基因工程知识要点

第一章1.基因工程:是在分子水平上进行的遗传操作，指将一种或多种生物体（供体）的基因或基因组提取出来，或者人工合成的基因，按照人们的愿望进行严密的设计，经过体外加工重组，转移到另一种生物体（受体）的细胞内，使之能在受体细胞遗传并获得新的遗传性状的技术。

2.基因工程的基本过程为哪些？切—接—转—增—检①获得目的基因：从供体细胞分离出基因组DNA，用内切酶将外源DNA切开。

——切（同时选择运载目的基因的载体）②目的基因与载体DNA拼接：用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片段接到载体分子上，形成DNA重组分子。

——接③重组体分子导入受体细胞：借助于细胞转化手段将DNA重组分子导入受体细胞中。

——转④短时间培养转化细胞，以扩增DNA重组分子或使其整合到受体细胞的基因组中。

——增⑤筛选和鉴定转化细胞，获得使外源基因高效稳定表达的基因工程菌或细胞。

——检3.哪些基因是真核生物特有的？①假基因：核苷酸序列同其相应的正常功能基因基本相同，但却不能合成出功能蛋白质的失活基因。

②基因家族：由功能相关的基因成套组合形成③重复序列哪些是原核生物特有的：插入序列。

哪些是真核和原核共有的：移动基因、重叠基因第二章1.寄主细胞控制的限制与修饰宿主控制限制——核酸限制性内切酶宿主控制修饰——修饰的甲基转移酶以λ(k)噬菌体侵染E.coli B菌株为例解释寄主控制与修饰的现象。

（简述寄主控制的限制与修饰现象。

❖大多数细菌的噬菌体侵染都存在着一些功能性障碍。

所谓的寄主控制的限制与修饰现象简称（R/M体系）。

R/M体系：寄主是由两种酶活性配合完成的一种是修饰的甲基转移酶——修饰另一种是核酸内切限制酶——限制R/M体系的作用：❖保护自身的DNA不受限制；❖破坏外源DNA使之迅速降解；2. 简述Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型核酸内切酶的基本特性。

（1）Ⅰ型酶基本特性①有内切酶活性和甲基化酶活性——互斥②需要ATP、SAM（S—腺苷甲硫氨酸）和Mg 2+辅助因子；③EcoB和EcoK是由三种不同亚基组成。

γ多肽链：特异性亚基，识别DNA序列的活性。

β多肽链：修饰亚基，具有甲基化酶活性。

α多肽链：限制亚基：具有核酸内切酶活性④有特定的识别位点⑤切割方式：结合在识别位点，以滚环形式沿着DNA分子转位，从距识别位点5 ’一侧几千bp处随机切割分子，无特异性。

（2）Ⅱ型酶：①有内切酶活性和甲基化酶活性——分开反应②能识别专一的核苷酸序列，并在固定位置上切割③识别序列的核苷酸对顺序呈回文结构（那项具有回文结构：识别位点的DNA序列呈双重旋转对称）④切割可形成两种核苷酸切割末端————粘性末端和平末端。

粘性末端定义：指DNA分子在限制酶作用下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，能通过互补碱基间配对而重新环化起来。

（3）Ⅲ型酶：①由两个亚基组成的蛋白质复合物，即同时具有内切酶活性和甲基化酶活性②需Mg 2+、ATP、SAM辅助因子③可识别特定碱基顺序，并在这一顺序的3’端24 ～26bp 处切开ＤＮＡ，所以它的切割位点也是没有特异性的4. 同尾酶：指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘性末端的核酸内切酶。

利用同尾酶可使切割位点的选择余地更大。

同裂酶：指来源不同但识别相同靶序列的核酸内切酶。

同裂酶进行同样的切割，产生同样的末端。

但有些同裂酶对甲基化位点的敏感性不同。

星号活性：同一限制酶当某些反应条件变化时酶的专一性发生改变，即酶切位点专一性改变的活性。

包装上标“＊”注明。

5.DNA缺口平移、取代反应的概念DNA缺口平移：在DNA分子的单链缺口上，DNA聚合酶Ⅰ的5’→3’核酸外切酶活性和聚合作用可以同时发生。

（概念：当外切酶活性从缺口的5’一侧移去一个5’核苷酸之后，聚合酶作用就会在缺口的3’一侧补上一个新的核苷酸，但PolⅠ不能在3’-OH和5’-P之间形成一个键，随着5’一侧的核苷酸不断移去，3’一侧的核苷酸又按序列增补，缺口便沿着DNA分子合成的方向移动。

）②用途：通过DNA缺口转移，制备供核酸分子杂交用的带放射性标记的DNA探针。

取代反应：如果在反应混合物中仅存在一种dNTP，则此酶的3’→5’的外切酶活性将从ds DNA的3’端降解，直到互补于该dNTP的碱基出现为止，然后在该位置发生合成和取代反应。

6.各DNA聚合酶的基本特性及其区别；（1）大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ（PolⅠ）的酶活性①5’→3’的聚合酶活性：需Mg2+②5’→3’的外切酶活性：可以从游离的5’-OH末端水解DNA分子(修复作用)③3’→5’的外切酶活性（较低）：从DNA链的3’-OH末端向5’水解DNA(校对作用)用途：主要功能参与DNA的合成，起到修复作用；PolⅠ同DNA分子克隆的关系最为密切。

（2）PolⅠ的Klenow片断①5’→3’的聚合酶活性；②3’→5’的外切酶活性③无5’→3’外切酶活性。

Klenow片断的主要用途：①修补经限制酶消化的DNA所形成的3’隐蔽末端；②标记DNA片断的末端；③cDNA克隆中的第二条链c DNA的合成；④DNA序列的测定。

（3）PolⅡ（参与DNA修复过程）酶活性：①5’→3’的聚合酶活性：要求模板是双链DNA，中间有空隙的单链DNA部分，且空隙部分不长于100 bp；②具有3’→5’的外切酶活性，无5’→3’外切酶活性；③主要在DNA的损伤修复中有一定的作用（4）Pol Ⅲ①聚合作用：是细胞内DNA复制所必需的；②3’→5’的外切酶活性，底物是单链DNA；③5’→3’外切酶活性，底物是单链DNA。

（5）T4 DNA聚合酶①5’→3’的聚合酶活性；②3’→5’的外切酶活性；③无5’→3’外切酶活性；④取代反应:在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止；（6）T7 DNA聚合酶①5’→3’的聚合酶活性；②3’→5’的外切酶活性（是klenow片段的1000倍）；③无5’→3’外切酶活性；（7）耐热DNA聚合酶（T aq DNA聚合酶）（选择题）①具耐高温的特性，最适活性温度为72℃，连续保温30min仍有活性，一次加酶即可满足PCR反应全过程的需求；②Mg 2+依赖酶；③具有聚合酶活性；④具有5’→3’ 外切酶活性，无3’→5’ 外切酶活性⑤SDS完全抑制其酶活性。

（8）反转录酶依赖RNA的DNA的聚合酶。

α多肽链——具有反转录酶活性和RNase H活性；β多肽链——具有以RNA-DNA杂交分子为底物的5’→3’脱氧核酸外切酶活性。

以mRNA为模板合成cDNA；在反转录酶作用下，水解掉RNA链，再以cDNA为模板合成第二条cDNA。

7.连接酶所需的条件——供能分子、磷酸基团和羟基。

概念：能够催化两条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶。

即能够将DNA链上彼此相邻的3’-羟基（OH ）和5’-磷酸基团（-P），在供能分子的作用下，形成磷酸二酯键。

需要三种成分参与：3’-OH，5’-P，提供能量的分子供能分子：NAD+（烟酰胺腺嘌呤二核酸）——在E.coli等细菌中选用ATP（腺苷三磷酸）——动物细胞、噬菌体中选用注：①只能连接缺口（nick）；②不能连接裂口（gap）；③而且被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分。

8.缺口：在双链DNA的某一条链上两个相邻核苷酸之间失去磷酸二酯键所出现的单链断裂。

裂口：在双链DNA的某一条链上失去一个或数个核苷酸所形成的单链断裂。

9、碱性磷酸酶：将DNA末端的5’端磷酸基除去，使其5’端变成3羟基，能防止自身环化。

（1）去除DNA和RNA的5”--磷酸基，然后在T4多聚核苷酸激酶催化下，用[γ—32P]ATP 作用：进行末端标记，继而进行序列分析。

（2）去除载体DNA5”--磷酸基，防止自身环化，降低本底，提高重组DNA检出率。

发夹结构：10、末端转移酶特性：①催花dNTP添加到3’-OH端，且不需模板；②需Co 2+。

用途：①给载体或cDNA加上互补的同聚尾；②标记3’末端。

第三章1、基因载体：离开染色体的外源DNA不能复制，而插入的外源DNA可作为复制子的一部分在受体细胞中进行复制，这种复制子就是外源基因的载体。

2、报告基因：有特殊意义的基因，重组子转入宿主细胞中，可依据报告基因从其他细胞中识别区分甚至挑选出来。

2、载体应具备的特性：①能在宿主细胞内进行独立和稳定的DNA自我复制，插入外源基因后，仍保持稳定的复制状态；②易于从宿主细胞中分离，并行纯化；③载体DNA序列中有单一的酶切位点，并位于DNA复制的非必需区内；④具有能够观察的表型特征，如报告基因（遗传标记），插入外源DNA后，这些特征可以作为重组DNA选择标志。

3、载体的致死效应：利用载体进行克隆时，有时可能对大量的克隆化基因和克隆化基因产物可能有害，宿主细胞呈现致死效应。

如大量表达目的蛋白不利于宿主繁殖，使其致死。

A. 共价闭合环形DNA(cccDNA):呈现超螺旋的SC构型B. 开环DNA(ocDNA):即OC型。

C. 线性DNA(lDNA):即L型。

根据寄主细胞所含的拷贝数多少质粒分为严紧型和松弛型。

5、质粒的种类F质粒：又叫F因子、性质粒或致育质粒。

是最具代表性的单拷贝的接合型质粒，共编码着19个转移基因。

R质粒：又称抗药性因子，它们编码有一种或数种抗菌素抗性基因。

Col质粒：产生大肠杆菌素因子，编码有控制大肠杆菌素合成的基因。

属非结合质粒。

6、Col E1质粒的迁移作用：由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移的过程。

其中参与迁移的有两种基因：bom 基因：位于Col E1DNA上的特异位点mob 基因：Col E1质粒特有的，其编码的核酸酶作用于bom位点7、细菌质粒的不相容性在同一个大肠杆菌细胞，一般不能同时含有两种不同的质粒。

也称为质粒的不亲和性。

是指在没有选择压力的情况下，两种亲源关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。

8、质粒的报告基因应用类型：插入失活效应；α—互补简述如何应用插入失活和α-互补（蓝白筛选）来筛选重组子pBR322质粒载体有:抗氨苄青霉素基因(ampr);抗四环素基因(tetr)②α—互补：LacZ（半乳糖苷酶基因）有两个主要的亚基，α亚基和ω亚基，α与ω相结合就能表现出半乳糖苷酶活性，能将无色底物X-Gal 变成蓝色。

ω片段基因——coli基因组α- 肽基因——质粒➢将含有α- 肽的质粒转化到coli上（α- 互补），形成蓝色菌落；➢插入外源基因，使α- 肽编码区被破坏，LacZ失活则形成白色菌落。

利用α- 互补（蓝白斑筛选）进行重组子的筛选。

9、如何对质粒进行人工改造，使其成为载体。

（1）减小分子量：可容纳外源DNA更长；（2）改造内切酶位点，具有若干限制酶切单一位点的多克隆位点（人工合成且密集排列）；（3）插入外源基因后，较易导入宿主菌内复制和表达，且不会因接触而转移到另一个细菌；（4）具有一个或几个报告基因。