质谱及液质联用技术的应用

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色谱质谱联用简介
• 色谱质谱的在线联用将色谱的分离能力与 质谱的定性功能结合起来，实现对复杂混 合物更准确的定量和定性分析。而且也简 化了样品的前处理过程，使样品分析更简 便。
• 色谱质谱联用包括气相色谱质谱联用(GCMS)和液相色谱质谱联用(LC-MS)，液质联 用与气质联用互为补充，分析不同性质的 化合物。
质谱及液质联用技术的应用
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1质谱仪的组成 LC-MS联用技术 LC-MS分析条件的选择和优化 液质联用技术的应用
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发展概述
Thomson J.J 于1906年发明质谱，到 20世纪 20年代质谱 才逐渐被化学家以一种分析手段采用。早期的质谱仪主要 用来进行同位素测定和无机元素分析，40年代以后质谱开 始广泛应用于有机化合物的结构鉴定 ，直到 80年代 ，有 机质谱及质谱联用分析技术得到了飞速的发展 。相继发 明了快原子轰击、电喷雾电离、大气压化学电离和基质辅 助激光解吸电离 等软电离技术，能用于分析高极性、难 挥发和热不稳定样品，使质谱的应用扩大到生物大分子的 领域。
ESI的优点是:解决了极性大、热不稳定的蛋白质与多 肽分子的离子化和大分子质量、一级结构和共价修饰位点 的测定问题 ,并可用于研究DNA与药物、金属离子、蛋白 质和抗原与抗体的相互作用。但是样品中的盐类对样品结 果影响很大 ,而且单个分子带电荷不同可形成多种离子分 子峰 (重叠峰 ) ,所以对混合物的图谱解析比较困难。
• 傅里叶变换-离子回旋共振质谱仪(FT-ICRMS).
┏四极+TOF（Q-TOF）
• 串列式多级质谱仪 ┫三重四极（QqQ）
(MS/MS)
┗TOF+TOF
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检测接收器
接收离子束流的装置有：电子倍增器、光 电倍增器、微通道板
数据及供电系统
将接收来的电信号放大、处理并给出分析 结果及控制质谱仪个部分工作。 从几伏低压到几千伏高压。
• FD(Field Desorption):场解吸—目前基本被FAB取代。
• FAB(Fast Atom Bombardment):快原子轰击—或者铯离子 (LSIMS,液体 二次离子质谱 ) 。
• ESI(Electrospray Ionization):电喷雾电离—属最软的电离方式。适宜极 性分子的分析，能分析小分子及大分子(如蛋白质分子多肽等)
eV = mv2 / 2
但是，不同质荷比的离子具有不同的速度，利用离子的不 同质荷比及其速度差异，质量分析器可将其分离，然后由 检测器测量其强度。记录后获得一张以质荷比（m/z）为横 坐标，以相对强度为纵坐标的质谱图。
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质谱分析过程
质谱分析过程可以分为四个基本环节： 1. 通过合适的进样装置将样品引入并进行气化 2. 气化后的样品引入到离子源进行电离，即离子化过程 3. 电离后的离子经过适当的加速后进入质量分析器，按不
• APCI(Atmospheric Pressure Chemical Ionization):大气压化学电离— 同上，更适宜做弱极性小分子。
• APPI(Atmospheric Pressure PhotoSpray Ionization):大气压光喷雾电 离—同上，更适宜做非极性分子。
• MALDI(Matrix Assisted Laser Desorption):基体辅助激光解吸电离。通 常用于飞行时间质谱和FT-MS，特别适合蛋白质，多肽等大分子．
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LC-MS联用技术的发展
质谱法可以有效地定性分析化合物 ,但对于有机混合物的 分析就无能为力了。而色谱法对有机化合物是一种有效的分离 和分析方法 ,特别适合进行有机化合物的定量分析 ,但定性分 析比较困难。因此两者的有效结合必将为化学家及生物化学家 提供一个进行复杂化合物高效的定性定量工具。色谱与质谱的 联用技术主要有气相色谱-质谱法 、液相色谱-质谱法 。 GCMS技术已经成为一种成熟的分析方法应用于很多领域。但是 在 1000多万种已经登录的有机化合物中大概只有不到20%可 以直接采用GC-MS进行分析。事实上在理化物证分析领域内 对炸药 、染料 、塑料等的分析也遇到类似的情况。即使采用 高的气化温度、短的停留时间有时还不能奏效。
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液相色谱--质谱仪
高效液相液质联用(HPLC/MS)是指高效液相液相色谱与质 谱串联的技术。HPLC-MS主要由HPLC仪、接口离子源 (HPLC与MS之间的连接装置)、质量分析器、真空系统和计算 机数据处理系统组成。混合样品通过液相色谱系统进样，由 色谱柱分离，从色谱仪流出的被分离组分依次通过接口进入 MS仪的离子源处并被离子化,然后离子被聚焦于质量分析器中， 根据质荷比而分离，分离后的离子信号被转变为电信号，传 送至计算机数据处理系统，根据MS峰的强度和位置对样品的 成分和结构进行分析。
• 其中ESI，APCI，APPI统称大气压电离(API)
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软电离技术
20世纪 80年代中期出现的两种新的电离技术:电喷雾电 离 (ESI)和基质辅助激光解吸电离 (MALD I ) ，这两种技术具 有高灵敏和高质量检测范围,能在飞摩 ( 10-15)乃至阿摩(10-18) 水平检测相对分子量高达几十万的生物大分子。目前，这两 种技术广泛用于生物学、生物医学、生物化学等科学领域的 研究。 1. 电喷雾离子化质谱技术 ( ES I ) 2. ESI的工作原理：利用位于一根毛细管和质谱进口间的电 势差生成离子，在电场的作用下产生一喷雾形式存在的带电 液滴。在迎面吹来的热气流的作用下，液滴表面溶剂蒸发,液 滴变小，液滴的电荷密度骤增。当静电排斥力等于液滴的表 面张力时，液滴便发生崩解，形成更小的液滴。如此形成的 小液滴以类似的方式继续崩解，于是液滴中的溶剂迅速蒸干， 产生多电荷正离子，在质谱仪内被分析纪录。电喷雾电离的 特征之一是可生成高度带电的离子而不发生破裂，这样可将 质荷比降低到各种不同类型的质量分析仪都能检测的程度。
同的质荷比进行分离 4. 经检测、记录，获得一张谱图 5. 上述过程可归纳在图1中。
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质谱仪的组成
典型的质谱仪一般由进样系统、离子源、分析器、检测器 和记录系统等不分组成，此外，还包括真空系统和自动控 制数据处理等辅助设备。下图为单聚焦质谱仪的示意图
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真空系统
• 质谱仪的离子源、质量分析器和检测器必须在高真空状 态下工作，以减少本底的干扰，避免发生不必要的离子分子反应。所以质谱反应属于单分子分解反应。利用这 个特点，我们用液质联用的软电离方式可以得到化合物 的准分子离子，从而得到分子量。
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电喷雾通常应用于 FT2 MS。Little等利用FT2 MS对一 个 50链寡聚糖核苷酸得到了优于10 μg/g的质量测定准确 度;对一个 100链寡聚核苷酸 ,质量准确度优于 30 μg/g。 测定的寡聚物的分子量可用于顺序确证 ,也可与气相裂解 结合来进行序列测定。Chen R等用 FT2I CR2 MS来捕获 和检测质量超过108D的单个 DNA离子。
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质谱分析的原理
质谱仪是一种测量带电粒子质合比的装置，利用带电粒子 在电场和磁场中运动（偏转、漂移、震荡）行为进行分离 与测量。在离子源中样品分子被电离和解离，得到分子离 子和碎片离子，将分子离子和碎片离子引入到一个强的电 场中，使之加速，加速电位通常用到6-8kV,此时所有带单 位正电荷的离子获得的动能都一样，即
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2. 基质辅助激光解吸电离技术 (MALD I )
基质辅助激光解吸电离技术 (MALD I)是用小分子有机物作为基质 ,样品 与基质的分子数比例为 1: (100 50000) ,均匀混合后 ,在空气中自然干燥后 送入离子源内。混合物在真空下受激光辐照 ,基质吸收激光能量 ,并转变 为基质的电子激发能 ,瞬间使基质由固态转变为气态 ,形成基质离子。而 中性样品与基质离子、 质子及金属阳离子之间的碰撞过程中,发生了样品 的离子化 ,从而产生质子化分子、 阳离子化分子或多电荷离子或多聚体离 子。
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自1968年发表第一篇HPLC和MS在线联用的实验报告至 90年代初形成的5种接口类型的商品仪器 ,经历了30年。LCMS经历了一个漫长的研究过程 ,主要是为了解决真空技术和 性能优越的接口技术。为解决质谱分析所必须的真空度 ,LCMS一般都采用分段、多级抽真空的方法。与GC-MS联用相 比 ,接口问题的解决过程是艰巨的。主要原因来自两方面:一 是真空;二是样品性质。也就是说质谱仪的高真空系统不适应 HPLC的流出液体；强极性、难汽化和热不稳定的样品不适应 质谱的常规进样和离子化方式。
• 由机械真空泵(前极低真空泵)，扩散泵或分子泵(高真空 泵)组成真空机组，抽取离子源和分析器部分的真空。
• 只有在足够高的真空下，离子才能从离子源到达接收器， 真空度不够则灵敏度低。
进样系统
• 把分析样品导入离子源的装置，包括：直接进样，GC， LC及接口，加热进样，参考物进样等。
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质量分析器
• 是质谱仪中将离子按质荷比分开的部分,离子通过分析器 后,按不同质荷比(M/Z)分开,将相同的M/Z离子聚焦在一 起,组成质谱。
质量分析器的分类：
• 双聚焦扇形磁场-电场串联仪器(sector).
• 四极杆质谱仪(Q).
• 飞行时间质谱仪(TOF).
• 离子阱质谱仪（TRAP）
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离子源
使被分析样品的原子或分子离化为带电粒子(离子)的装置，并对离 子进行加速使其进入分析器，根据离子化方式的不同，有机质谱中常用 的有如下几种，其中EI，ESI最常用。
• EI(Electron Impact Ionization):电子轰击电离—硬电离。
• CI(Chemical Ionization):化学电离—核心是质子转移。
MALD I的特点是准分子离子峰很强 ,几乎无碎片离子 ,因此可直接分 析蛋白质酶解后产生的多肽混合物。另一个特点是对样品中杂质的耐受 量较大 ,当用液体色谱分离蛋白质是 ,往往把盐留在样品中 ,若这些盐的量 在基质的 5%以下 ,可不影响蛋白质离子的发射 ,因而往往可省去脱盐的步 骤,大大缩短分析时间。
LC-MS在发展的过程中曾出现了很多接口技术 ,现在在线 联用接口汇集成商品化的5种接口为传送带(MB)、流动快原子 轰击(CFFAB)、粒子束(PB)、热喷雾(TSP)以及大气压电离 (API) 。其中API技术尽管不能全部代替其他4种接口 ,但它的 出现使HPLC方法可以对强极性、高熔点、低挥发性和热不稳 定性样品进行分析 ,因此逐渐受到法庭科学工作者的青睐。 API技术分为电喷雾电离(ESI) 、大气压化学电离 (APCI),目前 商业化的LC-MS绝大多数使用这两种接口,下面简单介绍这两 种接口的特点。
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液质联用与气质联用的区别
• 气质联用仪(GC-MS)是最早商品化的联用仪器，适 宜分析小分子、易挥发、热稳定、能气化的化合 物；用电子轰击方式（EI）得到的谱图，可与标 准谱库对比。
• 液质联用(LC-MS)主要可解决如下几方面的问题： 不挥发性化合物分析测定；极性化合物的分析测 定；热不稳定化合物的分析测定；大分子量化合 物（包括蛋白、多肽、多聚物等）的分析测定； 没有商品化的谱库可对比查询，只能自己建库或 自己解析谱图。
常用的是基质辅助激光解吸离子 -飞行时间-质谱。目前还有更新的串 联飞行时间质谱技术 。Cri mmins等用 MALD I - T OF MS分析通过二硫 键键合的异二肽 ,得到了二肽及每个单体肽组分的质量。结论是 MALD I T OF MS中的碎裂过程与氨基酸胱氨酸水溶液的光引发均裂有相似之处。 提供了一种指认蛋白中二硫键的简便方法。此方法还适用于对单核细胞 进行直接的化学分析。
目前常用的HPLC-MS联用仪具有两大分类系统，一种是 从MS的离子源角度来划分,包括电喷雾离子(ESI)、 大气压化 学电离(APCI)和基质辅助激光解吸离子化(MALDI)等；另一种 是从MS的质量分析器角度来划分，包括四级杆质谱仪(Q-MS)、 离子阱质谱仪(IT-MS)、飞行时间质谱仪(TOF-MS)、傅立叶变 换质谱仪(FT-MS)。