Transwell实验 超详细

Transwell侵袭实验总结
第一节概念
这里想明白两个概念,一个是Transwell,另一个是肿瘤细胞侵袭模子.
关于Transwell这个词该若何解释,查了许多材料也未见精确的注解,我以为可以这么懂得吧,trans这个词根有转移.转运.穿过等意思,well有小室的意思,可以从字面上懂得,这是一类有通透性的杯状的装配,依据Corning公司的Transwell解释书中的介绍,可以以为这是一种膜滤器（Membrane filters）,也可以为是一种有通透性的支架（permeable supports）.
更精确地说,Transwell应当是一种实验技巧,这项技巧的重要材料是Transwell小室（Transwell chamber,Transwell insert）,其外形为一个可放置在孔板里的小杯子,不合厂家对Transwell会有不合的定名,而不合型号也可有不合外形,不合大小,依据实验须要,可有不合选择.
但无论是何种外形,其症结部分都是一致的,那就是杯子底层的一张有通透性的膜,而杯子其余部分的材料与通俗的孔板是一样.这层膜带有微孔,孔径大小有0.1－12.0µm,依据不合须要可用不合材料,一般经常运用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）.
下图是一个Transwell装配的纵切面
将Transwell小室放入造就板中,小室内称上室,造就板内称下室,上室内盛装上层造就液,下室内盛装基层造就液,高低层造就液以聚碳酸酯膜相隔.
我们将细胞种在上室内,因为聚碳酸酯膜有通透性,基层造就液中的成分可以影响到上室内的细胞,从而可以研讨基层造就液中的成分对细胞发展.活动等的影响.
运用不合孔径和经由不合处理的聚碳酸酯膜,就可以进行共造就.细胞趋化.细胞迁徙.细胞侵袭等多种方面的研讨.
下面参考guxuefeng战友和cosmosci战友的帖子具体来谈谈孔径的选择,当然不合细胞其体积不合,具体选择时要斟酌到细胞大小.这里重要谈几种大家经常运用的实验：
（1）共造就系统：
小于3.0um孔径前提下,细胞不会迁徙经由过程,是以,若研讨不涉及细胞活动才能,不须要细胞穿过聚碳酸酯膜,则应选择3.0µm 以下孔径.经常运用0.4.3.0µm.我们实验室用的是0.4µm.
将细胞A种于上室,细胞B种于下室,可以研讨细胞B排泄或代谢产生的物资对细胞A的影响.
（2）趋化性实验
可用5.0.8.0.12.0µm膜,上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室,计数进入下室的细胞量可反应下室成分对上室细胞的趋化才能.
①细胞B对细胞A的趋化感化：将细胞A种于上室,细胞B种于下室,可以研讨细胞B排泄或代谢产生的物资对细胞A的趋化感化.
②趋化因子对细胞的趋化感化：将细胞种于上室,下室参加某种趋化因子,可研讨该趋化因子对细胞的趋化感化.
（3）肿瘤细胞迁徙实验
经常运用8.0.12.0µm膜,上室种肿瘤细胞,下室参加FBS或某些特定的趋化因子,肿瘤细胞会向养分成分高的下室跑,计数进入下室的细胞量可反应肿瘤细胞的迁徙才能.
（4）肿瘤细胞侵袭实验
经常运用8.0.12.0µm膜,道理与肿瘤细胞迁徙实验相似.
上室种肿瘤细胞,下室参加FBS或某些特定的趋化因子,肿瘤细胞会向养分成分高的下室跑,但与肿瘤细胞迁徙实验不合的是,聚碳酸酯膜上室侧铺上一层基质胶,用以模拟体内细胞外基质,细胞
欲进入下室,先要排泄基质金属蛋白酶（MMPs）将基质胶降解,方可经由过程聚碳酸酯膜.计数进入下室的细胞量可反应肿瘤细胞的侵袭才能.
用于研讨肿瘤细胞侵袭才能的肿瘤细胞侵袭模子有如下几种（引自司徒镇强《细胞造就》）：
2.1 体内癌细胞侵袭模子
2.1.1 皮下移植侵袭模子
2.1.2 肌肉内移植侵袭模子
2.1.3 腹腔内移植侵袭模子
2.1.4 小鼠肾包膜下移植侵袭模子
2.1.5 鼠睾丸包膜下移植侵袭模子
2.1.6 小鼠耳廓皮下移植侵袭模子
2.1.7 鼠爪垫皮下移植侵袭模子
2.1.8 视网内界膜侵袭模子
2.2 体外癌细胞侵袭模子
2.2.1 体外静止器官造就法
2.2.1.1 半固体造就基单细胞器官造就法
2.2.1.2 液体造就基单细胞器官造就法
2.2.2 半体外半体内器官造就法
2.2.3 单层细胞器官造就法
2.2.4 瘤细胞球体器官造就法
2.2.4.1 静止球体器官造就法
2.2.4.2 扭转动摇球体器官造就法
2.2.5 单层细胞侵袭实验模子
2.2.6 Transwell侵袭小室测定法
可见,Transwell与侵袭实验之间其实不克不及划等
号,Transwell有多种运用,侵袭实验也有多种办法.所谓Transwell侵袭实验,其实是指将Transwell这一技巧运用于肿瘤细胞侵袭研讨的一种实验.因为其简略易行.反复性好,因而得到了越来越普遍的运用,但不克不及以为研讨肿瘤侵袭只有Transwell 一种办法.
第二节 Transwell侵袭实验
我的课题涉及Transwell侵袭实验和Transwell迁徙实验,其
他方面的Transwell运用我不太清晰,是以这里重要谈谈Transwell侵袭实验.
1.实验用品：
① Transwell小室：
多种厂家可供给,论坛里经常运用的是Costar.Corning.BD临盆的小室,我们实验室用的是Chemicon公司的ECM550系列,尚有Boyden lipore公司的millicell和雕弓满月射天狼战友介绍的Thincert.
这些厂家供给的小室,有的已铺好基质胶,买来就可以用,很便利,但也比较贵,我们实验室用的Chemicon公司的ECM550系列是已经铺好胶的,质量很好,但是异常贵,24孔板配套的小室,每个价钱约130元,不推举给大家.BD也有已包被好的,价钱不清
晰.Coster和Corning公司临盆的小室,是论坛里比较经常运用的,似乎是要本身铺胶,但据说每个小室成本只有40阁下,应当比较合适中国国情.
下面是一些战友供给的价钱,具体建议大家接洽代理商咨
询.linanping1979战友供给的价钱：coster的24孔板的transwell的价钱是456元RMB,8µm,用于肿瘤的侵袭实验.iceyxy 战友供给的价钱：Millipore的8µm的50个1760RMB,0.4µm的2000多,是一次性的.梅林战友供给的BD价钱： 240RMB一块
（6.5um,24孔,12instert）,似乎是没胶的.liguofan说国产的boyden30块一个.jjyy供给的价钱是：corning cat No.3422. 6.5mm transwell with 8.0um prore polycarbonate membrane insert, Qty 48,950人平易近币不到.平均每个20元不到.
Transwell小室按照公司的请求,都是一次性运用的.不过其实洗洗泡泡照样可以反复用的.我用的Chemicon公司的ECM554,用完后擦去基质胶,再用胰酶和75%酒精泡,可以把膜洗得很清洁,用前用紫外里外都照30min.sword01战友供给的处理办法：用棉签轻轻擦去胶和不和细胞,清水冲洗,超声清洗,低挡,30min,清水
3×5min,蒸馏水3×5min,室温凉干,用前紫外线小室正面3h,不和6h,微波,低火10min×2.
因为我买的是铺好胶的,所以没买Matrigel,二次运用的小室只用来做不须要铺胶的迁徙实验.以前的Chemicon ECM550系列,膜很壮实,擦不坏,可以反复用许多次,但如今的膜已经改用一种很薄很脆的材料,一般只能反复用一次,真黑啊！许多战友说Costar 和Corning也是可以反复用的,大家可以尝尝.
本身没见过,有兴致的可以本身研讨一下.
别的,依据论坛战友供给的信息,osmonic公司有专用的膜出售,鼎国生物代理.Transwell小室用事后,可把本来的膜切下,贴上osmonic公司的膜,如许又可以用了,不过我没用过,有兴致的可
以尝尝.maojianwen战友的运用办法： trasnwell小室做一次后,将本来的膜去掉落,从新泡酸,泡酒精,运用前照紫外,然后用密斯用指甲油（留意用无色较稀的）将osmonic公司的膜贴上,剪掉落过剩的边沿.再照紫外.
② 上层造就液：
上层造就液采取无血清造就基,为保持渗入渗出压,需参加
0.05%0.2% BSA.
③ 细胞：
值得留意的是,有侵袭才能的细胞才可用于Transwell侵袭实验.建议实验前先用酶谱法检测MMPs的表达,特别是MMP2的表达.假如不清晰细胞MMPs的表达情形,就盲目进行Transwell侵袭实验,可能会造成不须要的糟蹋,一次Transwell侵袭实验花钱少则数百,多则数千,其实不是笔小数量,照样当心为妙.
别的,为了让实验成果更显著,可先撤血清让细胞饥饿12－24h,再进行实验.
④ 基质胶：
经常运用的是人工重构基底膜材料Matrigel,重要成分为层黏连蛋白和Ⅳ型胶原,临盆厂家有BD.美国Collaborative Rsearch 公司等.CaoY战友的帖这么说的：Matrigel是BD公司临盆的,是
一种细胞外基质,4度时是液体,在37度会逐渐凝固成胶状,不成逆.同样的器械在sigma叫ECM.zhangyong1036战友供给的价钱：BD 公司的matrigel 1500阁下.
假如购置的小室是已经铺好基质胶的,那么Matrigel就不须要购置了.
⑤ 基层造就液：
基层经常运用含5%－10% FBS的造就基,具体浓度依据细胞侵袭力而定,侵袭力衰的细胞可恰当进步FBS浓度.基层也可用趋化因子,有战友将纤维粘连蛋白参加基层造就液作为趋化因子,但小我以为,FBS仍是最合适的.
⑥ 细胞造就板：
经常运用于Transwell侵袭实验的细胞造就板有6孔板.12孔板.24孔板等,以24孔最经常运用.细胞造就板没什么特别请求,通俗的细胞造就板就可以.但要留意,细胞造就板应当与购置的Transwell小室相配套.
⑦ 此外,膜的下室面可涂上纤维粘连蛋白
(fibronectin,FN,Sigma有售),如许做的目标是使穿过膜的细胞更好地附着在膜上,也可用胶原（collagen）或明胶（gelatin）.许多战友以为这不是必须的,并且我也是不涂的,细胞照样贴壁很
好.假如贴壁不好的话可以尝尝看.linanping1979战友以为,假如造就时光很长（>24h）,细胞照样会掉落到下室里面去,所以有前提的话,最好照样在膜基层涂上FN.
别的,值得一提的是,膜基层涂上FN还有必定的趋化感化.
2．步调
2.1 Transwell小室制备
2.1.1 无基质胶Transwell小室制备
① 包被基底膜：
用50mg/LMatrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面,4℃风干.假如须要鄙人室面铺FN的话,可将200ul枪头的尖端剪掉落,汲取FN平均涂抹在小室的下面.用胶原（collagen）的话,一班配成0.5mg/ml,直接用枪吸了涂在膜上.
② 水化基底膜：
吸出造就板中残存液体,每孔参加50ul含10g/LBSA的无血清造就液,37℃,30min.
尚有tianjin_glioma战友供给的办法：在上室的聚碳酸酯膜上参加稀释后的Matrigel (3.9ug/ul) 6080µl (留意体积不成太大,以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好),置37℃ 30min使Matrigel聚
合成凝胶.
2.1.2 有基质胶的Transwell小室制备
Chemicon公司的ECM550系列解释书请求,将小室放入造就板中,在上室参加300µl预温的无血清造就基,室温下静置15－
30min,使基质胶再水化.再吸去残剩造就液.
2.2 制备细胞悬液
① 制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h,进一步去除血清的影响.但这一步其实不是必须的.
② 消化细胞,终止消化后离心弃去造就液,用PBS洗1－2遍,用含BSA的无血清造就基重悬.调剂细胞密度至1－10×105,小我以为不要超出5×105.
具体实验时采取密度要本身探索,因为不合细胞,其侵袭才能是不合的.小我经验,细胞量过多,穿过膜的细胞会过多过快,假如最后用计数法统计成果的话将难以计数;而过少的话,可能还没到检测的时光点,所有的细胞都已穿过,是以起码也要包管在收样的时刻,上室内还要有必定量的细胞消失.
小我以为,对比组和处理尽量不要离开计数,因为细胞数量标差别会轻微影响实验成果.假如须要对细胞预处理而不克不及不离开计数,那么计数必定要多反复几回,力图精确,尽量包管对比组和处
理组细胞密度一致.
2.3 接种细胞
① 取细胞悬液100－200µl参加Transwell小室,不合公司的.不合大小的Transwell小室对细胞悬液量有不合请求,请参考解释书.24孔板小室一般200µl.
② 24孔板下室一般参加500µl含FBS或趋化因子的造就基,不合的造就板加的量有不合请求,具体请参考解释书.这里要特别留意的是,基层造就液和小室间常会有气泡产生,一旦产朝气泡,基层造就液的趋化感化就削弱甚至消掉了,在种板的时刻要特别留意,一旦消失气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进造就板.
③ 造就细胞：通例造就12－48h（重要依癌细胞侵袭才能而定）.时光点的选择除了要斟酌到细胞细胞侵袭力外,处理身分对细胞数量标影响也不成疏忽.
以我的课题为例,我运用的药物不但会克制肿瘤细胞侵袭力,还对细胞增殖有显著克制.我选择的药物浓度是用MTT筛选出的72h 的IC50.用这个浓度处理细胞,24h内对细胞增殖并没有显著克制,但24h后,克制造用就开端消失了.所以,用这个浓度来做Transwell,处理时光也必须限制在24h内,不然一旦药物克制了细胞增殖或者引诱出凋亡,使处理组细胞数量少于对比组,那么就难以确定穿过膜的细胞比对比组少,毕竟是因为侵袭被克制引起,照
样处理后细胞数量本身就比对比组少而引起的了.
时光过长不成以,同样,过短也不成,因为细胞内会有必定量的MMPs储存,短时光内可能侵袭才能不会有太大转变.同时从药物被接收进去,进而施展感化,影响MMPs表达,到最后释放到造就基中,还须要一个进程.时光点的选择可尽量长点,也可选择多个时光点研讨时光依附效应,但前提是这个时光规模内细胞数量不克不及有显著变更.
别的,我看到细胞在小室内的形态不是正常造就贴壁的形态,而是圆形的,仍是悬浮时的形态,不过会集合成团,所以看到细胞不正常贴壁也没紧要张,是正常现象
在造就进程中,膜下会逐渐有少量吝啬泡产生,这是正常现象,可不予处理,但我碰到过造就一段时光后,膜下消失了大气泡,亏得实时发明,不然效果将异常轻微.是以,小我建议,最好接种细胞后1－2h把造就板从造就箱里拿出来看看,确信没有大气泡产生.
2.4 成果统计
检测穿过的细胞数有两种办法：
2.4.1 直接计数法
2.4.1.1 “贴壁”细胞计数
这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后,可以附着在膜的下室侧而不会掉落到下室里面去.如下图：
经由过程给细胞染色,可在镜下计数细胞
① 用棉签擦去基质胶和上室内的细胞
② 染色：经常运用的染色办法有结晶紫染色.台肦蓝染
色.Giemsa染色.苏木精染色.伊红染色等.
小我推举采取0.1%结晶紫染色,这种办法有如下优势：(1). 不须要固定细胞,直接染色即可.(2). 配制简略便利.(3). 染色后可以用33%醋酸脱色,将结晶紫完整洗脱下来,洗脱液可在酶标仪上570nm 测其OD值,间接反应细胞数.小我以为这是结晶紫染色最大的优势地点.因为,固然经由精确的细胞计数,往往穿过膜的细胞数仍难以精确掌握,可能某一批实验穿过的细胞会特别多,乃至细胞成堆,这种情形下就难以计数了,这种情形下就可以用醋酸脱色后用酶标仪检测.运用结晶紫染色要留意,染色前要将膜风干,不然可能会染不上.
③ 细胞计数：我们运用的是Leica DC 300F正置显微镜进行不雅察和摄影,把Transwell小室反过来底朝上就可清晰看到小室底膜高低室侧附着的细胞.也有许多人用手术刀将膜切下后染色,再贴在玻片上,滴二甲苯,再盖上盖玻片,就可以长期保管,但是如许做小室就成了一次性的了,不免难免有点糟蹋.
取若干个视野计数细胞个数.论坛里一般采取3－5个视野,也有人用10个,都是随机拔取,小我以为如许选择的视野带有很大的有时性,也会掺进工资影响,特别是计数视野较少的时刻.我拔取16个视野,不是随机选择,而是有固定的地位.我们运用的显微镜所看到的视野的直径刚好是Chemicon公司的ECM550系列小室底面膜的直径的1/4.
如图,蓝色部分暗示膜的大小,白色圆形暗示视野的大小,绿色方形则暗示摄影时所能拍下的视野的中间部分.如许,每个小室都拍摄如下图的16个视野进行计数,如许得到成果是比较客不雅和精确的.
2.4.1.2 “非贴壁”细胞计数
因为某些细胞自身的原因或某些膜的关系,有时细胞在穿过膜后不克不及附着在膜上,而是掉落进下室.如下图：
2.4.2 间接计数法
间接计数法重要用于穿细致胞过多,而无法经由过程计数获得精确的细胞数所采取的办法,与经常运用的MTT实验是同样的道理.
2.4.2.1 MTT法
① 用棉签擦去基质胶和上室内的细胞
② 24孔板中参加500µl含0.5mg/ml MTT的完整造就基,将小室置于个中,使膜浸没在造就基中,37℃ 4h后掏出.
③ 24孔板中参加500µl DMSO,将小室置于个中,使膜浸没在DMSO中,振荡10min,使甲臜充分消融.掏出小室,24孔板于酶标仪上测OD值.
2.4.2.2 荧光试剂检测
这类办法一般是与Transwell小室一路出售的,其道理与MTT 法相似,是用一种荧光染料染细胞,再将细胞裂解,检测荧光
值.Chemicon的ECM554即属于这类.
2.4.2.3 结晶紫检测
上文已说过,这里不再赘述,道理与MTT法也是相似的.但结晶紫染色还有个长处,就是染色和脱色的进程其实不影响膜上细胞,在脱色后还可从新染色.
这是用正置显微镜拍摄的图,结晶紫染色,进行细胞计数.
第三节 Transwell的其他运用的实验步调
1．Transwell肿瘤细胞迁徙实验
进程与Transwell侵袭实验根本一致,不合的只是不须要铺Matrigel.小我以为,因为没有基质胶的阻拦,细胞穿过膜的速度较
侵袭实验显著加速,所以细胞量要更大.我做侵袭实验的细胞密度是1×105,而迁徙实验的密度是1×106.别的,基层造就液的FBS浓度也可恰当下调,我做侵袭实验的浓度是5%,迁徙实验的浓度是2.5%.
2．cathywxy战友的Transwell上皮细胞造就步调
做了一段时光的原代细胞造就,把经验拿出来跟大家分享一下吧,请有关战友配合商量：
(1) 将雄性wistar大鼠麻醉,开胸,将气管掏出,置于4℃含0.1％胰蛋白酶XIV (Sigma),100 U/ml青霉素和100ug/ml链霉素（GibcoBRL）.无Ca 2＋.Mg2＋,无血清的MEM.
(2) 用无菌的细胞刮棒刮气管内壁,将所得溶液离心后得到游离细胞.
(3) 离心后立刻用新颖的上述MEM溶液（含10％胎牛血清）清洗3次,以中和胰蛋白酶,再用含5％胎牛血清.100U/ml 青霉素和100 ug/ml 链霉素的LHC8 medium (Biofluids)冲洗一次.
(4) 冲洗事后,将得到的细胞悬液用台盼兰测定活气,若存活率大于90％,则将细胞以106/cm2密度接种于可通透的多聚碳滤膜上（12 mm SNAPWELL, Costar）,以37°C 5％CO295% 空气含5% 胎牛血清(GibcoBRL) and 100 U/ml 青霉素and 100ug/ml 链霉素
的LHC8 medium孵育6~10天.
(5) 孵育后,经测定跨上皮电阻在1000~2000Ω之间,即可用于电心理实验.
显微镜下气管上皮细胞形细胞呈铺路石状,圆形核位于中心,发展时常彼此慎密衔接成单层细胞片
3. metastasis战友的Transwell B16细胞的体外迁徙实验
我以前用 costar的Transwell做过B16细胞的体外迁徙实验,具体是这么做的：起首把Transwell倒置,在Transwell的PVPF 膜（0.8 um）的下概况涂一层fibronectin(10 ug/ml,50ul),37度2小时,PBS洗一遍后,放入预先每孔加有600ul的造就基（含10%血清）的24孔板内,后在Transwell的闺阁参加细胞（100ul,用含0.1%血清的造就基稀释好本身所需密度）,放入造就箱,1218小时后,掏出Transwell,用棉签擦去PVPF膜接近闺阁那一面的细胞,另一面的细胞用甲醛室温固定30分钟,结晶紫染色20分钟,用清水洗3遍以上,后在显微镜下不雅察细胞,记数.
4．mci战友的内皮细胞HMEC1迁徙实验
1%明胶处理的transwell经无血清的MCDB131培液于造就箱中均衡1小时后,上室参加100µl用serumfree MCDB131稀释的5*104/孔的HMEC及不合浓度的药物,下室参加0.6ml serumfree的
MCDB131培液及20%FCS刺激迁徙,同时设置响应阴性及阳性对比,置于CO2造就箱中感化8小时,然后弃去孔中培液,用90%酒精常温固定30分钟,0.1%结晶紫常温染色10分钟,清水漂净,用棉签轻轻擦掉落上层未迁徙细胞,显微镜(Olympus, DP50, Japan).下不雅察并摄影,最后用10%乙酸100µl/孔抽提10分钟,于600nm处测定OD 值.克制率盘算公式为：克制率（%）=[(OD值给药组OD值无刺激阴性对比)/（OD值不加药阳性对比 OD值无刺激阴性对比)]
×100%.。