牡丹种子中分离的两种新型茋类物质顺式和反式suffruticosol D的体外抗肿瘤作用-翻译

International Journal of Oncology, 2015, IF=3.018In vitro antitumor effects of two novel oligostilbenes, cis- and trans-suffruticosol D, isolated from Paeonia suffruticosa seeds 从牡丹种子中分离的两种新型茋类物质:顺式和反式suffruticosol D的体外抗肿瘤作用Nadin Marwan Almosnid, Ying Gao, Chunnian He, Hyo Sim Park and Elliot Altman摘要：天然衍生的茋类成分已被证明具有细胞毒性，有抗类固醇、抗诱变、抗氧化、抗炎、抗肿瘤的生物活性。

之前的植物化学研究表明牡丹的种子富含天然茋。

本研究证明了从牡丹种子中分离的茋类成分：顺式和反式suffruticosol D的抗肿瘤作用，并检验了作用机制。

顺式和反式suffruticosol D表现出对人类肿瘤细胞系A549（肺）、BT20（乳腺）、MCF-7（乳腺）和U2OS（骨肉瘤）显著的细胞毒性，但对正常人类细胞系HMEC（乳腺）和HPL1A（肺）表现出显著较低的毒性。

我们还发现，顺式和反式suffruticosol D通过激发氧化应激，促进细胞凋亡，降低线粒体膜电位，抑制细胞运动性，并且阻断人肺癌细胞中的NF-κB途径发挥其抗肿瘤作用。

此外，我们评估了各自的生物效力，发现反式suffruticosol D比顺式suffruticosol D更有效。

总的来说我们的结果表明顺式和反式suffruticosol D可能是对癌症更有希望的化疗剂。

引言目前的癌症药物昂贵，且往往造成严重的副作用。

美国国家癌症研究所开始在20世纪60年代开始研究抗肿瘤植物提取物，前提是从治疗植物中获得的天然化合物可能产生抗癌药物，从此以后一直有很大的研究兴趣。

中药（TCMs）用晒干的植物或植物提取物为年的实验和临床研究提供了低成本的，成千上万的饮食和药物治疗已证明，中药中使用的超过400种植物对于各种癌症的预防或治疗是有效的抗癌药物（1-4）。

然而，为确定中药中单体化合物的有效性，仍有许多工作要做。

牡丹，是芍药属中一种广泛应用的药用植物。

本属包括大约35种，分为三组：北美芍药组，芍药组，和牡丹组（5）。

中国药典已经记录了牡丹根（根皮）作为重要的中药来源（6）。

牡丹提取物具有细胞毒性、抗肿瘤、抗炎和抗氧化活性（5）。

之前对牡丹的光化学研究确定了超过260种生物活性化合物，包括酚类、单萜酰葡萄糖苷、芍药醇、类黄酮、单宁、类固醇、三萜类化合物和茋类化合物（7）。

最近的一项研究表明，牡丹的种子含有与其他化合物相比的大量茋类物质（7,8）。

茋类物质是一类植物中广泛存在的1，2二苯基乙烯核多酚（9）。

由于其抗肿瘤、抗类固醇、抗诱变、抗氧化、抗疟疾和抗炎生物活性，茋类化合物引起了极大的兴趣（10-16）。

茋类物中一个熟知的例子是白藜芦醇，并且其抗肿瘤活性已被深入研究。

几个体内和体外研究表明，白藜芦醇抑制癌细胞的生长和与影响癌症发展有关的各种分子靶点，如Wnt信号通路，核因子κB（NF-κB）和MAPK / ERK通路在不同类型的癌症（17,18）。

首先，两个新的茋类物质顺式和反式suffruticosol D是从牡丹种子中提取的（5）。

这两种化学物质具有类似的结构，因为反式suffruticosol D的质量碎裂模式非常类似于顺式suffruticosol D，顺式suffruticosol D与反式suffruticosol D仅是烯烃氢信号不同（图1）。

本研究中，我们研究了顺式和反式suffruticosol D的抗肿瘤活性，并研究这两种化学物作用于体外癌细胞的机制。

一、材料和方法：1.化合物分离：牡丹的种子在中国安徽的铜陵收集，并确定在2012年9月一个凭证标本（2012001）已存入种子资源库在药用植物研究所，中国医学科学院和北京联合医学院。

如先前所描述的顺式和反式suffruticosol D的从牡丹干种子中萃取和分离（5）。

将化合物以10mM （mmol/L）的浓度回溶于二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich公司，美国密苏里州，圣路易斯）中并4℃下冷藏。

2.细胞培养：包括A549（肺癌），BT20（雌激素受体阴性人乳腺癌），MCF-7（雌激素受体阳性人乳腺癌）和U2OS（人骨肉瘤）的四种人癌细胞系购自美国典型培养物保藏中心（美国维吉尼亚州，马纳萨斯）。

稳定表达绿色荧光蛋白（GFP）的A549细胞系购自Cell BioLabs公司（圣地亚哥，美国加利福尼亚州）。

A549、A549-GFP和BT20细胞在RPMI-1640培养基（Sigma-Aldrich）中培养，MCF-7细胞在DMEM培养基（ATCC）中培养，U20S细胞在McCoy's 5A培养基（ATCC）中培养。

作为对照，从名古屋大学获得HPL1A细胞（人外周肺上皮细胞），并在DMEM/F12培养基（Sigma-Aldrich）中培养; HMEC细胞（原代人乳腺乳腺上皮细胞）购自ATCC并在McCoy's 5A培养基中培养。

从日本名古屋大学获得HPL1A细胞（原代人外周肺上皮细胞），在DMEM/F-12K培养基（Sigma-Aldrich）中培养。

所有培养基含有10％FBS（Sigma Aldrich）和1％链霉素和青霉素（Sigma-Aldrich）。

将这些细胞在37℃、5％CO2的潮湿环境中培养。

3.细胞增殖测定：使用刃天青还原试剂AlamarBlue（Invitrogen公司，美国马里兰州，弗雷德里克）评价化合物的细胞毒性。

将细胞以每孔5×103个细胞的密度接种在含有100μl培养基的96孔微量培养板中，预处理16小时。

接下来，用含有320、100、32、10、3.2、1.0和0.32μM七种不同浓度的顺式或反式suffruticosol D的培养基代替之前的培养基。

用1％DMSO作载体对照。

将细胞置于37℃的培养箱中48小时。

用含有仅用载体处理过的细胞的培养基作阴性对照。

随后，将AlamarBlue溶液加入到培养基中，并将细胞在CO2培养箱中恒温培育1小时。

使用酶标仪（Molecular Devices公司，美国加利福尼亚州，Sunnyvale）在Ex 555nm和Em 590nm处测量染料的荧光强度变化。

使用GraphPad Prism软件（GraphPad Software公司，美国加利福尼亚州，La Jolla）通过IC50测定抑制细胞生长50％的浓度来测定细胞毒性。

对于N-乙酰基-L-半胱氨酸（NAC）衰减测定，用不同浓度的顺式或反式suffruticosol D处理细胞培养48小时后（可加10mM NAC（Sigma-Aldrich）），使用AlamarBlue测定法评估细胞存活力。

4.细胞凋亡检测：根据制造商的说明书，使用FlowCellect Annexin Red试剂盒（EMD Millipore公司，美国麻萨诸塞，Billerica）测定A549细胞中的凋亡率。

将A549细胞接种在96孔板中。

用100、32和10μM浓度的顺式或反式suffruticosol D处理24小时后，收集浮动和附着的细胞用于分析。

将细胞在700xg的离心力下离心7分钟，并回溶于100μl缓冲液（EMD Millipore）。

然后，细胞用膜联蛋白染色15分钟，用7-氨基-放线菌素D（7-AAD）染色5分钟，用Guava EasyCyte流式细胞仪（EMD Millipore）检测。

用Guava InCyte软件分析数据。

5.凋亡抗体阵列：根据制造商的说明书，使用人细胞凋亡抗体阵列试剂盒（RayBiotech，Inc.，美国加利福尼亚，Norcross）评估凋亡蛋白表达。

将A549细胞以每孔8,000个细胞的强度接种在96孔板中，然后用50μM浓度的顺式或反式suffruticosol D处理6小时。

将细胞在含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液中裂解。

使用蛋白质浓缩柱（EMD Millipore）将细胞裂解物浓缩至总蛋白质浓度为2mg/ml。

然后将样品用缓冲液稀释10倍，并在阵列膜上在室温下恒温培养2小时，并用洗涤缓冲液洗涤5次。

随后将与生物素结合的抗体混合物的混合物加入膜中并在4℃培养过夜。

然后将样品与HRP结合的链霉亲和素在室温下培养2小时，并使用化学发光底物检测信号。

使用Image Studio软件（LI-COR Biotechnology，美国内布拉斯加州，Lincoln）定量每个阵列点的强度，然后归一化为内部对照。

6.氧化应激测定：使用Hitkit氧化应激试剂盒（Thermo Scientific，美国MA，Waltham）测定活性氧（ROS）的产生。

简言之，将A549细胞用顺式或反式suffruticosol D处理24小时，用温的37％甲醛固定，并用Hoechst和二氢乙锭（DHE）染料在37℃、5％CO 2下染色30分钟。

将1μM浓度的阿霉素（DOX）用作阳性对照，将仅用媒介物处理的细胞用作阴性对照。

细胞核中的ROS（活性氧）生成通过产生溴化乙锭荧光来指示，并且通过使用ArrayScan VTI Highcontent筛选（HCS）读数器（Thermo Scientific）测量核荧光强度来评估。

获取图像，并通过vHCS扫描软件分析数据。

7.细胞运动性测定：以如下方法用蓝色荧光珠（Life Technologies，美国OR，Eugene）涂覆96孔胶原板（Corning，美国NY，Corning）。

将珠子以14000g离心1分钟，用PBS洗涤两次，然后将75μl珠子嵌入96孔胶原板的每个孔中，并在37℃下培养1小时。

在含有10％FBS的培养基中用不同浓度的顺式或反式suffruticosol D处理细胞18小时之后。

用PBS洗涤板5次，将A549-GFP细胞以500个细胞/孔接种在包被的板中，并在37℃温育1小时。

用无血清培养基处理的细胞用作阴性对照，用含有10％FBS的培养基处理的细胞用作阳性对照。

使用Arrayscan VTI HCS读数器（Thermo Scientific）对细胞轨道成像，并且通过vHCS扫描软件分析数据。

计算测试化合物和对照的每个细胞的完整轨迹面积的平均值。

8.多参数细胞毒性试验：使用HCS分析来测量核形态，细胞膜的通透性，以及线粒体膜电位变化，细胞毒性相关联的三个参数。

A549细胞以不同浓度的顺式或反式suffruticosol D24处理小时。