核移植中卵母细胞激活方法的研究进展

核移植中卵母细胞激活方法的研究进展
作者：王爱萍
来源：《湖北畜牧兽医》2013年第04期
摘要：核移植后的重构胚，只有卵母细胞质被激活后才能启动发育，低的核移植胚发育率可能与卵母细胞质未充分激活有关。

对核移植中卵母细胞激活方法进行了综述。

对常用的几种激活方法及其激活原理进行了介绍。

关键词：核移植；卵母细胞；激活方法
中图分类号：S813.3 文献标识码：B 文章编号：1007-273X（2013）04-0074-04
核移植后的重构胚，只有卵母细胞质被激活后才能启动发育，低的核移植胚发育率可能与卵母细胞质未充分激活有关。

目前，用于卵母细胞激活的方法主要分为单一激活和联合激活。

常用的单一激活主要有电激活、钙离子载体A23187、离子霉素（Ionomycin）及乙醇等；联合激活主要是单纯的物理刺激或化学刺激以后再用蛋白质合成抑制剂或蛋白质磷酸化抑制剂或细胞松弛素B联合处理的一种激活方式。

现在越来越多的研究证明联合激活比单一的电激活或化学激活效果好，下面简要介绍几种常用的激活方法及其激活原理。

1 激活方法
1.1 电激活
电刺激是在核移植中常用的激活方法。

因该方法具有操作方便、激活率高和无化学毒副作用等特点而被广大研究者所青睐。

早在1989年，Onodera和Tsunoda的研究表明小鼠和兔卵母细胞在施以直流电脉冲后可发育到囊胚期。

在小鼠、兔、牛、猪的研究中都发现一次直流电脉冲只诱发一个钙离子瞬间波峰，而不是象受精一样引起的是钙离子波动。

尽管如此，一次或两次电脉冲就可以激活大部分卵母细胞。

电激活的原理是卵母细胞在短暂高压直流电脉冲的作用下，膜的磷酸二酯双分子结构的稳定性发生改变，细胞膜上形成很多可恢复的微小孔洞，使细胞外的Ca2+进入细胞，并使胞质内Ca2+浓度升高，细胞内Ca2+浓度的增加导致CSF活性消失，cyclinB被迅速降解，MPF活性消失，细胞被激活完成第二次减数分裂并进入下一细胞周期。

早期的研究表明核移植胚胎进行简单的电激活就如同卵母细胞孤雌激活一样，虽然可以得到进一步的发育，但激活效率较低而且电激活常常依赖于卵母细胞成熟时间[1]，卵龄越高CSF对Ca2+就越敏感，进而卵母细胞就越容易激活。

目前的研究结果表明，一次电刺激可诱导一次Ca2+升高，多次电刺激可出现多次Ca2+升高。

通过控制电刺激参数，模拟正常受精过程中Ca2+的节律性脉冲升高，可复制出正常受精过程的一系列生理学和形态学变化，启动MII期卵母细胞继续成熟分裂，步入正常发育轨道[2]。

电刺激下卵母细胞电激活率与卵母细胞的卵龄、电场强度、脉冲持续时间及次数有关，但各种动物在这些参数上存在差异[3]。

阎新龙等[4]报道用1.5 kV/cm，30 μs，2次脉冲（间隔3 s）对猪体细胞核移植胚激活可以获得较好
的桑葚胚率；刘国世等[5]报道用1.3 kV/cm，80 μs，1次脉冲对猪体外成熟卵母细胞进行孤雌激活可以获得较高的囊胚率；而马利兵[6]则认为1 kV/cm，30 μs和2次脉冲（间隔1 min）是激活小鼠卵母细胞的最佳电脉冲参数。

1.2 钙离子载体A23187和离子霉素（Ionomycin）
钙离子载体A23187（CaA）主要通过胞质内Ca2+的释放来激活卵母细胞[7、8]。

离子霉素作为另一种钙离子载体，也是通过卵母细胞内Ca2+的释放而发挥功能的[9]。

但是它不是直接促进卵母细胞内Ca2+的释放，而是先动用细胞膜上Ca2+通道由细胞外向胞内涌入，然后又刺激内源性内质网中的Ca2+进入卵母细胞质内[10]。

钙离子载体A23187和离子霉素也是一类目前最常用和最有效的哺乳动物卵母细胞的激活物质，但是这种激活没有电刺激简单省事，因为电激活时有半数以上卵母细胞激活后形成一个以上原核，而且无第二极体排出。

而用钙离子载体A23187和离子霉素对克隆胚胎进行激活时，会有第二极体的排出，为抑制卵母细胞释放第二极体，常需要再在含蛋白质合成抑制剂或磷酸化抑制剂的培养液中孵育一定的时间[11]。

1.3 乙醇激活
乙醇对卵母细胞的激活主要是引起细胞膜IP3的形成，通过IP3受体介导内源性Ca2+释放，引起卵母细胞产生激活的早期反应。

乙醇诱导Ca2+浓度升高持续时间较长，比受精过程中和任何其他化学激活诱导的Ca2+浓度升高持续时间都长。

乙醇处理可以有效的激活小鼠、牛、猪、绵羊的卵母细胞。

但在兔、山羊上的效果并不理想[12]。

通常，卵母细胞在含有7%～8%乙醇的培养液中孵育5～7 min就足以激活卵母细胞而形成原核，有些甚至能发育到囊胚，然而延长乙醇的孵育时间就会抑制这一作用[13]。

如果单独使用乙醇，其激活效果并不理想。

对于猪卵母细胞，5%、7%和10%的乙醇的激活率分别是3%、12%和15%[14]。

如果乙醇与放线菌酮素（CHX）联合使用则可有效提高牛卵母细胞的激活率和孤雌胚的发育率[15]。

李光鹏等[16]的研究也表明乙醇与CHX联合使用显著提高了猪卵母细胞的激活率。

Chenko等报道用乙醇配合CHX+CB激活的体细胞核移植胚胎，已经产出小犊。

1.4 蛋白质合成抑制剂
蛋白类细胞因子成熟促进因子（MPF）和细胞静止因子（CSF）是细胞周期的调节者，正是因为在二者的作用下卵母细胞才会停滞在MII期。

这些因子对Ca2+十分敏感，当卵激活胞质Ca2+升高到一定水平时，MPF和CSF便失活或消失。

使用蛋白质合成抑制剂激活卵母细胞不是因为能引起Ca2+浓度波动而起作用，而是因为能抑制这些蛋白质类细胞因子的合成，从而使卵母细胞离开MII期，恢复第二次减数分裂[15]。

目前常用的蛋白质合成抑制剂有嘌呤霉素、肌霉素和CHX。

CHX主要通过抑制cyclinB的合成，从而抑制了MPF的合成，而MPF正是卵母细胞维持在MII期所需的细胞因子，这样就使得卵母细胞内MPF活性迅速下降，导致卵母细胞激活。

CHX不抑制蛋白质的磷酸化，故不影响构成纺锤体的微管蛋白的活性，不影响第二极体的排出[16]。

因此，在用CHX激活卵母细胞时需要与细胞松弛素B协同作用才能抑制第二极体的排出。

CHX单独使用对卵母细胞的激活作用较弱，一般要与可以引起钙离子
波动的其他激活因子协同作用才可使卵母细胞达到充分激活。

CHX与其他因素协同促进卵母细胞活化的作用机制，一般认为电脉冲、离子霉素和乙醇等的刺激已经导致卵母细胞的活化，而CHX的作用是进一步抑制卵母细胞内新的相关蛋白的合成，使之不能产生新的CSF和MPF，使MPF一直处于低水平，因此又进一步促进卵母细胞的活化。

2005年，Kragh等利用电激活+CHX+CB的激活方法对猪卵母细胞进行了无透明带的克隆，其囊胚率高达21%。

1.5 蛋白质磷酸化抑制剂
蛋白质磷酸化抑制剂能阻止蛋白质的磷酸化进而抑制MPF和CSF的活性，同时也抑制了第二极体的排放，保证了孤雌激活卵母细胞的染色体为二倍体[18] 。

6-二氨基甲基嘌呤（6-dimethylaminopurine，6-DMAP）是一种广泛应用的蛋白质磷酸化抑制剂，它阻止蛋白质的磷酸化进而抑制MPF和CSF的活性，同时抑制了纺锤体形成时微管蛋白的磷酸化进而抑制了极体的排出，但6-DMAP不影响DNA的合成[19，20]。

它对卵母细胞的激活作用主要是维持
p34cdc2的磷酸化和抑制cyclinB的磷酸化，抑制MPF的活性，同时由于cyclinB的降解导致MPF活性下降，细胞分裂由MII期向末期II发展，从而使卵母细胞被激活。

6-DMAP同CHX 一样单独使用时对卵母细胞的激活作用较弱，也要与可以引起Ca2+波动的因素协同作用才可以使卵母细胞达到充分激活[21]。

Loi等[19]使用6-DMAP与乙醇，CaA，Ion和IP3联合激活卵母细胞以及核移植胚时，获得较好的效果。

电刺激+6-DMAP对猪的核移植胚的激活没有起到提高发育的作用，但电融合后用6-DMAP+CB进行激活处理，可以提高重组胚的分裂率。

1.6 联合激活
到目前为止，有关哺乳动物卵母细胞激活的研究已经做了很多，方法由原来的单一激活到现在的各种方法的联合使用，已取得了一定的进展。

现已知道联合激活比单一激活的激活率和胚胎发育率都要高。

李光鹏等[22]报道，单独使用乙醇、电脉冲和氯化锶激活猪卵母细胞，其激活率分别为11.9%、61.3%、41.9%，而将它们与CHX联合使用，则其激活率分别升高到27.8%、81.1%、74.5%；Shiga等[23]报道采用电刺激与CHX联合处理重构胚，已经获得以成年肌肉细胞为供体核的体细胞克隆牛；兰国成等[24]报道，单独使用5%或10%乙醇处理5 min 其激活小鼠卵母细胞的激活率只有41.3%和57.9%，单独使用6-DMAP处理6 h其激活率也只有40%，如果将二者联合起来使用，则使激活率分别达到65.5%和100%； Kragh等[17]报道用电激活+CHX+CB的方法对猪卵母细胞进行无透明带克隆，所获得的囊胚率高达21%，这比第一次报道的猪的无透明带克隆的囊胚率（6%）提高了将近4倍，比常规的显微操作核移植囊胚率（
2 核移植中卵母细胞激活研究的意义
从事科学研究的目的，一是服务于人类自身，满足其不断增长的生活需求；二是使科学本身向前发展，取得对自然界和人类更高层次的认识。

动物克隆是一项很前沿的生物科学领域，对它的深入研究也具有这两个方面的意义。

克隆技术潜在的经济效益是十分巨大的，它是动物育种、繁殖的新概念。

应用经修饰的细胞群进行核移植，可使动物基因标定变得可行，培育出
新的物种，建立重要疾病的基因模型，获得大量用于生产生物药物的动物或异种器官移植的动物，使人类的医疗事业能迈出飞跃的一步；它可用于加快良种家畜的繁殖，提高良种繁殖的效率，使畜牧业得到更好的发展；另外，克隆技术在珍稀动物的繁殖，濒危动物的拯救方面也有美好的应用前景。

当然，目前看来，更具意义的是它的科学含义，让一个体细胞再重新发育成一个动物个体本身就是一件具有高度想象力并富有挑战性的事情，使这一技术走向成熟的过程包含着许许多多的科学机遇，它不仅能推动发育生物学向前发展，而且可拓展生命科学的内涵，取得对生命现象更加深入的理解。

哺乳动物卵母细胞的人工激活，是细胞核移植技术的关键环节，卵母细胞激活与核移植成功与否密切相关，因为移植后的卵母细胞的核物质被供体细胞核所代替，移入的核物质的复制等过程完全依赖于卵母细胞的激活。

因此卵母细胞激活研究对于完善核移植技术有着重要的意义和价值。

到目前为止，对于克隆的研究已经取得了很大的成就，但是其总体效率仍然很低（不超过10%），其中一部分原因是与卵母细胞的未充分激活有关。

而且为什么同一种激活方法对于不同的动物其激活的效果会不一样，究竟那种激活方法效果较好仍然没有定论，这些现象所蕴含的深层的理论又是什么，这些问题的解决将会大大提高核移植的成功率，使该技术在理论和应用研究中发挥更重大的作用。

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