PCR芯片介绍

实时定量PCR是检测基因表达最灵敏、最可靠的方法，但由于实时定量PCR需要制备标准曲线和同时分析内参基因，因而每次实验只能检测少数几个基因的表达水平，若要检测大量基因，则工作量巨大，耗时长久。

经过对实时定量PCR体系进行优化开发出的P CR芯片，可同时进行多种基因的研究，并且还可节省在数据分析方面所花费的时间，使研究者可以在更短的时间内得到更丰富的信息，PCR芯片可广泛用于生命科学、生物技术、疾病检测、临床医学和环境检测等领域，是近年生命科学领域常用的研究手段之一。

目录
PCR芯片介绍
操作步骤
技术难度
检测数量
优势
应用
发展方向
PCR芯片介绍
实时定量PCR是检测基因表达最灵敏、最可靠的方法。

通过在试验过程中，实时监测荧光染料的信号变化可反映出样品中的基因拷贝数，并且实时定量PCR线性范围广（能达到5个数量级），因此可以检测同一样品中表达量极低的基因和表达量很高的基因。

但是，由于实时定量PCR需要制备标准曲线和同时分析内参基因，因而每次实验只能检测少数几个基因的表达水平，若要检测大量基因，则工作量巨大，耗时长久。

通过简单的以及经过优化的实时定量PCR体系，PCR芯片随之开发出来，研究者可以同时研究大量基因，既可以进行某些特别感兴趣的信号通路的研究，也可以作为验证芯片结果的方法，PCR芯片可广泛用于生命科学、生物技术、疾病检测、临床医学和环境检测等领域，是生命科学领域的研究热点之一。

操作步骤
采用PCR芯片进行实验只需2小时。

PCR芯片实验过程：首先将RNA样品反转录为cDNA第一链，作为PCR模板；接着，将模板加入到反应体系（RT2 Real-TimeTM SYB R Green PCR Master Mix）中。

在已经固定好基因特异性引物的96孔板各孔中，加入等量的PCR反应体系，进行PCR反应。

采用仪器配套的软件计算PCR芯片中的每个基因的循环阈值（Ct）。

最后，采用△△Ct方法比较对应的两个样本中同一基因的表达量变化。

通过分析看家基因Ct值的一致性，可确定合适的标准化方法。

芯片所设置的对照，可以检测PCR体系中是否存在DNA污染，或者是否有影响反转录或PCR实验步骤的因素存在。

技术难度
采用PCR芯片开展研究，技术上的难点是如何在同一次实验中，相同的PCR反应条件下保证不同的基因有相近的扩增效率，并且获得与单个基因实时定量PCR反应相当的灵敏度，特异性和可重复性。

因此首先设计筛选出最佳的候选引物，接着通过实验，在不同反应条件下，检测PCR反应体系与几千条PCR引物的组合，最终获得了优化的引物和P CR反应体系，适应PCR芯片的要求。

检测数量
根据一次实验所检测样品数量的多少，可将PCR 芯片分为低通量和高通量PCR 芯片。

低通量PCR 芯片的载体为96 孔或384 孔PCR反应板，仅须将制备好的样品cD NA 加入相应的反应孔内，在荧光定量PCR 仪上进行扩增即可。

在灵敏度方面，每次扩增仅需400 ng 总RNA[1]。

但低通量PCR 芯片所检测的基因数量有限，而且无法进行多个样品的多个基因的并行检测。

低通量PCR 芯片使用时和通常的定量PCR 操作步骤相同，即从待检的生物样品（细胞、组织、血液等）中提取总RNA 或分离出mRNA→经反转录形成cDNA→将所得的cDNA 直接等量加入含有相应待检测基因引物的孔中→加入PCR mix→在荧光定量PCR 仪上进行PCR 定量检测→数据分析。

高通量PCR 芯片是在固相载体上固定有成百上千个基因的特异性引物，并且可同时检测高达成百上千个样品，达到同时并行检测多个样品的多个基因表达的能力。

因此，具有检测通量高、耗时短和样品用量少的优点。

由Applied Biosystems[2]公司研制的OpenA rray System和Fluidigm 公司开发的BioMark System[3]将荧光定量PCR 技术与高通量芯片技术相结合，属于高通量PCR 芯片，但这些芯片必须在特定的定量PCR 仪器上使用进行。