趋化因子17对人鼻咽癌干细胞转移分化能力的影响
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李 建 民 等 趋 化 因 子 １７对 人 鼻 咽 癌 干 细胞 转 移 分 化 能 力 的影 响 第 １０期
趋化 因子 １７对人鼻 咽癌干细胞转移分化能力 的影 响
李建民 王丽萍 白伟 良 （青海大学附属 医院耳鼻喉科，青海 西宁 ８１０００１）
［摘 要 ］ 目的 探讨 趋化 因子 （ＣＣＬ）１７对人 鼻咽癌于细胞转移 分化能力 的影响 。方 法 采用脂 质体 Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２￣￣￣将人 工合成 的 ＣＣＬ１７和抗 ＣＣＬ１７抑制剂瞬时转染 ２０例鼻咽癌干 细胞 。实时定 量 （ＲＴ）一ＰＣＲ检测 ＣＣＬ１７和抗 ＣＣＬ１７抑制 剂瞬 时转 染 前后 的 ＣＣＬＩ７和血 管内皮生长因子 （ＶＥＧＦ）ｍＲＮＡ转录水平 ，进行 向成骨 、软骨 和脂 肪方 向的诱 导分化并 检测诱导前 后成骨 、软骨 和脂肪标志分子 的 ｍＲＮＡ表达 。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ小室法和划痕实验测细胞侵袭及迁 移能力变化 。结果 人工合成的 ＣＣＬ１７瞬 时转染后 ， 鼻 咽癌 干细胞 中 ＣＣＬ１７和 ＶＥＧＦ ｍＲＮＡ表 达相对 强度较 转染前 升高 ，侵袭及迁 移能 力较转染 前升 高 ，骨钙素 、Ⅱ型胶原 和脂联 素 ｍＲＮＡ表达相对 强度 明显降低 （Ｐ＜Ｏ．０５）。人工合成的抗 ＣＣＬ１７抑制 剂瞬时转 染后 ，鼻 咽癌 干细胞 中 ＣＣＬ１７和 ＶＥＧＦ ｍＲＮＡ表 达 相对强度 明显 降低 ，侵袭及迁移能力较转 染前 明显降低 ，骨钙 素 、Ⅱ型胶原和 脂联 素 ｍＲＮＡ表 达相对强 度 明显 升高 （Ｐ＜Ｏ．０５）。结 论 ＣＣＬ１７可促进人鼻咽癌干 细胞 转移而抑制其分化 ，下调 ＣＣＬ１７表达 可能是治疗鼻咽癌的有效方法。
［关键 词］ 趋化 因子 １７；鼻咽癌干细胞 ；转移 ；分化
［中图分类号 ］ Ｒ＇／６２ ［文献标识码］ Ａ ［文章编号 ） １￣５０２０２（２０１８）１０４３６wenku.baidu.com．０４；ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００５－９２０２．２０１８．１０．０２３
鼻咽癌是 常见的呼吸系统恶性肿 瘤疾病之一 ，是 侵袭 性较 强 的头 颈部 恶 性 肿 瘤 ，极 易 发 生 淋 巴结 转 移 及肝肺等远处转移 ，影响患者全身多处器官 ，可严重影 响患者的健康和生存质量 ，甚 至引发死亡等不 良预后 的发 生 ¨圳 。趋 化 因子 （ＣＣＬ）是 可趋 化 细胞 定 向移 动 的小分子肽 ，其中的 ＣＣＬ１７是与免疫微环境密切相关 的 因子 ，ＣＣＬ可 通 过 与 ＣＣＩＡ 结 合 而 引 发 分 子 构 象 的 改变 ，导致细胞外的钙离子 内流和细胞贮存 的钙离子 释放 ，引发细 胞质 内钙 离子 浓度 的 明显增 加 ，引发 靶细 胞反 应 ，从 而 参 与 白细胞 的迁 移 并 起 到 调 节 炎症 和调 节免 疫细胞 分 化 的作用 ，促 进血 管 重塑 Ｊ。因此 ，趋 化 因子 １７亦可能是与鼻咽癌等肿瘤血管生成 、侵袭转 移及分化等相关 的因子。本 研究探讨 ＣＣＬ１７对人鼻 咽癌 肝细 胞转 移分 化能 力 的影 响 。
１ 材 料 和 方 法
１．１ 对象 ２０１５年 １月至 ２０１６年 １月 ２Ｏ例青海大 学附属医院鼻咽癌手术切除所得 的鼻咽癌组织 ，病例 均经术后病理学检查证实为鼻咽癌 ，术前未经放化疗 等相 关抗 肿瘤 治疗 ，实验 标 本 的利 用 均 已获得 患 者 本 人或其委托人 的知情同意。进行鼻咽癌组织细胞的培 养传代及鼻咽癌干细胞 的分选富集 ，获得 ２０例鼻咽癌 干细胞。其中男 ｌ２例 ，女 ８例 ，年龄 ２６—７５岁 ，平均 （５４．６６＋５．７８）岁 ，２６～５９岁 ６例 ，６０～７５岁 １４例 。 １．２ 试 剂和 仪器 恒温 箱 （江苏 佳美 仪器 有 限公 司 ）、流式 细胞 仪 （德 国 Ｐａｒｔｅｃ公 司 ）、离 心 管 、玻 璃 瓶 、 吸管 、试管等 （广东东普医疗科技有限公司 ）、改 良杜 氏伊格尔培养基（ＤＭＥＭ）／Ｆ１２培养基 和胎牛血清 （美 国 Ｇｉｂｃｏ公 司）、ＲＮＡ提 取试 剂盒 （德 国 Ｑｉａｇｅｎ公 司 ）、
１ 中国医科 大学 附属盛京 医院耳鼻 喉头颈科 第 一作 者 ：李 建民（１９７０一），男 ，副 主任 医师，主要从事鼻咽癌研究 。
逆转 录试 剂 盒 （美 国 Ｐｒｏｍｅｇａ公 司 ）、实 时 定 量 （ＲＴ）一 聚合 酶链 反 应 （ＰＣＲ）试 剂 盒 和 ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ ＥＸ Ｔａｑ （日本 Ｔａｋａｒａ公 司 ）、倒置 相差 显微镜 、荧 光显 微镜 （日 本 Ｎｉｋｏｎ公司）、脂质体转染液 Ｌｉｐｏｆｅｅｔａｍｉｎｅ 。Ｍ转化生 长 因子 Ｂ１（美 国 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公 司 ）、凝胶 成像 系统 （美 国 Ｂｉｏ．Ｒａｄ公 司 ）、碱 性 成 纤 维 细 胞 生 长 因子 （美 国 Ｉｎ— ｖｉｔｒｏｇｅｎ公司）、泼尼松 、胰岛素 、Ｂ甘油磷酸钠 、维生素 ｃ、３一异丁基一１一甲级黄 嘌呤 、吲哚美辛 （美 国 Ｓｉｇｍａ公 司）、医用恒温水浴箱 （美 国 ＳＨＥＬＬＡＢ公司）。 １．３ 细胞 复苏 实 验 器 具 紫 外 线 照 射 １ ｈ后 将 需 复 苏 的细胞 迅速 放人 ３７￣Ｃ水浴 箱 中 ，摇 晃使 固态 细胞 融 化 ，１ ２００ ｒ／ｍｉｎ离心 ５ ｍｉｎ，弃去上清液 ，加入 ｌ ｍｌ细 胞培养液 ，移入培养瓶 中，补充细胞培养液至 ５ ｍｌ，轻 晃使细胞均匀分布 ，将培养瓶 置于 ３７℃ 、５％ＣＯ：恒温 箱 中培养。 １．４ 细胞传 代培 养 细 胞融 合 度 达到 ８０％ 以上时 采 用 磷 酸盐缓 冲液 （ＰＢＳ）清洗 细胞 ３次 ，去除 残 留血 清 ， 加人 ０．２５％的胰酶 ｌ ｍｌ消化 至细胞变小且细胞 间隙 变宽 ，弃去 胰酶 并 加 入 １５Ⅱｄ的 细 胞 培养 液 ，混 匀 ，均 分于 ３个培养瓶 中进行培养。将细胞再次进行消化离 心，加入细胞冻存液 １．５ ｍｌ移人冷冻管中，液氮保存 。 １．５ 鼻咽 癌干 细胞 得 分 选 富集 癌 细 胞无 血 清 悬 浮 培养至对数生长期 ，胰酶消化 ，制备成单细胞悬液 ，进 行 细 胞 计 数 ，调 整 细 胞 密 度 ，采 用 流 式 细 胞 仪 分 选 ｐ７５ＮＴＲ 细胞 （鼻咽 癌干 细胞 ）。 １．６ ＣＣＬ１７转染 将 鼻 咽 癌肝 细 胞放 入 培 养 皿 中并 观察鼻咽癌干细胞 ，取生长状态 良好 的鼻咽癌 干细胞 铺 于 ２个 ６孔板 中，至细胞融合度达到 ８０％左 右时 向 其 中一 个 ６孔 板 各 孔 添 加 预 先 配 置 的 脂 质 体 Ｌｉｐｏ－ ｆｅｃｔａｍｉｎｅ ５ 和 ＣＣＬ１７ ３．７５ ｖ，ｌ无 血 清 ＲＰＭＩ１６４０ 培 养 液各孔 均 添加 ２ ｍｌ，将 化 学 合 成 的 ＣＣＬ１７（序列 为 ：５ ．ＧＧＧＡｃＴＧｃＴＧｃｃＴＧＧＡＧＴＡｃ一３ ）瞬时 转 染 鼻 咽
趋化 因子 １７对人鼻 咽癌干细胞转移分化能力 的影 响
李建民 王丽萍 白伟 良 （青海大学附属 医院耳鼻喉科，青海 西宁 ８１０００１）
［摘 要 ］ 目的 探讨 趋化 因子 （ＣＣＬ）１７对人 鼻咽癌于细胞转移 分化能力 的影响 。方 法 采用脂 质体 Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２￣￣￣将人 工合成 的 ＣＣＬ１７和抗 ＣＣＬ１７抑制剂瞬时转染 ２０例鼻咽癌干 细胞 。实时定 量 （ＲＴ）一ＰＣＲ检测 ＣＣＬ１７和抗 ＣＣＬ１７抑制 剂瞬 时转 染 前后 的 ＣＣＬＩ７和血 管内皮生长因子 （ＶＥＧＦ）ｍＲＮＡ转录水平 ，进行 向成骨 、软骨 和脂 肪方 向的诱 导分化并 检测诱导前 后成骨 、软骨 和脂肪标志分子 的 ｍＲＮＡ表达 。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ小室法和划痕实验测细胞侵袭及迁 移能力变化 。结果 人工合成的 ＣＣＬ１７瞬 时转染后 ， 鼻 咽癌 干细胞 中 ＣＣＬ１７和 ＶＥＧＦ ｍＲＮＡ表 达相对 强度较 转染前 升高 ，侵袭及迁 移能 力较转染 前升 高 ，骨钙素 、Ⅱ型胶原 和脂联 素 ｍＲＮＡ表达相对 强度 明显降低 （Ｐ＜Ｏ．０５）。人工合成的抗 ＣＣＬ１７抑制 剂瞬时转 染后 ，鼻 咽癌 干细胞 中 ＣＣＬ１７和 ＶＥＧＦ ｍＲＮＡ表 达 相对强度 明显 降低 ，侵袭及迁移能力较转 染前 明显降低 ，骨钙 素 、Ⅱ型胶原和 脂联 素 ｍＲＮＡ表 达相对强 度 明显 升高 （Ｐ＜Ｏ．０５）。结 论 ＣＣＬ１７可促进人鼻咽癌干 细胞 转移而抑制其分化 ，下调 ＣＣＬ１７表达 可能是治疗鼻咽癌的有效方法。
［关键 词］ 趋化 因子 １７；鼻咽癌干细胞 ；转移 ；分化
［中图分类号 ］ Ｒ＇／６２ ［文献标识码］ Ａ ［文章编号 ） １￣５０２０２（２０１８）１０４３６wenku.baidu.com．０４；ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００５－９２０２．２０１８．１０．０２３
鼻咽癌是 常见的呼吸系统恶性肿 瘤疾病之一 ，是 侵袭 性较 强 的头 颈部 恶 性 肿 瘤 ，极 易 发 生 淋 巴结 转 移 及肝肺等远处转移 ，影响患者全身多处器官 ，可严重影 响患者的健康和生存质量 ，甚 至引发死亡等不 良预后 的发 生 ¨圳 。趋 化 因子 （ＣＣＬ）是 可趋 化 细胞 定 向移 动 的小分子肽 ，其中的 ＣＣＬ１７是与免疫微环境密切相关 的 因子 ，ＣＣＬ可 通 过 与 ＣＣＩＡ 结 合 而 引 发 分 子 构 象 的 改变 ，导致细胞外的钙离子 内流和细胞贮存 的钙离子 释放 ，引发细 胞质 内钙 离子 浓度 的 明显增 加 ，引发 靶细 胞反 应 ，从 而 参 与 白细胞 的迁 移 并 起 到 调 节 炎症 和调 节免 疫细胞 分 化 的作用 ，促 进血 管 重塑 Ｊ。因此 ，趋 化 因子 １７亦可能是与鼻咽癌等肿瘤血管生成 、侵袭转 移及分化等相关 的因子。本 研究探讨 ＣＣＬ１７对人鼻 咽癌 肝细 胞转 移分 化能 力 的影 响 。
１ 材 料 和 方 法
１．１ 对象 ２０１５年 １月至 ２０１６年 １月 ２Ｏ例青海大 学附属医院鼻咽癌手术切除所得 的鼻咽癌组织 ，病例 均经术后病理学检查证实为鼻咽癌 ，术前未经放化疗 等相 关抗 肿瘤 治疗 ，实验 标 本 的利 用 均 已获得 患 者 本 人或其委托人 的知情同意。进行鼻咽癌组织细胞的培 养传代及鼻咽癌干细胞 的分选富集 ，获得 ２０例鼻咽癌 干细胞。其中男 ｌ２例 ，女 ８例 ，年龄 ２６—７５岁 ，平均 （５４．６６＋５．７８）岁 ，２６～５９岁 ６例 ，６０～７５岁 １４例 。 １．２ 试 剂和 仪器 恒温 箱 （江苏 佳美 仪器 有 限公 司 ）、流式 细胞 仪 （德 国 Ｐａｒｔｅｃ公 司 ）、离 心 管 、玻 璃 瓶 、 吸管 、试管等 （广东东普医疗科技有限公司 ）、改 良杜 氏伊格尔培养基（ＤＭＥＭ）／Ｆ１２培养基 和胎牛血清 （美 国 Ｇｉｂｃｏ公 司）、ＲＮＡ提 取试 剂盒 （德 国 Ｑｉａｇｅｎ公 司 ）、
１ 中国医科 大学 附属盛京 医院耳鼻 喉头颈科 第 一作 者 ：李 建民（１９７０一），男 ，副 主任 医师，主要从事鼻咽癌研究 。
逆转 录试 剂 盒 （美 国 Ｐｒｏｍｅｇａ公 司 ）、实 时 定 量 （ＲＴ）一 聚合 酶链 反 应 （ＰＣＲ）试 剂 盒 和 ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ ＥＸ Ｔａｑ （日本 Ｔａｋａｒａ公 司 ）、倒置 相差 显微镜 、荧 光显 微镜 （日 本 Ｎｉｋｏｎ公司）、脂质体转染液 Ｌｉｐｏｆｅｅｔａｍｉｎｅ 。Ｍ转化生 长 因子 Ｂ１（美 国 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公 司 ）、凝胶 成像 系统 （美 国 Ｂｉｏ．Ｒａｄ公 司 ）、碱 性 成 纤 维 细 胞 生 长 因子 （美 国 Ｉｎ— ｖｉｔｒｏｇｅｎ公司）、泼尼松 、胰岛素 、Ｂ甘油磷酸钠 、维生素 ｃ、３一异丁基一１一甲级黄 嘌呤 、吲哚美辛 （美 国 Ｓｉｇｍａ公 司）、医用恒温水浴箱 （美 国 ＳＨＥＬＬＡＢ公司）。 １．３ 细胞 复苏 实 验 器 具 紫 外 线 照 射 １ ｈ后 将 需 复 苏 的细胞 迅速 放人 ３７￣Ｃ水浴 箱 中 ，摇 晃使 固态 细胞 融 化 ，１ ２００ ｒ／ｍｉｎ离心 ５ ｍｉｎ，弃去上清液 ，加入 ｌ ｍｌ细 胞培养液 ，移入培养瓶 中，补充细胞培养液至 ５ ｍｌ，轻 晃使细胞均匀分布 ，将培养瓶 置于 ３７℃ 、５％ＣＯ：恒温 箱 中培养。 １．４ 细胞传 代培 养 细 胞融 合 度 达到 ８０％ 以上时 采 用 磷 酸盐缓 冲液 （ＰＢＳ）清洗 细胞 ３次 ，去除 残 留血 清 ， 加人 ０．２５％的胰酶 ｌ ｍｌ消化 至细胞变小且细胞 间隙 变宽 ，弃去 胰酶 并 加 入 １５Ⅱｄ的 细 胞 培养 液 ，混 匀 ，均 分于 ３个培养瓶 中进行培养。将细胞再次进行消化离 心，加入细胞冻存液 １．５ ｍｌ移人冷冻管中，液氮保存 。 １．５ 鼻咽 癌干 细胞 得 分 选 富集 癌 细 胞无 血 清 悬 浮 培养至对数生长期 ，胰酶消化 ，制备成单细胞悬液 ，进 行 细 胞 计 数 ，调 整 细 胞 密 度 ，采 用 流 式 细 胞 仪 分 选 ｐ７５ＮＴＲ 细胞 （鼻咽 癌干 细胞 ）。 １．６ ＣＣＬ１７转染 将 鼻 咽 癌肝 细 胞放 入 培 养 皿 中并 观察鼻咽癌干细胞 ，取生长状态 良好 的鼻咽癌 干细胞 铺 于 ２个 ６孔板 中，至细胞融合度达到 ８０％左 右时 向 其 中一 个 ６孔 板 各 孔 添 加 预 先 配 置 的 脂 质 体 Ｌｉｐｏ－ ｆｅｃｔａｍｉｎｅ ５ 和 ＣＣＬ１７ ３．７５ ｖ，ｌ无 血 清 ＲＰＭＩ１６４０ 培 养 液各孔 均 添加 ２ ｍｌ，将 化 学 合 成 的 ＣＣＬ１７（序列 为 ：５ ．ＧＧＧＡｃＴＧｃＴＧｃｃＴＧＧＡＧＴＡｃ一３ ）瞬时 转 染 鼻 咽