血红蛋白测定参考方法实验初探

血红蛋白测定参考方法实验初探
许蕾;王青;诸佩超;缪颖波;宋颖
【摘要】目的进行血红蛋白(Hb)测定参考方法实验研究,为开展Hb测定正确度验证试验提供保障.方法按照国际血液学标准化委员会(ICSH)要求,在UV-2550分光光度计上使用日本临床化学参考物质标准研究院赋值的有证低、中、高3个浓度水平Hb参考物质和2016年上海市临床实验室第1次室间质评血细胞分析正确度验证的2个调查样品,进行Hb测定总精密度、准确度和传递性等实验研究.结果5种样品Hb测定参考方法总精密度(CV)＜0.5％,3个浓度水平Hb参考物质准确度符合参考物质证书要求,61 5家临床实验室测定Hb总均值((x))和不同品牌血液分析仪Hb测定值与参考方法赋值之间偏移＜2.7％.结论用UV-2550分光光度计进行Hb测定参考方法实验研究的精密度、准确度均符合要求,Hb浓度能很好地传递到厂商常规血液分析仪.%Objective To investigate the reference method for hemoglobin (Hb) determination,and to provide a reference for trueness verification of Hb determination.Methods According to the requirements of the International Council for Standardization in Haematology (ICSH),UV-2550 spectrophotometer was used for Hb reference materials with
low,medium and high levels being labeled by Japanese Reference Material Institute for Clinical Chemistry Standards and 2 trueness verification samples in the first External Quality Assessment of Shanghai Clinical Laboratory 2016.The precision,accuracy and comparability were analyzed.Results The total precision (CV) of the 5 samples using the reference method for Hb determination was ＜0.5％.The accuracy of Hb reference materials with 3 levels met the certification of reference
materials.The bias of Hb determination total means ((x))determined by 615 clinical laboratories and Hb determination values by hematological analyzers with different brands was ＜2.7％,compared to reference method assignments.Conclusions The precision and accuracy of reference method for Hb determination by UV-2550 spectrophotometer meet related requirements.The level of Hb can be delivered well to routine hematological analyzers.
【期刊名称】《检验医学》
【年(卷),期】2017(032)008
【总页数】4页(P709-712)
【关键词】血红蛋白测定参考方法;UV-2550分光光度计;正确度验证
【作者】许蕾;王青;诸佩超;缪颖波;宋颖
【作者单位】上海市临床检验中心,上海200126;上海市临床检验中心,上海200126;上海市临床检验中心,上海200126;上海市临床检验中心,上海200126;上海市临床检验中心,上海200126
【正文语种】中文
【中图分类】R446.1
为了确保血红蛋白（hemoglobin，Hb）检测结果的溯源性和准确性，上海市临床检验中心（以下简称中心）按照国际血液学标准化委员会（the International Council for Standardization in Haematology，ICSH）和我国卫生行业标准WS/T 341-2011《血红蛋白测定参考方法》的要求[1-2]，使用UV-2550分光光
度计及相关程序建立检测平台，期望为血常规分析正确度验证试验和检验结果互认提供技术保障。

1.1 材料
UV-2550分光光度计和原装比色杯购自日本岛津公司。

A级棕色硼硅酸盐容量瓶（25 mL，500 mL）由德国BRAND公司提供。

正向定量移液器（100 μL）和配套毛细管由美国DRUMMOND公司提供。

上述设备和材料均由上海计量技术研
究院进行定期校准并出具校准报告。

氰化高铁血红蛋白（hemiglobincyanide，HiCN）试剂（即文-齐氏浓缩液，van Kampen and Zijlstre reagent）购自天津现代高科技研究院中山研究所，10 mL/支，按产品说明书要求制成应用液，避光冷藏可保存1个月。

有证低、中、高3个浓度水平的Hb参考物质购自日本临床化学参考物质标准研究院（the Reference Material Institute for Clinical Chemistry Standards，ReCCS），其标准号、Hb浓度和扩展不确定度范围（K=2）分别为：
JCCRM912-2L[（78.0±0.9）g/L]、JCCRM912-2M[（137.2±1.5）g/L]、JCCRM912-2H[（179.5±2.1）g/L]。

2016年上海市临床实验室第1次室间质评的血常规分析正确度验证调查样品（批号：20161301、20161302），即经弱固
定处理的新鲜血液样品。

一次性无菌薄膜过滤器（孔径为0.22 μm）购自爱尔兰的Merck Millipore公司。

一次性无菌注射器（20 mL，60 mL）分别购自美国BD公司和上海富达医用塑料公司。

低纤维干纸巾为德国Kimberly-Clark公司产品。

无菌生理盐水（9 mL/ 支）为江苏南京便诊生物科技公司产品。

避光锡纸为浙江金华海隆铝箔制品公司产品。

40余个不同品牌的常规血液分析仪及相关试剂为日本Sysmex公司、中国迈瑞公司、美国Beckman-Coulter公司，日本Nihon-Koulden公司、堀场公司和其他国内外厂商生产。

1.2 方法
按照ICSH和我国卫生行业标准WS/T 341-2011《血红蛋白测定参考方法》的要
求进行相关实验
1.2.1 总精密度试验取JCCRM 912-2L、JCCRM 912-2M、JCCRM 912-2H和20161301、20161302共5个样品，每个样品分别在5 d内用手工方法使用经校准的容量瓶和定量移液器分别制备2份251倍稀释待测样品，每份待测样品在
UV-2550分光光度计上测定6次，弃去第1次测定结果，计算其余10次稀释样
品测定结果均值（x）、标准差（s）和变异系数（coefficient of variation，CV），结果应符合参考方法规定的CV≤0.5%的要求。

1.2.2 准确度试验取JCCRM 912-2L、JCCRM 912-2M、JCCRM 912-2H 3个样品的总精密度测试结果值和参考物质证书上标注的Hb标准浓度靶值与扩展不确定度进行比较，结果应符合参考物质证书的要求。

1.2.3 正确度验证试验和常规血液分析仪传递性试验 2016年中心将20161301和20161302 2个样品同时发至参加上海市临床实验室第1次室间质评615家不同
医疗机构（包括一、二、三级医院、民营医院和独立实验室等）的临床实验室，要求收到样品后3 d完成Hb检测，每个样品重复检测5次，检测结果在规定时间
内通过网络上传到中心进行统计分析，回报的Hb结果与参考方法测得值进行比较，观察参考方法Hb结果在不同品牌血液分析仪上的传递情况。

2.1 总精密度试验
JCCRM 912-2L、JCCRM 912-2M、JCCRM 912-2H、20161301、20161302
共5个样品的总精密度试验结果CV为0.16～0.45，均符合Hb参考方法规定的CV≤0.5%的要求。

见表1。

2.2 准确度试验结果
JCCRM 912-2L、JCCRM 912-2M和JCCRM 912-2H 3个样品Hb试验结果的x
和参考方法证书上标注的Hb靶值很接近，符合要求。

见表2。

2.3 Hb正确度验证试验结果与参考方法比较
20161301和20161302 2个正确度验证调查样品在615个实验室用常规血液分
析仪测得的Hb总 x 与参考方法的总x比较，无偏移，均符合《全国临床检验操
作规程》第4版上规定的Hb正确度偏移≤±2.7%的要求[3]。

见表3。

2.4 不同血液分析仪Hb测定值与参考方法的可比性
6大品牌不同型号的血液分析仪测得的Hb的 x 与参考方法总x比较，偏移从-
0.82%～0%，均符合Hb正确度偏移≤±2.7%的要求。

见表4。

血常规分析是临床上最常用的实验室检测指标之一，其结果准确性直接影响到对患者的诊断和治疗。

根据ICSH文件的要求，血常规分析检测结果只有溯源到参考方法，才能保证结果的可比性和准确性[4]。

中心负责上海市各级医疗机构内医学实
验室质量管理工作，其中对检测结果溯源性的研究是重点工作。

应用Hb测定参考方法建立血常规分析标准化溯源体系工作对提高血常规检验质量、提供血常规分析正确度验证和校准血液分析仪等服务、逐步实现检测结果的可比性和一致性以及减轻患者医疗负担具有重要意义。

Hb测定按ICSH推荐的参考方法和我国卫生行业标准要求，应使用HiCN分光光
度法原理建立参考方法。

本研究显示，UV-2550分光光度计测定低、中、高3个浓度水平参考物质和2份正确度验证调查样品Hb测定结果的总精密度（CV）＜0.5%（表1）。

用低、中、高3个浓度有证参考物质进行Hb参考方法测定，结
果显示测定值与靶值非常接近，符合Hb参考物质证书上标注的要求（表2），说明用HiCN分光光度法进行Hb参考方法实验研究的精密度和准确度符合要求。

表3显示，新鲜血液经弱固定处理后5 d内，在615个实验室回报Hb测定总x 与
参考方法测定值之间偏移＜2.7%，符合《全国临床检验操作规程》第4版[3]Hb
测定正确度验证偏移要求。

国内外各大品牌系列，包括40多种不同型号血液分析
仪Hb测定x 与参考方法测定值具有很好的可比性，表明Hb参考方法测定值可传递到不同品牌血液分析仪，为开展Hb正确度验证试验选取稳定样品提供了技术支持。

血常规检测标准化溯源是一项复杂的工作，在Hb参考方法应用过程中，不仅要确保分析前、中、后全过程质量，更要确保全过程标准化环境和操作，包括实验室环境温度和湿度相对恒定、样本正确选择和采集、移液器和容量瓶等辅助设备定期校准和期间核查，其中100 μL定量移液器容量允许总误差应≤±2 μL，25 mL容量
瓶容量允许总误差应≤±0.03 mL，分光光度计在可见光范围透射比重复性应
≤0.1%，比色杯内径允许总误差为（1.000±0.002）cm[5]；样品稀释过程应标准操作（加稀释液和血液的准确、混匀方式和次数的一致、实验过程准确计时等），特别是HiCN试剂正确配制、贮存和新鲜程度、分光光度计定期校准、期间核查、日常维护和标准操作对实验结果影响非常重要，HiCN法必须待溶血反应充分完成后才能进行检测，否则结果会偏低。

同时，测定前要将HiCN溶液过滤，以除去
颗粒等杂质。

HiCN溶液纯度应达到1.59≤A540/ A504≤1.63，浊度应达到
A750≤0.003。

另外，实验数据应正确采集和规范运用，所有与检测结果相关的设备操作都需有标准操作规程（standard operation procedure，SOP）并做好相
关记录等，以保证最后赋值结果符合参考方法规定要求。

由于国内外对Hb参考方法研究报道较少，本研究结果为我们开展血常规分析正确度验证试验、室间质评样品赋值、仪器试剂评估和测量不确定度等研究打下基础和提供技术保障。

本研究有些问题还在进一步摸索中，如与国内外参考实验室结果比对等，期待通过进一步研究，把血常规分析参考方法做得更好。

【相关文献】
[1] ZWART A，VAN ASSENDELFT O W，BULL B S，et al. Recommendations for reference method for haemoglobinometry in human blood（ICSH standard 1995）and specifications for international haemiglobinocyanide standard（4th edition）[J]. J Clin Pathol，1996，49（4）：271-274.
[2] WS/T341—2011 血红蛋白测定参考方法[S]. 北京：中国标准出版社，2011.
[3] 尚红，王毓三，申子瑜. 全国临床检验操作规程[M]. 4版. 北京：人民卫生出版社，2015：1015.
[4] 彭明婷，谷小林，陆红，等. 我国血细胞分析参考系统的建立[J]. 中华检验医学杂志，2006，29（3）：196-198.
[5] 中国合格评定国家认可委员会. CNAS-CL54：2014 检测和校准实验室能力认可准则在血细胞分析参考测量领域的应用说明[S]. 北京：中国合格评定国家认可委员会，2014.。