to 8°C.警告：在与皮肤接触及吞咽有毒。
可导致烧伤。
与皮肤接触后，应立即用洗涤剂和大量水冲洗。
如感到身体不适，应就医（如需要，应出示本产品标签）。
本产品含有苯酚（108-95-2）和其他成分（NJTSRN 80100437-5000P）。
已经证明TRIZOL 在室温下可稳定保存12个月。
不过，我们建议在储存于2-8°C，以保证最佳性能。
描述：TRIzol试剂（美国专利号，5346994）是即用型细胞和组织总RNA提取试剂。
该试剂是一步法苯酚和异硫氰酸胍解决方案，是对Chomczynski和Sacchi开发的单步RNA提取法（1）的改善。
在匀质化或溶解样品中，TRIzol试剂可保持RNA的完整性，同时能破坏细胞及溶解细胞成分。
加入氯仿离心后，裂解液分离成水相和有机相。
RNA存在于水相。
水相转移后，RNA通过异丙醇沉淀回收。
移去水相后，样品中DNA和蛋白质可通过相继沉淀回收（2）。
用乙醇沉淀可从中间相得到DNA，加入异丙醇沉淀可从有机相得到蛋白质（2）。
与DNA的共纯化可能对不同样品得到的RNA的归一化有用。
此技术可完美应用于少量人类、动物、植物或细菌来源的组织（50-100毫克）和细胞（5×106），以及大量的组织（≥1 g）和细胞（>107）。
该TRIzol试剂方法简单，允许大量样本同时处理。
整个过程可在一小时内完成。
用TRIZOL提取总RNA可避免蛋白质和DNA 污染。
可用于Northern blot分析、斑点杂交、poly（A）+选择、体外翻译、RNA酶保护分析和分子克隆。
聚合酶链反应（PCR反应）中，当两条引物位于单个外显子时，推荐使用扩增级DNA酶I(Cat. No. 18068)处理分离出的RNA。
TRIzol试剂方便提取不同种类、不同分子大小的RNA。
从样品中同时分离DNA和RNA
鸡肝 鸡肾 鸡脾 鸡肺
0.1493 0.137
0.5159 0.4116 0.1934 0.2502 0.1208 0.1279
1.96 1.96 1.94 1.94
1.9 2.13 1.89
2.1
260/230
1.98 1.72 2.41 2.47 1.27 2.18 1.85 1.74
0.55 0.44 1.44 1.78
AllPure Fibrous DNA/RNA Kit 进行提取。提取后取 1ug 的总 RNA 用 1.0%琼脂糖凝胶电泳分析，取 5%基因组 DNA 用 0.8%琼脂糖 凝胶电泳析结果（结果如下）。由电泳图可知，使用试剂盒得到的
RNA 不降解，得到的 DNA 片段完整，无拖尾现象。Lambda DNA/Hind III Marker 表明，得一的 DNA 片段在 23KB 左右。
2.91 2.06 12.99 12.29 6.85 6.25
( Genomic DNA )
(Total RNA)
取纯化的 NaNodrop 2000 进行分析(结果以下)。Nanodrop
2000 的数据分析结果，使用该方法得到的 DNA 和 RNA 纯度高，
可适合于各种下游应用。
样品
浓度 µg/µl
样品类型 动物软组织和细胞 动物软组织和细胞 动物软组织和细胞
难裂解组织样品 石蜡包埋组织样品
植物样品 动物软组织和细胞 动物软组织和细胞
培养细胞
AllPure Kits 20 分钟
15 分钟，即用 30 分钟 50 分钟
安全，无毒 高,A260/280>1.9 高,A260/280=1.8
好，20-60kb 中
与 Trizol 的性能相比
RNA 提取试剂盒
RNA 提取试剂盒1、总RNA 提取试剂（TRI Reagent，RNA Isolation Reagent）TRI ® Reagent 是改进型的一步法细胞总RNA 纯化试剂。
它可以快速、经济、有效的提取人、动物、植物、酵母、细菌和病毒的总RNA。
也可以同时提取DNA 和蛋白质。
该产品含有硫氰酸胍和苯酚，能够有效溶解RNA，DNA 和蛋白质。
在加入氯仿并离心后，上层水相中含有RNA。
水相的RNA 经过沉淀和洗涤后几乎没有DNA 或者蛋白质污染，可以用于Northern blots、mRNA 纯化、体外翻译、RNA 酶保护分析、克隆或者PCR 等等。
该产品可以有效分离0.1-15 kb 长度单位内的RNA 分子，每毫升TRI® Reagent 可以提取5-10×106细胞、50-100mg 组织或者10 cm 2培养瓶表面的单层培养细胞。
完全移走水相的离心产物加入无水乙醇沉淀DNA，用柠檬酸钠乙醇溶液洗涤，溶解后可用于PCR、限制性酶切以及Southern blotting 等。
沉淀DNA 后的水相加入异丙醇沉淀蛋白质，用盐酸胍乙醇溶液洗涤，分离的蛋白质可用于Western blotting 等。
优点：1）可用于多种组织：人、动物、植物、酵母、细菌和病毒。
2）提取大量或者少量的组织细胞效果良好。
3）比传统的硫氰酸胍/氯化铯方法产率高。
4）1 ml 最多可以提取107细胞或者100 mg 组织。
货号名称适用范围产品规格价格T9424TRI Reagent组织，培养细胞，细胞团25ml, 100 ml, 200ml506，1590，2860T3809TRI ReagentBD全血，血浆，血清25ml, 100 ml, 200ml536，1699，2978T3934 TRI Reagent LS 细胞悬浮液，脑脊液，羊水25ml, 100 ml, 200ml938，2603，43362、哺乳动物细胞总RNA 提取试剂盒（GenElute TM Mammalian Total RNA Miniprep Kits）该试剂盒结合了硅质膜技术和离心柱技术，可以快速结合、洗涤、溶解获得高质量的细胞总RNA。
实验操作过程
总RNA的提取：总RNA提取试剂：TRI zol®LS Reagent total RNA isolation system (G IBCO BRL®)(可以使细胞破碎，释放RNA)。
方法：组织总RNA的提取。
1．剪取50-100mg组织，(用生理盐水冲洗或直接研磨)，在玻璃匀浆器中研磨后，加750µl的TRI zol®R eagent在玻璃匀浆器中快速匀浆(样品量不应超过用于匀浆的TRI zol®R eagent的10%)。
将液相转移至1.5ml eppendorf管内。
(匀浆至无颗粒均匀即可)。
2．在15-30℃(一般在室温20℃)孵育5分钟，使核酸蛋白完全降解，加入0.2ml氯仿(chloroform)，(每1ml TRI zol®R eagent加0.2ml氯仿，轻轻颠倒混匀。
置于15-30℃(一般在室温20℃)孵育2-15分钟(一般10分钟)。
3．在2-8℃(4℃为宜)小于12000g(一般11500g)离心15分钟，取上层水相于一新管中(一般水量约占所用TRI zol®R eagent量的60%)。
离心后，混合物分为红色(下层，降解液)；白色(中层，蛋白)和无色(上层，RNA液体相)。
4．每1mlTRI zol®R eagent处理样品加0.5ml异丙醇(isopropanol),混匀以沉淀RNA，先在15-30℃孵育2-15分钟(一般为10分钟)，通常置-20℃过夜，以使RNA充分沉淀，在2-8℃(4℃)11500g离心10分钟。
5．弃上清，用75%乙醇(用DEPC处理过的水配制，存放于4℃，用前放入-20℃备用)洗RNA沉淀一次或两次(第一次洗时直接倒掉，第二次洗时用枪尖轻轻吹打RNA沉淀)，每1mlTRI zol®R eagent处理样品加至少1ml75%乙醇轻轻吹打混匀，在2-8℃小于7500g(7400g)离心5分钟，以混匀样品，再以11500g离心10分钟，弃上清。
trizol的RNA提取方法
Phase separation1.从-80取出样品，室温孵育5分钟。
2.对每1ml的TRIzol试剂，加200ul的氯仿，安全地给试管盖盖子。
3.用手有力地shake试管大约15s。
4.在室温孵育2-3分钟5.在4℃下，离心样品以12000g的速度，15分钟主意：RNA主要是在上层的水相层6.把离心管倾斜45°的角度，移出水相层中的样品，用试管吸出。
避免吸出中间层和水相层的液体。
7.把吸出水相层的放到新的tube。
RNA Isolation Procedure当准备和处理RNA时，总是采取合适的预防措施便面RNAase的污染RNA precipitation1.加500ul的100%异丙醇于水相层（注意：每1ml的TRIzol试剂加500ul）。
2.在室温孵育10min3.在4℃离心10min，转速12000g ，在离心前，RNA经常是看不见的，离心后tube底部应该可以看白色沉淀。
RNA wash1.移出tube上清液，留下RNA白色沉淀。
2.加1ml的75%乙醇洗。
3.短暂地V ortex样品，接着在4℃下，7500g 离心五分钟，吸掉上清。
4.真空or 空气晾干水分约5-10min。
请不要真空离心晾干pellet（注意：请不要让RNA完全晾干，那样会降低pellet的溶解度，部分未溶解的RNA样品的A260/A280<1.6）RNA resuspension1.加DEPC水20-50ul溶解RNA。
2.55~60℃下水浴or 干浴10-15min3.继续下面的应用或者-80℃保存。
提rna有胶状沉淀不溶于水
提rna有胶状沉淀不溶于水概述RNA（核糖核酸）是一种在细胞内起着重要作用的生物大分子，它参与了基因表达、蛋白质合成等关键生物过程。
在实验室中，研究人员常常需要从细胞中提取RNA进行进一步的分析和研究。
然而，有时候在提取RNA的过程中会出现胶状沉淀不溶于水的情况，这给实验带来了困扰。
本文将详细探讨导致RNA沉淀不溶于水的可能原因，并介绍解决这个问题的方法。
可能原因1.污染：在提取RNA的过程中，可能会受到外源性污染物的干扰，例如DNA、蛋白质、盐等。
这些污染物可能会与RNA形成复合物或凝聚体，导致沉淀不溶于水。
2.离心速度不足：离心是提取RNA时常用的步骤之一。
如果离心速度不足或离心时间过短，无法完全沉淀下来的RNA可能会形成胶状沉淀。
3.RNA降解：RNA是一种相对不稳定的分子，容易在特定条件下被降解。
如果在提取过程中未能避免RNA的降解，降解产物可能会形成胶状沉淀。
4.样品处理不当：提取RNA前的样品处理过程也可能影响到RNA的提取效果。
例如，在细胞裂解时使用了过高浓度的溶液，或者未能彻底去除细胞碎片等杂质。
解决方法1.优化实验步骤：仔细检查并优化实验步骤，确保每个步骤都得到正确执行。
注意与污染物接触的时间和条件，避免引入外源性污染物。
2.使用RNase去除DNA污染：如果存在DNA污染导致胶状沉淀，可以使用RNase（核酸酶）来消化DNA。
将RNase加入提取样品中，在适当的温度和时间条件下进行消化，然后再进行沉淀。
3.增加离心速度和时间：如果离心速度和时间不足以使RNA完全沉淀下来，可以适当增加离心参数。
根据具体情况调整离心速度和时间，确保RNA能够充分沉淀。
4.使用RNase抑制剂：如果RNA降解导致胶状沉淀，可以在提取过程中加入RNase抑制剂。
RNase抑制剂可以有效地保护RNA免受降解的影响，提高RNA的提取效果。
5.优化样品处理方法：注意细胞裂解的条件和杂质去除步骤。
使用适当浓度的裂解缓冲液，并确保细胞碎片等杂质被完全去除。
Omega公司RNA提取试剂盒说明书
RNA-Solv Reagent®RNA Isolation SolventWARNING: This reagent is toxic if swallowed and in contact with skin. Causes burns. After contact with skin, wash immediately with copious amounts of mild detergent and water. If you feel sick, seek medical advice at once and Quote UN2821.Product No:R6830-00 (5 ml)R6830-01 (100 ml)R6830-02 (200 ml)Storage Conditions:RNA-Solv is stable for at least 24 months®when stored at 2°C-8°C and yields reproducible results.IntroductionRNA-Solv® Reagent is a reagent system for the isolation of total RNA from cells and tissues. The reagent, a single-phase solution consisting of phenol and guanidine isothiocyanate, is modification of the single-step RNA isolation method developed by Chomczynski and Sacchi (1).The sample is homogenized and lysed in RNA-Solv® Reagent which maintains the integrity of the RNA, while disrupting and denaturing endogenous RNases and other cellular components. Extraction of the lysate with chloroform further denatures proteins and separates the mixture into an organic and an aqueous phase. RNA remains exclusively in the aqueous phase, and is subsequently recovered by isopropanol.This method is suitable for small quantities of tissue (<100 mg) and cells (<5 X10), and large quantities of tissue ( up to1 g) and cells 6(<10 ), of human, animal, plant, or bacterial origin. The simplicity 8of the RNA-Solv® Reagent method allows simultaneous processing of a large number of samples. The entire procedure can be completed in one hour. Total RNA prepared in this manner can be used for Northern blot analysis, dot blot hybridization, poly(A) + selection, in vitro translation, RNase protection assay, and molecular cloning. For use in amplification by thermal cycling, treatment of the isolated RNA with RNase-free DNase I is recommended when the two amplimers lie within a single exon.Supplied By User•Chloroform (no isoamyl alcohol added)•Isopropyl alcohol•80% Ethanol (in DEPC-treated water)•RNase-free water•Tabletop centrifuge capable of 12,000 x g at room temperatureGeneral Notes Regarding RNase ContaminationWhenever working with RNA :•Always wear disposable gloves and change gloves frequently.•Use sterile, disposable plasticware and automatic pipettes reserved for RNA work to prevent cross-contamination with RNases.•In the presence of RNA-Solv® Reagent, RNA is protected from RNase contamination. Downstream sample handling requires that nondisposable glassware or plasticware be RNase-free.•Use only DECP-treated buffers. Add DEPC to a final concentration of 0.1%, incubate at 37C for 2 hours, andoautoclave at 121C. Do not add DEPC to Tris buffers. Suchobuffers must be prepared by using DECP-water.PrecautionUse only disposable polypropylene tubes for small samples and glass Corex tubes for larger samples. All tubes must be able to withstand 12,000 x g . Polystyrene tubes may crack with chloroform Before StartingA.Small Samples :To isolate RNA from very small samples (<106 cells or <10 mg tissue) perform homogenization (or lysis) of samples in 0.8 mL of RNA-Solv®, and add 1 mg RNase-free glycogen or yeast tRNA as carrier. This will improve yields obtained with precipitation.B.Difficult Animal Samples: Specimens containing large amounts of proteins, fat, polysaccharides or extracellular material such as muscles, fat tissue, and sperm, will require the following modification. After lysis/homogenization in RNA-Solv® Reagent, centrifuge at 12,000 x g for 10 minutes at room temperature to remove insoluble debris. Often a precipitate forms at the bottom of the tube, but with fatty tissue, a lipid layer will also form above the aqueous phase. The supernatant will contain the RNA and must be carefully transferred to a fresh 1.5 ml microfuge tube before proceeding.C. Interruption the procedure:Following lysis in RNA-Solv®Reagent and before addition of chloroform, samples can be stored at -70C for up to 3 months. In addition, once the RNA is oprecipitated in isopropanol, the pellet may be stored at -20C or -o70C for up to 1 year.oRNA-Solv Protocol for Total RNA Isolation®CAUTION: When working with RNA-Solv® Reagent use gloves and eye protection (safety goggles) and avoid contact with skin or clothing. Work in a chemical fume hood to avoid inhaling vapor. Unless otherwise noted, all steps are to be carried out at room temperature (20C-25C).o o1. Homogenization and lysis of samples: follow either method belowa) Tissue SamplesHomogenize tissue samples in 1 mL of RNA-Solv® Reagent per 50-100 mg of tissue using an appropriate mechanical homogenizer. Alternatively one can pulverize tissue in liquid nitrogen with mortar and pestle and transfer the powder to a clean 1.5 ml microcentrifuge tube. If ceramic mortar and pestle are not available, homogenize the sample in the microfuge tube using a disposable microtube pestle (Eppendorf, Cat No. 0030 120.973; VWR, Cat No. KT 749520-0000). The sample volume should not exceed 10% of the volume of RNA-Solv® Reagent used.b) Cells Grown in SuspensionPellet cells by centrifugation. Lyse cells in RNA-Solv® Reagent by repetitive pipetting. Use 1 mL of the reagent per 5-10 x 10of6 animal, plant or yeast cells, or per 1 x 10 bacterial cells. Washing8cells before addition of RNA-Solv® Reagent should be avoided as this increases the possibility of mRNA degradation and RNase contamination. For plant, fungal, and yeast cells mechanical or enzymatic homogenization may be required. Also, for plant, fungal, and yeast cells, we recommend the use of the E.Z.N.A.® Plant (R6627),Fungal (R6640), and Yeast (R6670) RNA Kits from Omega Bio-tek.c) Cells Grown in MonolayerLyse cells directly in a culture dish by adding 1 mL of RNA-Solv®Reagent to a 3.5 cm diameter dish, and passing the cell lysate several times through a blue pipette tip. The amount of RNA-Solv®Reagent added is based on the area of the culture dish (~1 mL per 10 cm ). An insufficient amount of RNA-Solv® Reagent may result2in contamination of the isolated RNA with DNA. Always use more RNA-Solv® Reagent if in the lysate is too viscous to aspirate with a pipette.2. Add 0.2 mL of chloroform per 1 mL of RNA-Solv® Reagent. Cap sample tubes securely and vortex vigorously for 15 seconds. Incubate on ice for 10 minutes. This step is critical - do not change it.3. Centrifuge the samples at no more than 12,000 x g for 15 minutes 4E C.The mixture separates into a lower phenol-chloroform phase, an interphase, and an upper aqueous phase. RNA remains entirely in the aqueous phase.4. Precipitation of RNA.Transfer no more than 80% of the aqueous phase to a fresh tube, and discard the lower organic phase. Precipitate the RNA from the aqueous phase by adding 500ìl of isopropyl alcohol per 1 mL of RNA-Solv® Reagent used for the initial homogenization. Incubate samples at room temperature 10 minutes and centrifuge at no more than 12,000 x g for 10 minutes also at room temperature.Carbohydrate-rich samples: Plant samples of high polysaccharide content or animal tissues rich in glycosaminoglycans (proteoglycans) require the following modified precipitation method for obtaining pure RNA. Prepare Buffer A ( 1.2 M sodium chloride, 800 mM sodium citrate). Following step 3, add to the aqueous phase 0.3 ml isopropanol followed by 0.3 ml Buffer A per 1 ml RNA Solv ® Reagent used in step 1. Vortex to mix and centrifuge at no more than 12,000 x g for 10 minutes at room temperature. This high salt precipitation will reduce co-purification of complex carbohydrates.5. Wash RNA pellet. Discard the supernatant and wash the RNA pellet once with 1 ml 80% ethanol. Mix the sample by vortexing and centrifuge at no more than 7,500 x g for 5 minutes at room temperature.6.Reconstitute RNA. Carefully aspirate and discard the ethanol and briefly AIR DRY the RNA pellet for 2-5 minutes at room temperature. Do not use centrifugal devices equipped with a vacuum source as over-drying will lead to difficulty in re-dissolving RNA in water. Dissolve RNA in RNase-free water - a 5 minute incubation at 60 °C may be required. RNA can also be reconstituted in 100% formamide (deionized) and stored at -70°C.RNA is now suitable for RNase protection, northern analysis and reverse transcriptase reactions. For isolation of poly(A)+ RNA an additional ethanol precipitation is required. Add 1/8 X volume of RNase-free 3M NaAc, pH 6.0 followed by 2.5 X volume absolute ethanol. Vortex to mix and incubate at room temperature for 5 minutes. Centrifuge at 12,000 x g for 10 min at room temperature and discard the supernatant. Wash the pellet as before and reconstitute in DECP-treated water.Determination of Yield and QualityUV spectrophotometric analysis of the purified RNA is required for obtaining yield. To do so, dilute the RNA in an appropriate volume of TE buffer, pH 8.0 (not water; RNA yields low Abs ratio values if dissolved in acidic buffers) and measure absorbance at 260 nm and at 280 nm. RNA Conc = 40 ìg/ml X Dilution factor X Abs 260 nmTypical Abs 260 nm/ 280 nm ratios of 1.7-1.9 are obtained with the protocol. Yields vary depending of type and amount of starting material, and on condition of storage prior to processing. For assessing the quality of RNA, we recommend you perform denaturing agarose gel electrophoresis to confirm the integrity of purified material. Invariably, the full spectrum of RNAs, including 4S and 5S species are purified with RNA-Solv® Reagent.Expected Yields per 1 mg tissue or 10 cells:6Liver and spleen, 5-10 ìgKidney, 2-5 ìgBrain, 1-2ìgEndothelial cells, 7-12 ìgFibroblasts, 6-8ìgTroubleshooting•Low RNA Yields: Incomplete lysis of samples in RNA Solv Reagent. RNA pellet not completelt dissolved in DEPC-water.pH of diluent used for spectrophotometric analysis is too low.•Degraded RNA: Tissues were not immediately processed or frozen. Inadequate storage of starting material prio to isolation. Inadequate storage of RNA (-5 to -20°C, instead of -60 to -70°C) Trypsin/EDTA was used in dislodging monolayer cells. Buffers or plasticwasre were not RNase-free.Formaldehyde used for denaturing agarose-gel electrophoresis had a pH below 3.0.•Low Abs260/Abs280 ratios: Sample was diluted in water rather than TE. Acidic pH lowers absorbance ratios. Use TE buffer as diluent for readings. Insufficient RNASolv Reagent was used for lysis of sample. Ice incubation in step 2 was not performed. The aqueous phase was contaminated with the phenolic phase.•DNA contamination of RNA: Too little RNASolv Reagent used for sample processing causing inadequate separation of DNA/nucleoprotein complexes from aqueous RNA. The aqueous phase was contaminated with the phenol phase.Technical Support:Omega Bio-tek, USA - call toll-free : 1 888 832 8896References:1. Chomczynski, P., and Sacchi, N. Anal. Biochem. 162, 156 (1987).2. Chomczynski, P. Biotechniques 15, 532 (1993).For laboratory research use only.CAUTION: Not for diagnostic use. The safety and efficacy ofthis product indiagnostic or other clinical uses has not been established.May,1999 (C). All rights reserved by Omega Bio-tek, Inc.RNA-Solv is a registered mark of Omega Bio-tek, Inc.。
【分享】RNA的免疫共沉淀分离及检测
【分享】RNA的免疫共沉淀分离及检测如何改善RNA提取质量1. 在收获组织及细胞死亡之后，应立即灭活内源的RNA酶，以防止RNA降解。
以下3个方法均可有效使内源RNA酶失活：（1）用含离液（如胍盐）的细胞裂解液收获样品，并立即匀浆。
（2）用液氮瞬间冻结样品。
值得特别注意的是：组织块必须保证足够小，在浸入液氮的瞬间就能冻结，以确保瞬间令RNA酶失活（3）立即将样品置于RNAlater? Tissue Collection：RNA Stabilization Solution中。
它是一种水相、无毒的收集试剂，能立即稳定并保护完整、未冻结的组织和细胞样品中的RNA。
关键要点是组织样品切片一定要够薄（<0.5 cm），这样RNAlater才能在RNase 破坏RNA之前迅速渗入组织块中。
2. 使用正确的细胞或组织储存条件在样品用液氮瞬间冻结之后，应该储存在-80°C，千万不能解冻。
即使是置于含有胍盐的裂解液中作匀浆前的短暂解冻，也会导致RNA 的降解和损失。
瞬间冻结的组织应该首先在超低温条件下先研磨成粉，然后置于裂解液中进行匀浆。
RNAlater使样品储存更为便利。
储存在RNAlater中的细胞或组织可在室温下稳定保存长达1个星期，在4°C可稳定保存长达1个月，或永久保存在-20°C。
3. 彻底匀浆样品细胞或组织的彻底匀浆对RNA提取来说，是一个很关键的步骤，它能够防止RNA的损失和降解。
匀浆的方法应根据细胞或组织的类型来选择。
大部分培养的细胞可以置于细胞裂解液中，通过简单的涡旋震荡来匀浆；而动物组织、植物组织、酵母和细菌则常常需要更加剧烈的方法。
比如说细菌的细胞壁，就需要酶消化来实现彻底的细胞裂解和RNA的最大回收。
4. 在RNA提取之前预处理样品裂解液对于某些样品来说，在匀浆之后，RNA提取之前，还需要一些额外的处理步骤。
对于脂肪含量高的组织，像脑组织和脂肪组织得到的裂解液，就需要通过氯仿抽提来去除脂类，从而提高RNA产量。
RNA的提取步骤
1、实验目的提取人体细胞的总RNA和mRNA。
2、本实验所需试剂1）、CNE-2细胞及培养细胞的一系列条件，2）、PBS缓冲液，TRIZOL试剂，3）、DEPC处理过的水、大、中、小Tip及1.5 ml EP管,4）、新的氯仿、异丙醇和乙醇，5）、mRNA分离试剂盒：Oligotex mRNA Mini Kit,Cat.no.:70022, QIAGEN。
6）、新配的电泳缓冲液，专跑RNA的琼脂糖（Agarose）。
3、实验流程3.1 细胞总RNA的提取1）、6孔板细胞（CNE-2）汇合度为90-100%时，取出无菌室，去其上清，用PBS洗两次后，每孔加TRIZOL试剂（Gibco公司）1 ml，摇匀，无菌罩内消化3-5分钟（观察：液体变粘稠，细胞脱壁）。
2）、将各孔内消化好的细胞裂解液吸到一DEPC处理过的1.5 ml EP管中，加新开的氯仿0.2 ml，轻摇15秒。
3）、室温静置2-3分钟后，12000 rpm，15 min，4℃，离心。
然后取上清无色水相（约0.6 ml）到EP管（DEPC处理过），加0.5 ml新开的异丙醇，室温下静置10分钟。
4）、12000 rpm，10分钟，4℃，离心。
观察总RNA在管底的白色沉淀，弃去上清（小心别丢了沉淀），75%乙醇1.0 ml洗涤（用DEPC水新配制）后，7500 rpm，5 min，4℃离心。
5）、去上清，点离，用小Tip吸干液体。
气干沉淀5-10分钟，DEPC处理水20-30 ul加入，中枪打匀，55-60℃水浴10分钟溶解总RNA，测OD值。
6）、电泳。
3.2 从总RNA中分离mRNA（Oligotex mRNA Mini Kit,Cat.no.:70022, QIAGEN）1）、取上述提取的总RNA若干（少于0.25 mg）到一个新的无RNase 的EP管中，用无RNase的水定容到250 ul。
2）、加入Buffer OBB 250 ul, Oligotex Suspension 15 ul。
AFFYMETRIX基因芯片操作流程
AFFYMETRIX基因芯片操作流程第一章真核靶片断制备<一> RNA的抽提一、哺乳动物细胞或组织RNA的抽提1.总RNA使用QIAGEN’s RNeasy Total RNA Isolation kit成功抽提哺乳动物细胞总RNA.哺乳动物组织作为RNA的来源，建议使用TRIzol抽提总RNA.2.Poly(A)+mRNA哺乳动物细胞使用QIAGEN’s Oligotex Direct mRNA kit,从总RNA中抽提mRNA .哺乳动物组织作为RNA的来源，应首先使用TRIzol纯化，再进行一个Poly(A)+mRNA分离步骤或使用kit.二、RNA沉淀1.总RNA在用RNeasy Total RNA Isolation kit分离或洗涤后没有必要沉淀总RNA.调整洗脱体积以制备cDNA合成接近希望的RNA浓度。
注：为获得足够量的标记cRNA用来评估和基因芯片表达探针杂交，AFFYMETRIX建议开始合成cDNA的Poly(A)+mRNA最小浓度为0.02μg/μl时的最小量是0.2μg, 总RNA最小浓度为0.5μg/μl时的最小量是5μg.这样有两个好处：（1）有足够量在各步检查样品浓度和质量（2）制备足够的cRNA用于杂交在TRIzol分离和热酚提取后需要乙醇沉淀；见下面方法.2. Poly(A)+mRNA大多数Poly(A)+mRNA分离过程都会导致得到较稀浓的RNA，所以需要在cDNA合成前浓缩mRNA.3.沉淀步骤：（1）加1/10体积3M NaOAc,PH5.2,和2.5倍体积乙醇.（2）混匀，-20℃放置最少1小时.（3）4℃,≥12000x g离心20分钟.（4）80%乙醇洗涤沉淀2次.（5）空气干燥沉淀.继续下面步骤前检查是否干燥.（6）DEPC处理水重新溶解沉淀.最合适的溶解体积由cDNA合成中需要的RNA的浓度和量来决定.先阅读cDNA合成的过程来决定这一步的适合溶解体积.4.RNA测定用分光光度计分析RNA浓度，在260nm 1单位吸光度等于40μg/mlRNA.●需要在260和280nm测定吸光度来确定样品的浓度和纯度●A260/A280应接近2.0为较纯的RNA(比值在1.9-2.1也可)<二>由纯化的总RNA合成双链cDNAAFFYMETRIX强烈建议HPLC纯化T7-(d7)24 primer一、第一链cDNA合成开始RNA的量:高质量RNA5.0μg -40.0μg纯化后RNA浓缩由260nm吸光度决定（1单位吸光度=40μg/mlRNA），A260/A280应接近2.0，在1.8-2.1的范围内。