我国人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息学分析培训课件

DNAstar MegAlign 软件分析3 株病毒糖蛋
白的同源性，AntheProt 5. 0 及DNAstar
Protean 软件分析3 株病毒糖蛋白的结构及
潜在B 细胞抗原表位的差异。
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• 狂犬病是由狂犬病病毒（Rabies virus，RV） 引起的人兽共患疾病，一旦发病，几乎100 ％死亡，疫苗接种是预防该病的重要措施。
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图1 4aGV、CTN-1V、PV2061 株病毒糖蛋白基因扩增产 物电泳图
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2. 2 4aGV、CTN-1V、PV2061 株病毒糖蛋 白基因序列同源性分析
• 4aGV、CTN-1V 和PV2061 株病毒糖蛋白测序结
应用DNAstar 中的MegAlign 软件分析3 株病
毒糖蛋白基因序列及氨基酸序列的同源性；应用
AntheProt 5. 0 及DNAstar 中的Protean 软件分析 3株病毒糖蛋白的结构及潜在B 细胞抗原表位的差
异。
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2. 结果
• 2. 1 病毒G 区基因扩增产物的鉴定 • 应用配对引物分别扩增4aGV、CTN-1V 和PV2061 • 株病毒G 区基因，扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分 • 析，均可见约2 300 bp 的特异条带，大小与预期相符； • 应用3 对引物分别扩增4aGV、CTN-1V 和PV2061 • 株病毒G 区基因，仅配对引物扩增出相应条带。尽 • 管应用aG-MGL-F ／ R 引物对PV2061 株病毒G 区 • 基因进行扩增时有条带出现，但该条带大小及扩增 • 产物浓度均与目的片段明显不符，为非特异性扩增。 • 因此3 对引物均具有特异性，与其他毒株无特异性 • 配对。见图1。
氨基酸序列的同源性分析表明，3株病毒糖蛋白均
由524 个氨基酸我组国人成用狂犬，病疫同苗株源病毒糖性蛋白为生物90.
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• 1. 3 引物设计及合成
根据GenBank 中登录 的aG、CTN、PV 株 病毒M、L 区基因序列 ，应用Primer Premier5. 0 软件设计 位于M 区及L 区的上 下游引物，见表1。
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1. 4 病毒G 区基因的扩增
用QIAamp Viral RNA Mini Kit 提取病毒RNA， Reverse Transcription System 提供的随机引物 逆转录 合成cDNA 第一链，再以其为模板，PCR 扩增目 的基因。 反应体系为：c DNA 2 μl，10 × buffer 5 μl， 2. 5 mmol ／ L dNTP 4 μl，上下游引物各2 μl（10 pmol ／ L），LA Taq 1 μl，去离子水补足体积至 50 μl。反应条件为：95℃预变性5 min；95℃ 30 s，53℃ 30 s，72℃ 2 min，共30个循环；72℃ 再延伸10 min。扩增产物经1％琼脂糖 凝胶电泳鉴定，EZNA誖Gel Extraction Kit 纯化回 收。
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• 1. 5 克隆测序
将PCR 纯化产物与pGEM-T vector 连接，转化
感受态大肠杆菌DH5α，蓝白斑筛选阳性克隆，经 菌落PCR 鉴定后，送北京三博远志生物技术有限 公司测序，每个片段至少送6 个阳性克隆。
• 1. 6 病毒糖蛋白生物信息学分析
目前，我国人用狂犬病疫苗生产用毒株主 要有aG、CTN-1V 和PV2061 株，其中aG 株和CTN-1V 株为我国自行分离并传代适应， PV2061 株来源于法国巴斯德株。上述病毒 株生产的人用狂犬病疫苗经临床应用显示， 具有良好的保护效果。
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我国人用狂犬病疫苗生产用原始种子
1. 2 主要试剂 QIAamp Viral RNA Mini Kit Reverse Transcription System TaKaRa LA Taq誖DRR002A EZNA誖Gel Extraction Kit pGEM-T vector system
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我国人用狂犬病疫苗 株病毒糖蛋白生物信
息学分析
【摘要】
• 目的 测定我国人用狂犬病疫苗株4aGV、 CTN-1V 和PV2061 株病毒糖蛋白G 基因序 列，并对其进行生物信息学分析。
• 方法RT-PCR 扩增3 株病毒糖蛋白G 基因，
分别克隆至pGEM-T 载体中，转化大肠杆
菌DH5α，筛选阳性克隆，进行测序。应用
果已提交到GenBank，登录号分别为JN234411、
JN234418 和JN234424。测序结果表明，3 株病
毒均为基因Ⅰ型狂犬病病毒；其基因组M-G 区间
序列长度均为5 bp，CTN-1V 株M-G 区间序列为
CTTTT，4aGV 与PV2061 株为CTATT；3 株病
毒G 区全序列均具有5′端AACA 和3′端polyA 尾结
构，其中CTN-1V、4aGV 株G 区基因长度为2
067 bp，PV2061 株为1 675 bp，基因同源性为
76. 0％ ～ 88. 4％；3 株病毒G 区ORF 基因均为
1 575 bp，基因同源性为84. 4％ ～91. 5％；
CTN-1V、4aGV 株G-L 区间序列长度为24 bp，
PV2061 株为423 bp。对推导的3 株病毒糖蛋白
4aGV、CTN-1V、PV2061 株病毒 糖蛋白（Glycoprotein，G）全基 因序列进行测定，分析3 株病毒糖 蛋白氨基酸序列的同源性
我国人用狂犬病疫苗株 1 菌毒株 狂犬病病毒原始种子批4aGV、
CTN-1V 和PV2061均由中国食 品药品检定研究院病毒一室保 存；感受态大肠杆菌DH5α。