（精选）保护酶活性测定方法一、过氧化物酶（pod）活性测定1、酶液的制备...

保护酶活性测定方法
一、过氧化物酶（POD）活性测定
1、酶液的制备：称取样品3 g，加入预冷的0.05 mol/L pH7.8的磷酸缓冲液少量，用粗纱布
过滤，定容至10ml，低温离心（12×104r/min,0~4℃）15min,取上清夜置于低温冰箱备用。

2、试剂：
0.05 mol/L pH 5.5磷酸缓冲液
0.05 mol/L 愈创木酚溶液（2-甲基酚）
20%三氯乙酸溶液
2%H2O2
3、仪器：分光光度计、离心机、研钵、容量瓶、量筒、试管、吸量管
4、过氧化物酶活性测定：
（1）加入反应混合液
2.9 ml磷酸缓冲液
1 ml愈创木酚溶液（2-甲基酚）
1 ml H2O2
0.1ml酶液
（2）37℃水浴锅中保温15min,迅速转入冰浴，并加入2ml三氯乙酸溶液终止反应
（3）过滤，适当稀释。

在470nm处测OD470。

5、结果计算：
以每分钟内OD变化0.01为1个酶活力单位。

即
酶活力=OD×D / 0.01t
酶的比活力= OD×D /（0.01tw）
其中：OD为反应时间内吸光度的变化
W为材料鲜重
t为反应时间
D为稀释倍数。

即提取的总酶液为反应系统内酶的倍数
二、多酚氧化酶（PPO）活性测定
1、酶液的制备：称取样品3 g，加入预冷的0.05 mol/L pH7.8的磷酸缓冲液少量，用粗纱布
过滤，定容至10ml，低温离心（12×104r/min,0~4℃）15min,取上清夜置于低温冰箱备用。

2、试剂：
0.05 mol/L pH 5.5磷酸缓冲液
0.05mol/L儿茶酚溶液（邻苯二酚）
20%三氯乙酸溶液
2%H2O2
3、仪器：分光光度计、离心机、研钵、容量瓶、量筒、试管、吸量管
4、多酚氧化酶活性测定：
（1）加入反应混合液
3.9 ml磷酸缓冲液
1 ml 儿茶酚溶液
0.1 ml酶液
（2）37℃水浴锅中保温15min,迅速转入冰浴，并立即加入2ml三氯乙酸溶液终止反应。

（3）过滤，适当稀释。

在525 nm处测OD525。

（4）结果计算：
以每分钟内OD变化0.01为1个酶活力单位。

即
酶活力=OD×D / 0.01t
酶的比活力= OD×D /（0.01tw）
其中：OD为反应时间内吸光度的变化
W为材料鲜重
t为反应时间
D为稀释倍数。

即提取的总酶液为反应系统内酶的倍数
三、超氧物歧化酶（SOD）活性测定
1、酶液的制备：称取样品3 g，加入预冷的0.05 mol/L pH7.8的磷酸缓冲液少量，用粗纱布过滤，定容至10ml，低温离心（12×104r/min,0~4℃）15min,取上清夜置于低温冰箱备用。

2、试剂：
14.5 m mol/L 甲硫氨酸溶液（A）
3×10-3 m mol/L 乙二胺四乙酸（B）
2.25 m mol/L 氯化硝基四氮唑蓝（C）
60×10-3 mol/L 核黄素（D）
0.05 mol/L pH7.8的磷酸缓冲液
3、仪器：分光光度计、离心机、研钵、容量瓶、量筒、试管、吸量管
4、超氧物歧化酶活性测定：
（1）加入反应混合液
甲硫氨酸溶液（A） 3 ml
乙二胺四乙酸（B） 2 ml
氯化硝基四氮唑蓝（C） 2 ml
核黄素（D） 2 ml
（2）在盛有反应混合液3 ml 的试管中，加入0.1 ml酶液，混合后放在透明的试管架上，在25℃生化培养箱中，光照15min，并立即遮上黑布终止反应。

（3）过滤，适当稀释。

在560 nm处测OD560。

（4）结果计算：
以每分钟内OD变化0.01为1个酶活力单位。

即
酶活力=OD×D / 0.01t
酶的比活力= OD×D /（0.01tw）
其中：OD为反应时间内吸光度的变化
W为材料鲜重
t为反应时间
D为稀释倍数。

即提取的总酶液为反应系统内酶的倍数
四、苯丙氨酸解胺酶（PAL）活性测定
1、酶液的制备：称取样品3 g，加入预冷的0.05 mol/L pH7.8的磷酸缓冲液少量，用粗纱布过滤，定容至50ml，低温离心（10×104r/min,0~4℃）15min,取上清夜置于低温冰箱备用。

2、试剂：
0.05 mol/L T ris-H2SO4缓冲液（pH8.8）：称取Tris 6.057 g溶于水中，用H2SO4调节pH值至8.8，用水定容至1L。

0.02 mol/L 苯丙氨酸溶液：称取3.3038 g苯丙氨酸，溶于1L的0.05 mol/L Tris-H2SO4缓冲液（pH8.8）。

PAL酶提取液：称取Tris 12.114g, EDTA-N a 0.3722 g,甘油76.2 g，巯基乙醇0.52 ml，溶于
水中，用H2SO4调节pH值至8.3，用水定容至1L。

3、仪器：分光光度计、离心机、研钵、容量瓶、量筒、试管、吸量管
4、苯丙氨酸解氨酶活性测定：
（1）加入反应混合液
（2）30℃水浴锅中保温30min。

（3）在290 nm处测OD290。

（4）结果计算：
以每分钟内OD变化0.01为1个酶活力单位。

即
酶活力=OD×D / 0.01t
酶的比活力= OD×D /（0.01tw）
其中：OD为反应时间内吸光度的变化
W为材料鲜重
t为反应时间
D为稀释倍数。

即提取的总酶液为反应系统内酶的倍数
测定方法苯丙氨酸解氨酶活性测定按欧阳光察方法[5];
多酚氧化酶活性测定按朱广廉方法[6]稍加修改;
过氧化物酶活性测定采用比色法[7];
可溶性蛋白质含量测定以牛血清蛋白为标准蛋白,按Folin-酚法测定[8]。

参考文献：
[2]周爱琴,祝军,生吉萍,等.苹果花青素形成与PAL活性及蛋白质含量的关系[J].中国农业大学学报,1997,2(3):97-99.
[3]吴振先,苏美霞,陈维信,等.贮藏荔枝果皮多酚氧化酶及过氧化物酶与褐变的研究[J].华南农
业大学学报,1998,19(1):12-15.
[4]张华云,王善广,牟其芸,等.套袋对莱阳茌梨果皮结构和PPO、POD活性的影响[J].园艺学报,1996,23(1):23-26.
[5]上海植物生理学会.植物生理学实验手册[M].上海:上海科技出版社,1985.191-192.
[6]朱广廉,钟海文,张爱琴.植物生理学实验[M].北京:北京大学出版社,1990.37-40.
[7]张志良.植物生理学实验指导[M].北京:高等教育出版社,1990.154-155.
[8]LowryOH,RosebroughNJ,FarrAI.ProteinmeasurementwithFolinphenolreagent[J].BiolChem,19 51,193:265-275
[12]欧阳光察,薛应龙.植物苯丙烷类代谢的生理意义及其调控[J].植物生理学通讯,1988(3):9.
[15]韩涛,李丽萍.果实和蔬菜中多酚氧化酶的作用[J].北京农学院学报.1998,13(2):115-124.
[16]万善霞,秦岭,于同泉,等.水分胁迫对板栗幼苗过氧化物酶、超氧物岐化酶活力及同工酶谱的影响[J].北京农学院学报.1997,12(3):20-25.。