猪精液提取蓝耳病病毒核酸的方法比较

2019年第5期李巍:猪精液提取蓝耳病病毒核酸的方法比较41猪精液提取蓝耳病病毒核酸的方法比较
李巍蔦赵景利2,孙华武2,苍真伟1,王承功I,陈明非I,高佰华彳
(1•大连市现代农业生产发展服务中心，辽宁大连116037；
2.辽宁省大连市长海县动物卫生监督所，辽宁长海116500
3.辽宁春兴畜牧兽医服务中心，辽宁沈阳110001)
摘要：为筛选从猪精液中提取微量蓝耳病病毒(PRRS V)核酸的有效方法，将蓝耳病(变异株)弱毒苗稀释成不同滴度(TCID50/mL)的病毒液，与健康猪常温精液混合作用。

分别用Trizol法、磁珠法、离心柱法提取含毒精液中的病毒RNA,用荧光RT-PCR试验检测病毒RNA,结果表明，当精液中病毒滴度高于0.1TCID50/mL时，3种病毒RNA提取方法均可检出。

离心柱法对猪精液中PRRSV核酸提取灵敏度最高，可检出0.01TCID50/mL滴度的病毒，稳定性好。

关键词：蓝耳病；猪精液；含毒精液;病毒RNA；提取
中图分类号：S858.28文献标识码：B文章编号：1672-9692(2019)05-0041-04 Comparison of Extraction Methods for PRRSV RNA from Boar Semen
Li Wei\Zhao Jingli2,Sun Huawu2,Cang Zhenwei1,
Wang Chenggong1,Chen Mingfei1,Gao Baihua3
(1.Dalian Production and Development Service Center for Modern Agriculture,Liaoning Dalian116037:
2.Dalian Center for Animal Disease Prevention and Control,Liaoning Dalian116037;
3.Liaoning Chunxing Animal Husbandry and Veterinary Service Center,Liaoning Shenyang110001)
Abstract:In order to Screening effective methods for extracting trace porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV)RNA from boar semen,the attenuated vaccine of PRRSV(mutant strain)was diluted into different titers(TCID50/mL)and added to fresh semen samples of healthy boars.Trizol,magnetic bead and spin column method were respectively used to extract virus RNA from semen containing PRRSV and virus RNA was detected by Fluorescent RT-PCR.The results showed that virus RNA could be detected by using al1three extraction methods when the titers of virus in semen was higher than0.1TCIDgo/mL.Spin column method for extracting PRRSV RNA from boar se-men has the highest sensitivity,and the virus titers of0.01TCIDgo/mL can be detected with good stability.
Key words:Porcine reproductive and respiratory syndrome;Boar semen;Semen containing PRRSV; Virus RNA;Extract
猪蓝耳病(PRRS)是一种高度接触性传染病，呈地方流行性，妊娠母猪和1月龄以内的仔猪最易感，持续性感染是本病的重要特征。

本病除接触感染、空气传播外，还有两条最重要的传播途径：精液传播和胎盘垂直传播⑴。

有研究表明，种公猪感染猪蓝耳病病毒(PRRSV)后可在精液中检测到病毒，但种公猪不表现出任何临床症状，通过配种将病毒传播给母猪，使母猪繁殖性能下降，进而影响整个猪群的生产性能⑺"。

李桃梅等⑸通过深入试验发现即使公猪蓝耳病病毒血症已经消失，且体内已经存在中和抗体，公猪精液仍可间歇性带毒。

近年来，辽宁地区未发生猪蓝耳病的大面积发病和高死亡率，但
收稿日期=2019-03-27
作者简介：李巍(1981-),男，辽宁省大连人，本科，学士，高级曾医师，研究方向：动物疫病防控及实验室检测。

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对饲养环节和屠宰环节的猪血清和猪颌下淋巴结的PRRSV核酸检测一直存在3%〜10%不等的阳性率[6'7]o 对于猪精液PRRSV检测则一直是个空白，原因之一是由于精液中富含脂类、蛋白和多糖，而PRRSV含量相对低，导致病毒核酸提取效率不高。

本试验通过比较3种从猪精液中提取PRRSV核酸的方法，找出能够有效提取到猪精液中微量病毒核酸的方法，为兽医实验室开展猪精液PRRSV核酸检测提供技术支持。

1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1精液精液为大连市某种猪场的健康种公猪常温精液（精液采集后15min内稀释，保存在16〜18°C,精子活力不低于70%）,PRRSV荧光RT-PCR检测为阴性。

1.1.2病毒猪蓝耳病活疫苗（变异株）来自中牧实业股份有限公司，疫苗中含有猪蓝耳病弱毒株JXA1-R株，每头份疫苗含毒量为1050TCID50,10头份/瓶。

1.1.3试剂蓝耳病病毒变异株核酸检测试剂盒（RT-PCR-荧光探针法），购自中山大学达安基因股份有限公司；Trizol法总RNA提取试剂，购自生工生物工程（上海）股份有限公司；磁珠法病毒核酸提取试剂盒，购自上海拜诺生物科技有限公司；离心柱法病毒RNA提取试剂盒，购自北京天根生物科技公司。

1.1.4主要仪器荧光定量PCR仪（型号QuantStu-dio5,美国Thermo Fisher科技公司生产）；台式高速冷冻离心机（型号3K-15,德国Sigma公司生产）；核酸提取仪（型号KingFisher Flex,美国Thermo Fisher科技公司生产）。

1.2试验方法
1.2.1病毒液制备将JXA1-R株弱毒苗用1mL pH 7.4的PBS液稀释,得到滴度为10&。

TCID50/mL的病毒液，继续用pH7.4的PBS液连续做10倍倍比稀释，得到IO。

〜IO*稀释的病毒液，则病毒液对应的滴度分别是100、10、1、0.1、0.01TCID60/mLo
1.2.2含毒精液制备向精液中按1：10比例分别添加100-0.01TCID50/mL滴度的病毒液各100u L,则精液中的病毒含量分别为10、1、0.1、0.01、0.001TCID50/mLo添加的病毒液的精液充分旋涡混匀，16〜18°C放置过夜，在保证精子活力的情况下让病毒与精液充分作用。

不同含毒量的精液各取3份平行样本用于检测，检测前将含毒精液再次旋涡混匀。

1.2.3Tnzol法提取精液病毒RNA取不同含毒量的精液各100u L,分别加入1mL的Trizol,充分振荡混匀，室温放置10min,使核蛋白与核酸完全分离，12000r/min离心10min,取上清液800u L,加入200PL氯仿，剧烈振荡15s,室温放置3min,12000r/min4°C离心10min,吸取上层水相转移至干净的离心管中，加入等体积异丙醇，混匀，室温放置20min,12000r/min4C离心10min,弃上清，加入1mL75%乙醇洗涤沉淀，12000r/min4°C离心3min,弃上清，室温干燥5min,加入30u L RNase-free ddH2O充分溶解RNA,-82°C保存备用。

1.2.4磁珠法提取精液病毒RNA取含毒精液50uL,加入500PL裂解缓冲液，旋涡混匀1min, 8000r/min离心5min,取上清50u L,加入由10uL磁珠溶液、40uL异丙醇、2.5p L促结合剂、12.5PL去抑制剂、100uL裂解缓冲液混匀制成的混合溶液，混匀，核酸与磁珠结合形成磁珠核酸复合物，在外加磁场的作用下进行磁分离，弃去废液，加入清洗缓冲液200PL,清洗2次，加入洗脱缓冲液，核酸从磁珠上洗脱下来，再次进行磁分离，留在管中的为RNA溶液，这一过程均在全自动核酸提取仪上完成。

提取的RNA,-82°C保存备用。

1.2.5离心柱法提取精液病毒RNA取含毒精液100u L,加入裂解液600UL,充分颠倒混匀，室温静置5min,将液体转移至吸附柱中（吸附柱要套上收集管），13000r/min离心30s,弃去收集管中液体，加入600uL洗液，13000r/min离心30s,重复洗涤1次。

洗涤完成后要再次离心去除残留的洗涤液。

将吸附柱移入新的离心管中，向柱中央加入洗脱液50p L,室温静置1min,13000r/min 离心30s,离心管中液体为洗脱的RNA,-82°C保存备用。

1.2.6荧光RT-PCR法检测精液病毒核酸RNA分别取3种方法提取的RNA样本5u L,加入到20uL 扩增体系中，设置反应条件：50°C15min, 95°C15min,1次循环；94°C15s,55°C45s,
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40次循环，在55°C45s处收集荧光信号。

记录每份样本的Ct值，如果检测样本有典型扩增曲线且Ct 值W38,判为蓝耳病病毒变异株核酸检测阳性，如果检测样本无扩增曲线或Ct值＞38或无Ct值，判为蓝耳病病毒变异株核酸检测阴性。

2结果与分析
不同含毒量的精液用3种病毒RNA提取方法获得的核酸样本经蓝耳病变异株荧光RT-PCR方法检测后结果见表1。

当精液病毒含量》0.1TCID50/mL时，3种病毒RNA提取方法均可检出，当病毒含量«0.001 TCID50/mL时，3种病毒RNA提取方法均检不出。

离心柱法能稳定地检测到0.01TCID50/mL含量的病毒，Trizol法对0.01TCID50/mL含量的病毒检出率为1/3,磁珠法则未检出0.01TCID50/mL含量的病毒。

表1荧光RT-PCR法对猪精液PRRSV RNA样本的检测结果
Table1The detecting results of PRRSV RNA in boar semen by Fluorescent RT-PCR
核酸提取方法平行样本-
10TCID50/mL1TCID50/mL
CT值
0.1TCID50/mL0.01TCID50/mL0.001TCID50/mL
121.425.832.136.1NONE 离心柱法221.325.631.835.7NONE 321.526.132.236.5NONE
121.526.833.6NONE NONE Trizol法221.826.533.7NONE NONE 321.627.134.2NONE NONE
121.425.833.1NONE NONE 磁珠法221.626.533.8NONE NONE 321.726.233.6NONE NONE
3讨论
蓝耳病是对养猪业危害极大的繁殖障碍性疾病，精液传播是蓝耳病的重要传播方式之一，国内也有从猪精液中检出蓝耳病病原的报道[8'11]0目前，免疫无法解决猪持续带毒的问题，病原学检测是剔除蓝耳病带毒猪的主要途径，扁桃体和血清是最常采取的样本精液较少用于蓝耳病检测，一方面是由于精液中病毒含量相对微量，另一方面由于精液富含蛋白、脂类和多糖，精细胞核染色质致密，从精液中提取病毒RNA比其他组织困难间，因此，选择高效的病毒RNA提取方法是检测精液蓝耳病带毒的关键。

本次试验将蓝耳病变异株弱毒苗稀释成不同含毒量，与猪常温精液作用，模拟自然带毒的状态，用3种方法从猪精液中提取蓝耳病病毒RNA,用荧光RT-PCR试验检测PRRSV核酸，比较3种方法的RNA提取灵敏度，发现离心柱法对精液中PRRSV核酸提取灵敏度最高，稳定性好，提取灵敏度达到0.01TCID50/mLo
对精液中微量病毒核酸的提取和纯化，应首先将病毒从精细胞中释放出来，并尽量去除脂类、多糖等杂质。

离心吸附柱采用的是硅基质材料，在高盐、低pH缓冲系统中高效、专一地吸附RNA/DNA,在低盐、高pH情况下释放RNA/DNA,可以最大限度地去除杂质、蛋白质及细胞中其他有机化合物。

Trizol法即异硫氧酸弧/苯酚法，是传统的RNA提取方法，适用于大部分动植物材料，异硫氧酸肌能使核蛋白复合体解离，并将RNA释放到溶液中，采用酸性酚-氯仿混合物抽提，低pH酚使RNA进入水相，
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而蛋白质和DNA仍留在有机相，从而实现RNA的提取。

本次试验中Trizol法提取最高灵敏度也能达到0.01TCID50/mL,但稳定性不及离心柱法，而且提取过程较繁琐，但试剂成本低。

磁珠法运用氧化硅纳米磁珠，该磁珠有超顺磁性，在盐离子和外加磁场的作用下，核酸与磁珠表面专一、高效地结合，而蛋白质、代谢产物和其他污染物则不能结合。

本次试验中磁珠法RNA提取灵敏度低于离心柱法和Trizol法，虽然磁珠法实现了核酸提取的自动化，但考虑到精液本身病毒含量微少，磁珠法会导致假阴性的风险增大。

综上所述，三种病毒RNA提取方法各有优势，对于精液PRRSV核酸检测，离心柱法提取精液病毒RNA的灵敏度和稳定性上皆优于另二者。

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