干细胞研究进展

受精卵 囊胚
内细胞团
约140个细胞
原肠
外胚层
中胚层
内胚层 生殖细胞
表皮 脑神经 色素 心肌 骨骼 肾小管红细胞 肠平滑肌 胰岛 甲状腺 肺泡 精子 卵子
人体组织器官的分化
内细胞团 胚胎干细胞
原始生殖干 细胞
胚胎生殖 细胞
胚胎干细胞的获得
❖1998年11月美国威斯康辛大学 Thomsan报道获得人胚胎干细胞株 传代超过8个月、32代
造血干细胞，至少可以分化出12种血细胞。
骨髓间充质干细胞可以分化成为多种中胚层组 织的细胞〔如骨、软骨、肌肉、脂肪〕以及其 他胚层的细胞〔如神经元〕
多能干 细胞
多潜能 干细胞
单能干细胞 〔Unipotent Stem Cells，MPSCs〕
只能向单一方向分化，产生一种类型的 细胞
在各种已经分化组织中的成体干细胞是典型的单能干细胞，如 上皮组织基底层的干细胞，肌肉中的成肌细胞又叫卫星细胞。
B. SSEA-1
C. SSEA-3
D. SSEA-4
干细胞特性
S S E A -1 S S E A -3 S E A -4 T R A -1-60 T R A -1-81
AKP O ct-4 端粒酶活性 滋养细胞
培养条件
胚胎干细胞 － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
滋养细胞 ＋无血清培养
＋ bFGF
胚胎干细胞的获得
目前应用最为广泛的干细胞提取技术是体细胞核转 移技术，俗称“治疗性克隆〞。它是将体细胞的细 胞核注入去掉细胞核的卵细胞内，然后让这种新组 合而成的细胞发育成胚泡〔早期胚胎〕，再从胚泡 中提取干细胞。这种干细胞携带的是体细胞提供者 的基因。
生殖克隆〔治疗性克隆〕：体细胞核转移〔SCNT〕 去核卵细胞 + 体细胞核 克隆 囊胚 别离内细
胚 胎 干 细 胞 ---------------------------- 软 骨 细 胞 地塞米松，磷酸甘油
胚 胎 干 细 胞 ---------------------------- 骨 细 胞 基因转染
胚 胎 干 细 胞 ---------------------------- 胰 岛 素 分 泌 细 胞
干
神经干细胞
细
视网膜干细胞
胞
肌肉卫星干细胞
肝干细胞、皮肤表皮干细胞
肠上皮干细胞
分类
胚胎 干 细胞
成体 干细 胞
来源 畸胎瘤 胚胎内胚团 胚胎生殖脊 脑组织 成熟骨髓组 织
干细胞类型
可分化细胞
胚胎干细胞（EC) 各种类型组 胚胎干细胞（ES) 织细胞
胚胎生殖细胞（EG)
神经干细胞
神经元、血细胞
造血干细胞 间充质干细胞
临床病理生理学
干细胞研究进展
武汉大学根底医学院病理生理教研室 魏蕾 教授
主要内容
概念、特点、分类 干细胞分类概述 干细胞治疗研究及临床应用 干细胞研究展望
干细胞研究的起源与进展
美国?SCIENCE?
1999年度，2000年度
年度世界十大进展之榜首
干细胞〔Stem cells, SCs〕
❖ 在体外长期保持增殖和未分化状态
胚胎干细胞的获得
James A. Thomson： Wisconsin大学 方法：人卵细胞体外受精后，将胚胎培育
到囊胚阶段，提取 inner cell mass细胞，建立 细胞株。测试细胞株的细胞外表 marker 和 酶活性。每个胚胎可取得15－20个细胞用于 培养。
血液细胞、神经 胶质细胞
肌、骨、肌腱、 韧带
干细胞分类
根据分化潜能分类
❖ 全能干细胞
Totipotent stem cells，TSCs
❖ 多能干细胞
pluripotent stem cell
❖ 单能干细胞
unipotent stem cell
全能干细胞 〔Totipotent Stem Cells，TSCs〕
胚胎干细胞的获得
1998年美国有两个小组分别培养出了人胚胎 干细胞：
James A. Thomson： Wisconsin大学 John D. Gearhart: Johns Hopkins大学
方法：从受精后5－9周人工流产的胚胎中 提取生殖母细胞( primordial germ cell )。由 此培养的细胞株，证实具有多能干细胞的特 征。
干细胞生物学特点
多向分化 分化〔Differentiation〕指非特化细胞 (如干细胞)
成为组成身体的诸多的细胞中的一种特定细胞的过 程 分裂的慢周期性：绝大多数的干细胞处于Go期 通过两种方式生长
干细胞和前体细胞的分化
干细胞分类
根据发生学来源分类
➢ 胚胎期干细胞 Embryonic stem cells ESCs EGCs
?细胞?〔Cell〕， DOI:10.1016/j.cell.2007.11.019， Kazutoshi Takahashi, Shinya
Yamanaka
?科学?〔Science〕，DOI:
10.1126/science.1151526，Junying
Yu, James A. Thomson 两个科学家小组分别利用
(1) 细胞内碱性磷酸酶活性高 (2)端粒酶活性高 (3) 不被Hoechst33342 和Rhodamine123染色 (4) 细胞膜外表有特殊的标记：SSEA-3, SSEA-4,
TRA-1-60, TRA-1-81 (5) 能分化成三个胚层的细胞，将胚胎干细胞植
A. Alkaline phosphatase
❖ 胚胎生殖细胞〔Embryonic germ cells，EGCs〕
❖ 来自胎儿组织(从5~10周胎儿生殖嵴的原生殖细 胞)
干细胞分类 根据发生学来源分类
➢ 胚胎期干细胞 ESCs EGCs ➢ 成体干细胞〔Adult Stem Cells，ASCs〕
指存在于一种已经分化组织中的未分化细 胞，它能够自我更新并且特化形成该类型组织的 细胞。
➢ 成体干细胞 Adult Stem Cells，ASCs
干细胞分类
根据发生学来源分类
➢ 胚胎期干细胞 ESCs EGCs
由胚胎内细胞团或原始生殖细胞经体外抑制培养而筛 选出的细胞。
❖ 胚胎期干细胞(Embryonic stem cells，ESCs ): ❖ 来自早期胚胎 (4～5天，即胚泡)中的内细胞群
1 9 8 1 年 ，E v a n s 和 M a r tin 分 别 成 功 的 分 离 和 体 外 培 养了小鼠的胚胎干细胞
1 9 9 5 年 ， T h o m so n 等 人 分 离 建 立 了 第 一 株 灵 长 类 动 物的胚胎干细胞。
1 9 9 8 年 ， T h o m so n 等 建 立 了 第 一 株 人 类 胚 胎 干 细 胞 1 9 9 8 年 ， S h a m b lo tt 等 建 立 了 第 一 株 人 类 生 殖 干 细
大约每5000个细胞就能制造一个iPC细胞系
Thomson小组也使用了4个基因——OCT3，SOX2， NANOG和LIN28，其中前两个和Yamanaka小组是一样 的。利用的是胎儿皮肤细胞以及一个新生儿的包皮细胞 。
与Yamanaka小组相比，这项研究需要1万个细胞才能别 离出一个iPC细胞系，
胞群 ES细胞
去核胚胎干细胞
组装胚胎干细胞
核移植
组织干细胞
体 外 诱 导 培 养
干细胞工程
各种组织器官
韩 国 汉 城 大 学 黄 禹 锡 教 授
科学家最近运用体细胞核转移技术，用病人身上的皮肤细胞克隆出早期胚胎 ，然后提取新的胚胎干细胞系。这使干细胞研究向实用的“治疗性克隆〞前 进了一大步。领导这一研究的黄禹锡教授曾在2004年运用同样的技术，率先 用人类体细胞克隆出早期胚胎，并提取干细胞。
生物学与医学根底研究：
人类干细胞是机体早期发育的极好
模型。人类发育生物学研究经常受到伦
理学的限制。胚胎干细胞提供了直接研
究早期发育出现的复杂事件和细胞分化
的原初过程。
关键是找到控制与发育和分化过程相 关特定的因子
为了解非正常细胞分化〔肿瘤等〕的 原因提供线索
医疗实践
利用人体表皮制造“类胚胎干细胞〞取得成功
生殖干细胞 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
未知 ＋ ＋
LIF＋ bFGF ＋ Forskolin
胚胎干细胞的诱导分化： 胎牛血清，骨髓基质细胞共培养
胚 胎 干 细 胞 -------------------------------------------- 造 血 细 胞 RA
胚 胎 干 细 胞 ---------------------------- 神 经 细 胞 DM SO
干细胞分类 根据发生学来源分类
➢ 胚胎期干细胞 ESCs EGCs ➢ 成体干细胞〔Adult Stem Cells，ASCs〕
目前发现的成体干细胞
骨髓、牙髓
血液
脑
来
眼角膜、视网膜
源 骨胳肌
肝脏、皮肤
胃肠道上皮
胰腺
骨髓间充质干细胞〔Mesenchymal stem cells，
MSCs〕
造血干细胞
❖概念：
来自胚胎、胎儿或成人的具有持久 或终身自我更新能力的细胞，它能产生 特异的细胞类型，形成人体组织和器官
❖形态学特征
圆形、椭圆形，体积小、核大，具有 较高的端粒酶活性
干细胞生物学特点
根本特点：多向分化潜能和自我更新
属非终末分化细胞
它们是未分化的，终生保持具有分化成各种特定细胞的能力
在机体的数目、位置相对恒定 能自我更新： 成体干细胞制造自己本身 能够无限的分裂、增殖：可无限地分裂产生大量后裔
具有自我更新和分化形成任何类型细胞 的能力，有形成完整个体的分化潜能。
如胚胎干细胞，具有与早期胚胎细胞相似的 形态特征和很强的分化能力，可以无限制增殖并分 化成为全身200多种细胞类型，进一步形成机体的 所有组织、器官。
多能干细胞 〔pluripotent Stem Cells，TSCs〕
具有产生多种类型细胞的能力，但缺失去了 发育成完整个体的分化潜能，发育潜能受到一定 的限制。
美国著名的?时代?杂志每年都要评选一年来影响最大、最令人惊异的创 造 ，11月13日， 2005年度，韩国科学家培育的世界第一只克隆狗“斯纳 皮〞〔Snuppy〕荣登榜首。它是由韩国汉城大学教授黄禹锡领导的科研 小组克隆，它的“父母〞分别是一只阿富汗猎犬和一只拉布拉多猎犬。
干细胞培养过程
胚胎干细胞研究的进展情况
这种组织处于一种稳定的自我更新状态，但是当受 到严重伤害，需要多种类型的细胞来修复是，那么 需要激活多潜能干细胞。
干细胞分类概述
全能干细胞－胚胎干细胞
存在于受精后约5-7天人胚胎的囊胚内细胞团 具有分化为机体任何一种组织器官的潜能 具有种系传递功能 在体外可以进展遗传操作
人类胚胎发育简图
小鼠胚胎发育简图
人类表皮细胞制得了类胚胎 干细胞
〔图片来源：Junying Yu
避开了利用卵母细胞获得胚胎 干细胞的伦理争议
〕
研究目标：将一些正常的体细胞直接转化为诱导多能 性干细胞〔induced pluripotent cells，简称iPCs〕，它 们具有类似胚胎干细胞〔ES〕的功能
Yamanaka小组利用4种基因——Oct3/4，Sox2，c-Myc和 Klf4，实现基因重组的细胞分别来自一位36岁妇女的表 皮和一位69岁男性的结缔组织。
胞 2 0 0 0 年 ， R e u b in o ff 等 建 立 了 两 株 人 胚 胎 干 细 胞 。
A. Inner cell mass-derived cells
B. H9 colony
C. H9 cells
D. Differentiated H9 cells
胚胎干细胞的鉴别 胚胎干细胞具有以下特点：
胚 胎 干 细 胞 ---------------------------- 肌 肉 细 胞 T G F -B 1, V E G F , b F G F
胚 胎 干 细 胞 ---------------------------- 血 管 和 内 皮 细 胞 RA+胰 岛 素 +T3
胚 胎 干 细 胞 ---------------------------- 脂 肪 细 胞 B M P -2, B M P -4
胚
胎
干
Rosettes of neural epithelium.
Cell line H14.
Bone. Cell line H14.
细 胞
的
多
向
分
化
Cartilage. 软骨 Cell line H9.
Striated muscle. 横纹肌 Cell line H13.
人类胚胎干细胞研究的重要性
多能干细胞
造血干细胞 骨髓间充质干细胞 神经干细胞 肌肉干细胞 皮肤干细胞 其他
20世纪30年代人类白细胞抗原hla系统的发现新型免疫抑制剂抗细菌病毒感染药物重组造血生长因子等支持疗法1968gattihla110hla1978thomas10013bmtbonemarrowtransplantationcd34cd34ahsctautologoushaematopoieticstemcelltransplantationallogeneicallohsctmsctmyeloablativestemcelltransplatation非清除骨髓性干细胞移植nsctnonmyeloablativestemcelltransplatation临床准备临床准备临床准备临床准备52dr20临床准备临床准备hscalloautocbhschscthsct前准备前准备bcabmhlamlchvcmvebvhscthsct前准备前准备600800m1hscthsct前准备前准备autohscthsct前准备前准备800mlhscthsct前准备前准备hscthsct前准备前准备pbscmncautokgallosyn5810wbcplthscthsct前准备前准备cbsc42240ml新生儿娩出后开始分娩后5分钟结束并发症并发症gvhd异基因hsct时供体t淋巴细胞攻击受者各器官引起供者的干细胞未在受者体内生长宿主的免疫系统排斥治疗效果治疗效果50706473mdsauto27allo31all4650aml4246cml60nhl5070mm70急性髓细胞样白血病急性淋巴细胞性白血病慢性髓细胞样白血病非何杰金氏淋巴瘤骨髓增生异常综合征多发性骨髓瘤加入5氮杂胞苷azacytidine培养24发跳动加入5氮杂胞苷培养2430自发跳动细胞合成心房肽和脑钠肽现梗死部位有68为新生心肌细胞cscs循环干细胞循环干细胞骨髓表达绿色荧光蛋白gfp转基因小鼠移植受体鼠致死量照射结扎受体鼠左冠状动脉心肌梗死处可见gfpmscs并分化为心肌细胞68的梗死部位2001年orlic干细胞因子stemcellfactorscfsdf1可以迅速趋化干细胞的定向迁移新近靶器官受损