利用ITS序列鉴定真菌

北方民族大学实验论文
题目：利用ITS序列鉴定真菌
学院：生物科学与工程学院
专业：生物技术
班级： 082
姓名：李晓飞李妍吾木尔古丽
张瑞莉陈波艾克拜尔
指导老师：刘建利
完成日期：2011年5月18日——2011年6月5日
利用ITS序列鉴定真菌
李晓飞李妍吾木尔古丽张瑞莉艾克拜尔陈波
（北方民族大学生物科学与工程学院银川750021）
摘要：采用实验室提供的两株酵母菌，活化培养后，经基因组DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳检测，以ITS1和ITS2为引物构成的PCR反应体系对目的DNA片段（ITS1区）进行扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测后送至测序公司测序，所测序列经Genbank比对后，两株菌分别为掷孢酵母属TY-241菌株(Sporobolomyces sp)和假丝酵母ST-50菌株（Candida sp）。

关键词：ITS序列酵母菌PCR 菌种鉴定
1 材料与方法
1.1试验材料与试剂
实验室提供的红色掷孢酵母菌[1]和白色产香酵母菌。

YEPD液体培养基[2]配方：酵母浸粉10g，葡萄糖20g，蛋白胨20g，配成1L溶液，分装100/250ml，121℃灭菌15min。

裂解液[3]：1L裂解液中需加Tris1.2114g，EDTA8.767g，SDS5g，用1M的NaOH调至8.0，121℃灭菌30min备用。

醋酸钾溶液：1L溶液中含醋酸钾245.35g。

氯仿-异戊醇（24：1）：现配现用。

70%乙醇：用95%乙醇配制，现配现用。

10×TAE溶液：1L溶液中含Tris1.2114g，EDTA29.22g，用HCl调pH至8.0。

1%琼脂糖凝胶：取1g琼脂糖溶于100ml1×TAE溶液中，微波炉加热至沸腾三次。

1.2主要仪器与设备
表一实验中使用的主要仪器
仪器名称型号产地
立式自控高压蒸汽灭菌器LDZX-40SSI 上海申安医疗器械厂
数显恒温水浴锅HH-4 国华电器有限公司
电泳仪DYY-12 北京市六一仪器厂
制冰机AF200PSC50R ΜSA
生物安全柜HFsafe 1200/C 上海力申科学仪器有限公司电冰箱BCD-219D 青岛海尔股份有限公司Sigma高速离心机3K30 Germany
电子精密天平HR-200 上海精科天平
酸度计DELTA302 上海
电子可调电炉101RF-3 天津市泰斯特仪器有限公司双层恒温振荡器THZ-9511K 太仓市实验设备厂
紫外分析仪WD-9403C 北京市六一仪器厂
台式常温高速离心机Centrifuge 5415D Germany
微量移液器多型号Germany
生化培养箱LRH-250 上海一恒科技有限公司
基因扩增仪Palm-Cyeler Aμstralia
电泳槽DYCZ-24A 北京六一仪器厂
1.3实验方法
1.3.1酵母菌的活化及培养
采用本实验楼4楼保藏的红色掷孢酵母菌和白色产香酵母菌[4]，先将菌株接于斜面中，25℃培养24h，再转接入三角瓶中100ml/250ml，25℃培养24h，保存于4℃冰箱备用[5]。

1.3.2酵母菌基因组DNA的提取
DNA的提取按照Makimura等[6]（1994）的方法进行。

⑴用移液器吸取1ml菌液，置于已灭菌的1.5ml的离心管内，常温下12000rpm离心1min，弃上清；
⑵加入250μl裂解液；
⑶100℃水浴15min；
⑷加入250μl 2.5M的醋酸钾后，置于冰上30min至1h；
⑸在4℃下13000rpm离心5min，上清夜移至一新1.5ml离心管内；
⑹加入500μl的氯仿-异戊醇（24：1），剧烈振荡，13000rpm，离心15min，移取上清夜至另一灭菌的1.5ml的离心管内；
⑺重复上一步，直到两相之间没有沉淀，将上清液移至另一灭菌的1.5ml的离心管内；
⑻加入500μl的冷的异丙醇，放置在-20℃静置15min；
⑼13000rpm离心15min；
⑽用1ml70%的乙醇洗涤沉淀；
⑾用1ml70%的乙醇再次洗涤沉淀；
⑿将沉淀置于室温下干燥；
⒀加入50μl已灭菌的ddH2O，在室温下溶解2h；
⒁放于-20℃冷藏备用；
1.3.3酵母菌基因组DNA的检测[7]
⑴制备琼脂糖凝胶：将10×TAE贮存液用蒸馏水稀释成1×TAE电泳缓冲液,待用，按1％称取适量琼脂糖,置于250ml锥形瓶中，加入对应量1×TAE稀释缓冲液，盖上封口膜，以减少水份蒸发，放入微波炉里加热沸腾，取出摇匀，使瓶壁上粘附的琼脂糖全部溶解，反复3次，至琼脂糖全部熔化，放置，待其稍冷却。

⑵胶板的制备：将制胶槽置于水平支持物上,选择合适厚度和齿数的样品梳，插上梳子。

向冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(EB)溶液数滴，摇匀，小心地倒入制胶槽内，使胶液形成均匀的胶层。

待胶完全凝固后，小心拨出梳子，将胶块取出，置于已加入足量1×TAE电泳缓冲液得电泳槽内。

⑶加样：取20μlDNA样品与2μl6×加样缓冲液混匀,用微量移液枪小心加入样品槽中，在第一个上样孔或最后一个上样孔内加入5μl的100bpDNA ladder。

⑷电泳：接通电泳槽与电泳仪的电源，以5V/cm（约100V）电泳，当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2cm处，停止电泳。

⑸成像：戴上一次性手套，在波长为254nm的长波长紫外灯下观察胶块，DNA存在处显示
出肉眼可辨的桔红色荧光条带，用凝胶成像系统照相(本实验中仪器损坏，直接用相机拍照)。

1.3.4 ITS片段的PCR扩增及扩增产物的检测
1.3.4.1 PCR反应体系见下表，于冰浴下进行[8]。

表二核糖体基因反应体系的组成（25µl体系）
试剂浓度体积(µl)
PCR缓冲液(包含TaqDNA
聚合酶、Mg2+和dNTP)
2.5×10
正向引物10 µM 0.2
反向引物10 µM 0.2
模板DNA 10 ng/µl -1 µg/µl 1.0
ddH2O 13.6
1.3.4.2 根据下表的引物和PCR反应条件对目的序列进行扩[9]。

表三核糖体基因PCR反应所用引物和反应条件
扩增片段引物(5’-3’)PCR扩增反应条件
ITS1区ITS1:GTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTG
ITS2:GCTGCGTTCTTCATCGATGC
95℃5min；(94℃45s，52℃1min，
72℃30s)×30；72℃8min。

1.3.4.3 PCR扩增产物的检测，采用琼脂糖凝胶电泳系统检测同1.3.3。

1.3.5 ITS片段的测序
将PCR扩增产物邮寄至测序公司，由测序公司完成测序。

1.3.6 BLAST比对、鉴定属、种
登录NCBI主页-点击BLAST-点击Nucleotide-nucleotide BLAST在Search文本框中粘贴检测序列-点击BLAST-点击Format-得到result of BLAST。

2 结果与分析
2.1基因组DNA电泳图
图一酵母菌基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图
如上图所示，标号“1”为红色掷孢酵母菌的基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图；标号“2”为白色产香酵母菌的基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图；C为对照组，无任何条带；标号“M”为Mark，共有15000、10000、7500、5000、3000、1500、1000、500bp等8类DNA片段，根据原图对
比，本次实验只可以检测到15000、10000、7500、5000、3000、1500bp等6类DNA片段。

酵母菌的基因组DNA破损片段较小，从图中可以看到，红色掷孢酵母DNA片段小于5000bp，集中于3000bp以下；而白色产香酵母的DNA片段有大于15000bp的，集中区段为5000到1500bp。

ITS1片段大小为500bp左右，故这样大小的DNA片段可以满足PCR要求。

2.2PCR产物电泳图
图二酵母菌ITS1片段PCR产物琼脂糖凝胶电泳图
1 1
2 2 C M
如上图所示，标号“1”为白色产香酵母菌的ITS1片段PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；标号“2”为红色掷孢酵母菌的ITS1片段PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；“C”为对照组，物任何条带；标号“M”为Mark，共有1500、1000、900、800、700、600、500、400、300、200、100bp等11类DNA片段，根据原图对比，本次实验只可以检测到1500、1000、900、800、700、600、500、400bp等8类DNA片段。

从图中可以看到，白色产香酵母菌和红色掷孢酵母菌的ITS1片段PCR产物大小均位于500-600bp之间，与预测结果相符，目的条带前端存在干扰小条带，可能为引物二聚体所致。

2.3菌株序列与鉴定结果
2.3.1红色酵母菌鉴定结果
⑴红色酵母菌ITS1序列：共594bp。

1 tttccgtagg tgaacctgcg gaaggatcat tagtgaatct aggacgttca atttaacttg aagtccgaac 71 tctcactttc taaccctgtg catttgtttt ggttagtagg attcgtctga acacctcttc atttacaaac 141 acaaagtcta tgaatgtata aagtttataa caaaacaaaa ctttcaacaa cggatctctt ggctctcgca 211 tcgatgaaga acgcagcgaa atgtgataag taatgtgaat tgcagaattc agtgaatcat cgaatctttg 281 aacgcatctt gcactccttg gtattccgag gagtatgtct gtttgagtgt catgaattct tcaaccctct 351 cttttcttag tgattggagc ggagtttgga ttctgagtgt tgctcctaac ccgagctcat tcgtaatgta 421 ttagcatcca tatttgagtt tcggattgac ttggcgtaat aagactattc gctgaggaat ctaacttcgg 491 ttagaagccg tgtttgaact aggaagctac taatctagct taagtctact tttagattag acctcaaatc 561 agataggatt acccgctgaa cttaaagcat atca
⑵与Genbank比对结果
⑶鉴定结果
红色掷孢酵母属于Sporobolomyces sp，TY-241菌株。

其分类学地位如下：
Eukaryota;Fungi;Dikarya;Basidiomycota;Pucciniomycotina;Agaricostilbomycetes; Agaricostilbomycetes incertae sedis;mitosporic Agaricostilbomycetidae; Sporobolomyces.
真核生物；真菌界；双核亚界；担子菌门；柄锈菌亚门；冬孢菌纲；黑粉菌目；掷孢酵母科；掷孢酵母属。

2.3.2白色酵母菌鉴定结果
⑴白色酵母菌ITS1序列：共551bp。

1 aaaccaacag ggattgcctc agtaacggcg agtgaagcgg caaaagctca aatttgaaag cctcggcatt 71 gtaatttcaa ggcggcagac cacaccgacc acaagtccat tggaacatgg cgccacagag ggtgacagcc 141 ccgtaggtcg cagcgcgtgt cttccgccaa agagtcgagt tgtttgggaa tgcagctcta acggtggtaa 211 attccatcaa aagctaaata ccggcgagag accgatagcg aacaagtaca gtgatggaaa gatgaaaagc 281 actttgaaaa gagagtgaaa cagtacgtga aattgttgga agggaagggt ttgggagcag acacggttcg 351 gccgggccag catcaattac gcgcgcgcca caaaacgccc gagaacgtaa gccgtctcgg tggttatagc 421 tcggcgccat agcgcgcgcg tgattgagga cagcatattc aggatgctgg cgtaatgctt ccaaaccgcc 491 cgtcttgaaa cacggaccaa ggagtctaac gtccatgcaa gtgtttgggt gcaaaacccc a
⑵与Genbank比对结果
⑶鉴定结果
白色产香酵母菌属于Candida sp，ST-50菌株。

其分类学地位如下：
Eukaryota; Fungi; Dikarya; Ascomycota; Saccharomycotina;Saccharomycetes; Saccharomycetales; mitosporic Saccharomycetales;Candida.
真核生物；真菌界；双核亚界；子囊菌门；酵母亚门；酵母纲；酵母目；隐球酵母科；假丝酵母属。

图三Sporobolomyces sp，TY-241图四Candida sp，ST-50
3 讨论
(1)酵母菌基因组DNA琼脂糖凝胶电泳结果
由图一可知，所提取出来的基因组DNA片段比较小，只有5000bp以下，与酵母菌单染色体大小107bp相差较大。

具体原因可能如下：在DNA提取步骤中，加完裂解液后要100℃水浴10min，时间可能过长，是DNA断裂较为厉害；在用氯仿异戊醇抽提蛋白质时，要剧烈摇动10min，这样的步骤也许会使DNA断裂；再者，使用高速离心机，其转速达到13000rpm，也可以使DNA断裂。

Mark理论条带为8条，实际只有6条，可能原因为Mark量太少，上样时只用了5μl；或者TAE浓度有问题，浓度可能过高。

(2)酵母菌ITS1片段PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果
由图二可知，酵母菌ITS1片段PCR产物大小为500-600bp，与文献中所说的情形类似。

但是，在目的条带前端仍有模糊条带，可能为引物二聚体，原因为PCR反应体系中所加引物过多，产生了引物二聚体。

(3)菌株序列与鉴定结果
两株酵母菌的序列均与Genbank中对应菌株的序列一致，相似度100％，故可以将两株酵母菌鉴定出来，但Genbank中菌株没有具体名称，只有菌株编号，故这两株菌也只能具体到属，种名用菌株编号表示。

4 结论
采用ITS1片段鉴定酵母菌还是一种比较简便、快速、价格低廉的有效方法，此种方法也得到了广泛的应用。

但在对酵母菌ITS1片段进行PCR扩増时，由于TaqDNA聚合酶存在一定的配错比，大概是10-6，可能使少数碱基发生改变，对测序产生一定的影响，尤其是对待新种的发表时。

本实验中的红色酵母菌为掷孢酵母属(Sporobolomyces sp)TY-241菌株，白色产香酵母为假丝酵母属（Candida sp）ST-50菌株。

参考文献
[1]李明霞.不同掷孢酵母属产掷孢子的能力及担子菌酵母形成特大厚垣孢子的规律[J].真菌学报,1989.
[2]姜维,徐莹,刘文磊,汪东风,栾红蕾.生物吸附剂耐盐性鲁氏酵母培养基的优化[J].中国酿造, 2010,07:32-36.
[3]毛志群,张伟,马雯.分子生物技术在酵母菌分类中的应用进展[J].河北农业大学学报,2002,25:230-233.
[4]李明霞,现代酵母菌分类鉴定方法与新技术[J].微生物学通,1992.
[5]酵母菌的特征与鉴定手册[M].青岛海洋大学出版社,1991.
[6]王启明,白逢彦.中国担子菌酵母的分类与分子系统学研究[博士论文].中国科学院微生物研究所,2004,6.
[7]马爱瑛,张琇,刘晓飞.一株产虾青素酵母菌株的鉴定[J].生物技术通报,2010,11:234-237.
[8]李金霞,刘光全,程池.酿酒酵母26S rDNAD1/D2区域序列分析及其系统发育研究[J].酿酒, 2007,1(1):37-39.
[9]王辰,白逢彦.海南热带雨林腐木中酵母菌物种多样性研究[硕士学位论文].中国科学院研究生院,2008,7.。