蛋白酶K活性单位测定proteinase K unit assay(超详细 含英文原文)
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Enzymatic Assay
酶活力单位测定
Enzymatic Assay
蛋白酶 K
Proteinase K
（译自 SIGMA 标准方法）
2021-03-08
原理:
蛋白酶 K 活性单位测定方法
血红蛋白+H2O
蛋白酶 K
TCA 可溶性肽和氨基酸
条件：T = 37℃，pH = 7.5，A750nm，Light path = 1cm
Blank 2.5 5.00
标曲：
Std 1
Std 2 Std 3
溶液 G（L-酪氨酸标液） 0.05
0.10
0.30
溶液 H（HCl）
2.45
2.40
2.20
溶液 E（NaOH）
5.00
5.00
5.00
充分涡旋混匀。各加入 1.5 mL 溶液 F(FC）于各个管中。
Std 4 0.50 2.00 5.00
（tips：某些微量核酸测定仪也可测定，且样品量只需 1-2μL）
方法：比色法
A. 1M 磷酸钾 buffer（pH = 7.5 at 37℃） 配制方法：称取 27.2 g 磷酸二氢钾（KH2PO4)溶于 190 mL 无菌水中，预热 至 37℃并置于 37℃水浴锅中，用 1M KOH 调节 PH 值至 7.5，用无菌水定容 至 200mL。
Folin, O. and Ciocalteu, V. (1927) J. Biol. Chem. 73, 627-650
样品计算:
∆A750nm Sample = A750nm Test - A750nm Standard Blank 将样品 y = ∆A750nm Sample 代入标准曲线公式，可计算出 x，即蛋白酶 K 水解 血红蛋白经蛋白酶 K 水解后释放的酪氨酸的量（单位：µmoles）。
酶活力计算：
Units/ml
注意事项
1. 本 检 测 方 法 不 可 用 于 检 测 Proteinase K-Acrylic Beads, P-0803, 和 Proteinase K-Agarose, P-9290
2. 本检测方法依据文献资料制定 3. 本文中指定 sigma 产品号和库存号的试剂，可以用等效的试剂代替
参考文献
反应过程：
取 2 个 10mL 离心管，分别标记 Test 和 Blank，按以下步骤加入溶液（单位：mL）：
Test
Blank
溶液 B（血红蛋白）
2.50
2.50
37℃预热 10min
溶液 D（TCA）
——
5.00
溶液 I（蛋白酶 K）
0.50
——
快速涡旋混匀，37℃水浴 10min（精确计时）
E. 500 mM NaOH 溶液 配制方法：称取 8.0 g NaOH 溶于水中，定容至 400mL。
F. Folin & Ciocalteu’s Phenol Reagent (FC) Folin-酚试剂较难制备，建议购买。
G. 1.1 mM L-酪氨酸标准溶液 配制方法：称取 0.0199 g L-酪氨酸于适量无菌水，稍微加热溶解（勿沸腾）， 冷至室温后定容至 100mL。
溶液 D（TCA）
5.00
——
溶液 I（蛋白酶 K）
——
0.50
涡旋混匀，室温放置 20min。过 0.45μm 滤膜收集滤液或离心取上清。
检测（比色）：
样品：
按以下步Байду номын сангаас加入溶液（单位：mL）：
Test
滤液/上清
2.50
溶液 E （NaOH）
5.00
充分涡旋混匀，各加入 1.5 mL 溶液 F(FC）于各个管中。
H. 200mM HCl 配制方法：1.67 mL 浓盐酸加入无菌水中，定容至 100mL。
I. 蛋白酶 K 溶液 配制方法：现配现用。用预冷的溶液 C 配制活性单位范围为 0.075-0.175 units/mL 的蛋白酶 K 溶液。
（tips：可根据市售蛋白酶 K 的比活力来估算未知粉末样品的酶活力；通过与已知酶活力 的蛋白酶 K 的浓度梯度电泳来估算未知液体样品的酶活力）
【注】：（1）1 N NaOH：0.4 g NaOH + 无菌水→定容至 10mL；（2）1N HCl：830 μL 浓盐酸（37%）+ 无 菌水→定容至 10mL
C. 20 mM CaCl2 溶液 配制方法：称取 0.444 g 氯化钙（CaCl2）溶于无菌水中，定容至 200mL。
D. 305 mM TCA 溶液 配制方法：称取 0.997 g 三氯乙酸（TCA）溶于无菌水中，定容至 20mL
【注】：（1）1 N KOH：0.561 g KOH + 无菌水→定容至 10mL
B. 2.0%（W/V)血红蛋白溶液（pH = 7.5 at 37℃） 配制方法：称取 2.0 g 血红蛋白（ Hemoglobin）溶于约 40 mL 无菌水中，37°C 下静置 20–25 分钟. 加入 8.0 mL NaOH（1N，即 1M）, 37°C 摇床中摇 10-15 min。 加入 36.0 g 尿素，37°C 摇床中摇 45 min。加入 10mL 溶液 A，摇匀。溶液预 热至 37℃并置于 37℃水浴锅中，用 1N HCl 调节 PH 值至 7.5，用无菌水定容 至 100mL。
enzyme
μmole
酪氨酸释放量 8.0 0.50 10 2.5
DF
8.0 = 反应终止后溶液总体积（mL）
10 = 测试时间 (min)
0.50 = 酶用量(mL)
2.5 = 比色检测时样本使用量(mL)
DF = 酶稀释倍数
最终检测浓度：
3mL 反应液中，各组分的终浓度为：83 mM Potassium Phosphate, 1.67% (w/v) Casein, 5.0 M Urea, 3.33 mM Calcium Chloride, and 0.037-0.088 unit Proteinase K.
Blank 0.00 2.50 5.00
快速、充分涡旋混匀，室温放置 10-15 min。转移至合适的比色皿中测定 750nm 波长下的吸光值。若溶液浑浊，在测定吸光值前迅速过 0.45μm 滤膜。
计算：
标曲绘制：
∆A750nm Standard = A750nm Standard - A750nm Standard Blank 以酪氨酸的量（单位：µmoles）为 x 轴，以∆A750nm 为 y 轴，绘制标准曲线。 （得到标曲的趋势曲线公式及 R2，若 R2 小于 0.999 建议重做标曲)
酶活力单位测定
Enzymatic Assay
蛋白酶 K
Proteinase K
（译自 SIGMA 标准方法）
2021-03-08
原理:
蛋白酶 K 活性单位测定方法
血红蛋白+H2O
蛋白酶 K
TCA 可溶性肽和氨基酸
条件：T = 37℃，pH = 7.5，A750nm，Light path = 1cm
Blank 2.5 5.00
标曲：
Std 1
Std 2 Std 3
溶液 G（L-酪氨酸标液） 0.05
0.10
0.30
溶液 H（HCl）
2.45
2.40
2.20
溶液 E（NaOH）
5.00
5.00
5.00
充分涡旋混匀。各加入 1.5 mL 溶液 F(FC）于各个管中。
Std 4 0.50 2.00 5.00
（tips：某些微量核酸测定仪也可测定，且样品量只需 1-2μL）
方法：比色法
A. 1M 磷酸钾 buffer（pH = 7.5 at 37℃） 配制方法：称取 27.2 g 磷酸二氢钾（KH2PO4)溶于 190 mL 无菌水中，预热 至 37℃并置于 37℃水浴锅中，用 1M KOH 调节 PH 值至 7.5，用无菌水定容 至 200mL。
Folin, O. and Ciocalteu, V. (1927) J. Biol. Chem. 73, 627-650
样品计算:
∆A750nm Sample = A750nm Test - A750nm Standard Blank 将样品 y = ∆A750nm Sample 代入标准曲线公式，可计算出 x，即蛋白酶 K 水解 血红蛋白经蛋白酶 K 水解后释放的酪氨酸的量（单位：µmoles）。
酶活力计算：
Units/ml
注意事项
1. 本 检 测 方 法 不 可 用 于 检 测 Proteinase K-Acrylic Beads, P-0803, 和 Proteinase K-Agarose, P-9290
2. 本检测方法依据文献资料制定 3. 本文中指定 sigma 产品号和库存号的试剂，可以用等效的试剂代替
参考文献
反应过程：
取 2 个 10mL 离心管，分别标记 Test 和 Blank，按以下步骤加入溶液（单位：mL）：
Test
Blank
溶液 B（血红蛋白）
2.50
2.50
37℃预热 10min
溶液 D（TCA）
——
5.00
溶液 I（蛋白酶 K）
0.50
——
快速涡旋混匀，37℃水浴 10min（精确计时）
E. 500 mM NaOH 溶液 配制方法：称取 8.0 g NaOH 溶于水中，定容至 400mL。
F. Folin & Ciocalteu’s Phenol Reagent (FC) Folin-酚试剂较难制备，建议购买。
G. 1.1 mM L-酪氨酸标准溶液 配制方法：称取 0.0199 g L-酪氨酸于适量无菌水，稍微加热溶解（勿沸腾）， 冷至室温后定容至 100mL。
溶液 D（TCA）
5.00
——
溶液 I（蛋白酶 K）
——
0.50
涡旋混匀，室温放置 20min。过 0.45μm 滤膜收集滤液或离心取上清。
检测（比色）：
样品：
按以下步Байду номын сангаас加入溶液（单位：mL）：
Test
滤液/上清
2.50
溶液 E （NaOH）
5.00
充分涡旋混匀，各加入 1.5 mL 溶液 F(FC）于各个管中。
H. 200mM HCl 配制方法：1.67 mL 浓盐酸加入无菌水中，定容至 100mL。
I. 蛋白酶 K 溶液 配制方法：现配现用。用预冷的溶液 C 配制活性单位范围为 0.075-0.175 units/mL 的蛋白酶 K 溶液。
（tips：可根据市售蛋白酶 K 的比活力来估算未知粉末样品的酶活力；通过与已知酶活力 的蛋白酶 K 的浓度梯度电泳来估算未知液体样品的酶活力）
【注】：（1）1 N NaOH：0.4 g NaOH + 无菌水→定容至 10mL；（2）1N HCl：830 μL 浓盐酸（37%）+ 无 菌水→定容至 10mL
C. 20 mM CaCl2 溶液 配制方法：称取 0.444 g 氯化钙（CaCl2）溶于无菌水中，定容至 200mL。
D. 305 mM TCA 溶液 配制方法：称取 0.997 g 三氯乙酸（TCA）溶于无菌水中，定容至 20mL
【注】：（1）1 N KOH：0.561 g KOH + 无菌水→定容至 10mL
B. 2.0%（W/V)血红蛋白溶液（pH = 7.5 at 37℃） 配制方法：称取 2.0 g 血红蛋白（ Hemoglobin）溶于约 40 mL 无菌水中，37°C 下静置 20–25 分钟. 加入 8.0 mL NaOH（1N，即 1M）, 37°C 摇床中摇 10-15 min。 加入 36.0 g 尿素，37°C 摇床中摇 45 min。加入 10mL 溶液 A，摇匀。溶液预 热至 37℃并置于 37℃水浴锅中，用 1N HCl 调节 PH 值至 7.5，用无菌水定容 至 100mL。
enzyme
μmole
酪氨酸释放量 8.0 0.50 10 2.5
DF
8.0 = 反应终止后溶液总体积（mL）
10 = 测试时间 (min)
0.50 = 酶用量(mL)
2.5 = 比色检测时样本使用量(mL)
DF = 酶稀释倍数
最终检测浓度：
3mL 反应液中，各组分的终浓度为：83 mM Potassium Phosphate, 1.67% (w/v) Casein, 5.0 M Urea, 3.33 mM Calcium Chloride, and 0.037-0.088 unit Proteinase K.
Blank 0.00 2.50 5.00
快速、充分涡旋混匀，室温放置 10-15 min。转移至合适的比色皿中测定 750nm 波长下的吸光值。若溶液浑浊，在测定吸光值前迅速过 0.45μm 滤膜。
计算：
标曲绘制：
∆A750nm Standard = A750nm Standard - A750nm Standard Blank 以酪氨酸的量（单位：µmoles）为 x 轴，以∆A750nm 为 y 轴，绘制标准曲线。 （得到标曲的趋势曲线公式及 R2，若 R2 小于 0.999 建议重做标曲)