DNA提取和PCR扩增文档

ctab法dna提取液各种成分的作用是什么?
1、裂解液要预热,以抑制DNase（脱氧核糖核酸酶）,加速蛋白变性,促进DNA溶解。

2、酚一定要碱平衡。

苯酚具有高度腐蚀性，飞溅到皮肤、粘膜和眼睛会造成损伤，因此应注意防护。

氯仿易燃、易爆、易挥发，具有神经毒作用，操作时应注意防护。

3、各操作步骤要轻柔,尽量减少DNA的人为降解。

4、取各上清时,不应贪多,以防非核酸类成分干扰。

5、异丙醇,乙醇.NaAc,KAc等要预冷,以减少DNA的降解,促进DNA与蛋白等的分相及DNA沉淀。

6、提取DNA过程中所用到的试剂和器材要通过高压烤干等办法进行无核酸酶化处理。

7、所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制。

提取DNA配方
CTAB为十六烷基三甲基溴化铵，
CTAB提取缓冲液的经典配方
Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏；
EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制DNase活性；
NaCl 提供一个高盐环境,使DNP充分溶解,存在于液相中；
Cβ-巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除基因组DNA。

CTAB 4g
NaCl 16.364 g
1M Tris-HCl 20ml( PH8.0)
0.5M EDTA 8ml，先用70ml ddH2O溶解, 再定容至200ml灭菌
冷却后0.2-1% 2-巯基乙醇（400ul）氯仿-异戊醇（24：1）：先加96ml 氯仿，再加4ml异戊醇，摇匀即可。

实验目的
从新鲜的小鼠肝脏中提取基因组DNA，为southern杂交或DNA文库的构建做好准备。

我们重点是要保证DNA的序列、产率和纯度，去除Dnase、机械剪切
（对于如此之大的基因组，防止机械剪切是很重要的）、物理、化学因素的影响。

实验原理及过程
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原理
琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。

其分析原理与其他支持物电
泳的最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。

琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。

但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中。

蛋白质和核酸会根据pH不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此跑的速度不同，根据这个原理可将其分开。

电泳缓冲液的pH在6~9之间，离子强度0.02~0.05为最适。

常用1%的琼脂糖作为电泳支持物。

琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广。

普通琼脂糖凝胶分离DNA 的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达10^7bp的DNA片段。

编辑本段操作流程
准备干净的配胶板和电泳槽
注意DNA酶污染的仪器可能会降解DNA，造成条带信号弱、模糊甚至缺失的现象。

选择电泳方法
一般的核酸检测只需要琼脂糖凝胶电泳就可以；如果需要分辨率高的电泳，特别是只有几个bp的差别应该选择聚丙烯酰胺凝胶电泳；用普通电泳不合适的巨大DNA链应该使用脉冲凝胶电泳。

注意巨大的DNA链用普通电泳可能跑不出胶孔导致缺带。

正确选择凝胶浓度
对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在0.5～2％之间，低浓度的用来进行大片段核酸的电泳，高浓度的用来进行小片段分析。

低浓度胶易碎，小心操作和使用质量好的琼脂糖是解决办法。

注意高浓度的胶可能使分子大小相近的DNA带不易分辨，造成条带缺失现象。

适合的电泳缓冲液
常用的缓冲液有TAE和TBE，而TBE比TAE有着更好的缓冲能力。

电泳时使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。

注意电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产生条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。

电泳的合适电压和温度
电泳时电压不应该超过20V/cm，电泳温度应该低于30℃，对于巨大的DNA电泳，温度应该低于15℃。

注意如果电泳时电压和温度过高，可能导致出现条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。

特别是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象
DNA样品的纯度和状态
是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象DNA样品的纯度和状态注意样品中含盐量太高和含杂质蛋白均可以产生条带模糊和条带缺失的现象。

乙醇沉淀可以去除多余的盐，用酚可以去除蛋白。

注意变性的DNA样品可能导致条带模糊和缺失，也可能出现不规则的DNA条带迁移。

在上样前不要对DNA样品加热，用20mM NaCl缓冲液稀释可以防止DNA变性。

DNA的上样
正确的DNA上样量是条带清晰的保证。

注意太多的DNA上样量可能导致DNA带型模糊，而太小的DNA上样量则导致带信号弱甚至缺失。

TIANGEN公司DNA分子量标准每次上样6ul即可得到清晰均匀的条带。

Marker的选择
DNA电泳一定要使用DNA Marker或已知大小的正对照DNA来估计DNA片段大小。

Marker应该选择在目标片段大小附近ladder较密的，这样对目标片段大小的估计才比较准确。

TIANGEN公司的DNA Marker条带清晰，亮度均匀，质量稳定，是您实验的首选。

需要注意的是Marker的电泳同样也要符合DNA电泳的操作标准。

如果选择λDNA/HindIII 或者λDNA/EcoRI的酶切Marker，需要预先65℃加热5min，冰上冷却后使用。

从而避免HindIII或EcoRI酶切造成的粘性接头导致的片段连接不规则或条带信号弱等现象。

凝胶的染色和观察
实验室常用的核酸染色剂是溴化乙啶（EB），染色效果好，操作方便，但是稳定性差，具有毒性。

而其他系列例如SYBR Green，GelRed，虽然毒性小，但价格昂贵。

TIANGEN公司的GeneGreen相比则是性价比高的低毒替代染料，其灵敏度比传统EB染料高10倍以上。

注意观察凝胶时应根据染料不同使用合适的光源和激发波长，如果激发波长不对，条带则不易观察，出现条带模糊的现象。

基因的PCR扩增（聚合酶链式反应）
验目的
1. 学习PCR反应的基本原理与实验技术。

2. 了解引物设计的一般要求。

实验原理
单链DNA在互补寡聚核苷酸片段的引导下，可以利用DNA聚合酶按5’→3’方向复制出互补DNA。

这时单链DNA称为模板DNA，寡聚核苷酸片段称为引物（Primer），合成的互补DNA称为产物DNA。

双链DNA分子经高
温变性后成为两条单链DNA，它们都可作为单链模板DNA，在相应的引物引导下，用DNA聚合酶复制出产物DNA。

PCR反应应用以上的基本过程，分别在待复制的已知序列DNA分子两端各设计一条引物，其中在DNA 5’端的引物（Pl）对应于上链DNA单链的序列，3’端的引物（P2）对应于下链DNA单链的序列，Pl和P2按5’→3’方向相向配置。

在含有引物、DNA合成底物dNTPs（dATP、dCTP、dGTP、dTTP 四种脱氧核糖核苷酸等摩尔数混合物）的缓冲液中，通过高温变性，使双链DNA变成单链DNA模板，降低温度复性，使引物与模板DNA配对，利用DNA聚合酶便可合成产物DNA。

引物和dNTPs过量，则在同一反应体系中可重复高温变性、低温复性和DNA合成这一循环，使产物DNA重复合成，并且在重复过程中，前一循环的产物DNA可作为后一循环的模板DNA参与DNA的合成，使产物DNA的量按2n方式扩增，所以这一反应称为聚合酶链式扩增反应。

理论上如果引物及dNTP 的量能够满足，则这一过程可无限重复，使模板DNA无限扩增。

PCR反应使几个DNA模板分子通过数小时扩增后增加到百万倍以上，因此能用微量样品获取目的基因，同时也完成了基因在体外的克隆，成为分子生物学及基因工程中极为有用的研究手段。

另外在医学研究和医疗诊断中亦体现出极大的应用价值。

常规PCR反应用于已知DNA序列的扩增，反应循环数为25～35，变性温度为94℃，复性温度为37℃～55℃，合成延伸温度为72℃，DNA聚合酶为Taq酶（可耐受95℃左右的高温而不失活），DNA扩增倍数为106～109。

引物的设计在PCR反应中极为重要。

要保证PCR反应能准确、特异、有效地对模板DNA进行扩增，通常引物设计要遵守以下几条原则：①引物长度：15~25个核苷酸；②CG含量为40%~60%；③Tm值高于55℃[Tm=4(C+G)+2(A+T)计算]；④引物与模板非特异性配对位点的碱基配对率小于70%；⑤两条引物间配对碱基数小于5个；⑥引物自身配对（特别是在引物的3’端）形成的茎环结构，茎的碱基对数不大于3。

由于影响引物的设计的因素比较多，所以常常利用计算机来辅助设计。

实验材料和试剂
（一）试剂
1．4×dNTP： lmmol/L dATP
lmmol/L dCTP
lmmol/L dGTP
lmmol/L dTTP
2．Taq酶：5U/ml
3．模板DNA：0.1mg/ml
4．引物：Pl： 5'-TTCCATATGCCTACTTCAAGTTCT-3'
P2：5'-ACCTAAGCTTGCTTCAAGTTAGTGT-3'
引物溶液浓度：50nmoI/L
（二）器皿
0.5ml薄壁Eppendorf管
（三）仪器
PCR自动扩增仪离心机
微量注射器微量移液器
电泳仪水平电泳槽
透射紫外观察仪
实验步骤
（一）准备PCR反应溶液
1．取薄壁0.5ml Eppendorf管一只，用微量注射器按以下顺序分别加入各试剂。

10×缓冲液 10 ml
4×dNTP 10 ml
引物Pl 1 ml
引物P2 1 ml
模板DNA 1 ml
Taq酶 1 ml
加无菌双蒸馏水至 100 ml
2．用手指轻弹Eppendorf管底部，使溶液混匀。

在台式离心机中离心2秒以集中溶液于管底。

3．加石蜡油50ml封住溶液表面。

（二） PCR扩增反应
将加好样品的Eppendorf管插在PCR自动扩增仪样品板上，95℃10分钟，使模板充分变性。

然后按以下步骤在PCR自动扩增仪中进行反应，25～35个循环。

93℃ 30秒
55℃ 45秒
72℃ 45秒
反应完毕，将样品取出置于冰浴中待用。

（三）结果检测
本实验PCR扩增的产物DNA片段长度为609bp，适合于1.0%琼脂糖凝胶中进行电泳检测。

【提示】
（一）引物设计
由于PCR反应在实用中，模板DNA往往来源于组织和细胞，所以样品的DNA背景十分复杂（如一个人的细胞含有30亿对碱基的DNA）。

设计引物时不能通过检索这些DNA的背景资料来得到特异性的引物，也就是说设计的引物不能完全排除与背景DNA还存在有大部份配对或完全配对的位点，尽量使设计的引物符合设计的一般原则，将可通过控制PCR反应条件来减少非特异性配对位点对反应的干扰。

（二）非特异扩增产物的出现
当扩增的DNA产物不止一种时，通常与以下几种情况有关：①背景DNA有与引物同源性高的其它位点。

可通过在两个引物的内侧序列上再使用另外一对或二条引物对扩增的产物DNA再做PCP扩增；②退火温度太低。

引物与模板的配对是一个动态过程，分子的热运动使引物与模板结合与解离而达到最佳配对位点上。

退火温度太低，造成引物与模板的非特异性位点部分配对而不解离下来，这种不正确的配对，进入PCR反应过程就可扩增出非特异的产物DNA。

提高反应的退火温度（有时此Tm值高出几度）将可改善结果；③过量的酶、引物和dNTP 可使PCR反应造成混乱，强行扩增出非特异产物DNA，适当降低这些试剂的量有助于问题的解决。

（三）PCR反应扩增不出DNA条带
在实验中偶而会出现这类情况，一般有以下几种原因：①引物的3’端与5’端书写错误，造成引物合成的错误。

此时应重新合成引物；②引物溶液反复冻融或污染了DNA酶类，造成引物降解。

换一份引物可解决该类间题；
③模板DNA制备时模板己降解。

这时应尽量找一些指示指标来检测模板质量；④Taq酶有失活或有杂酶污染。

重新换一份酶；⑤缓冲液条件不当。

各类PCR反应要求的条件并不完全一致，其中Mg2+离子的浓度对Taq的活性影响尤为明显，Mg2+浓度直接影响到DNA扩增的特异性和扩增DNA的产率，在反应体系中，由于DNA模板、引物、四种dNTP的磷酸基团，以及引物、模板原液中的EDTA等螯合剂都要结合Mg2+,因此合适的Mg2+浓度至关重要。

一般的情况下，过量的Mg2+会导致酶催化非特异性产物的扩增，而Mg2+浓度过低，又会影响Taq酶的活性，使产物DNA量降低。

为了选择到最佳的反应条件，在实验前，可设置在一定浓度的模板DNA、引物、dNTP和循环参数下，用不同浓度（如0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、……5.0mmol/L）Mg2+进行预实验。

在确定大概浓度后，可在该浓度上以0.2mmol/L增减。

10×缓冲液中用100mmol/L Tris-HCl是一种双极性离子缓冲液，以维持合适的pH的缓冲能力，10×缓冲液中的100mmol/L KCl是有利于引物的退火，但是过高的KCl将抑制酶的活性。

缓冲液中的明胶、TritonX-l00是为了稳定酶不变性失活，有的反应中加入100mg/ml的小牛血清白蛋白或0.05%Tween20，以及5 mmol/L DTT，都是酶的保护剂。

50%甘油是为使酶保存于-20℃时，不因结冰而失活。

这些酶的保护剂如果浓度过高，特别是质量欠佳时，往往都抑制酶在反应中的活性，在使用时应特别注意。

在反应体系中如果加入10%的DMSO（二甲亚砜）可以减少二级结构的形成，增加反应的特异性，但它对酶的活性也有少许抑制作用。

（四）反应体系加样顺序
反应体系一般为50～100微升体积，体系中加样顺序为dH2O补充体积，10×缓冲液（体积1/10），4种dNTP（各20～200mmol/L），两条引物（各0.1～0.5mmol/L），模板DNA要根据其分子量而定，一般在102～105拷贝数；Taq酶常要稀释为2.5单位/100ml。

为了防止高温反应时液体的挥发，常加入石蜡油封闭体系。

（五）脱氧核苷三磷酸浓度
脱氧核苷三磷酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）在反应中的浓度也非常重要，常用的浓度一般为20～200mmoI/L，而且四种dNTP的终浓度相等。

高浓度会抑制Taq DNA聚合酶的活性，引起聚合酶催化错配，而且由于反应中dNTP 结合Mg2+的量较大，所以四种dNTP的量相应为Mg2+的浓度提供参考。

（六）温度和循环参数
PCR扩增循环中的变性、退火、延伸的过程是反应体系在合适的条件下，通过不同的温度变化来实现的。

在PCR中控制温度是关系到实验成败的重要环节。

PCR的变性是实验进行的基础，如果加热的温度不能使靶基因模板和PCR产物的双链完全变性解离，则会造成PCR实验的失败。

常用的变性温度是90℃～94℃，为了提高变性效果而又不影响酶的活性，可在加酶前于97℃变性5分钟左右，加酶后的循环变性中以93℃～94℃变性30秒；退火的温度依赖于引物的长度、浓度及碱基组成如CG的含量，一般为55℃ 30秒钟，引物的退火温度可根据Tm = 4(G+C)+2(A+T) 公式进行计算；PCR的延伸温度在70℃～75℃之间，常用72℃，延伸1分钟，延伸的时间要根据扩增DNA的长度而定；PCR循环的次数为20～35次，循环次数取决于模板DNA的浓度。

循环的次数越多，反应非特异产物也越多，因此循环次数不宜过多。