海洋链霉菌HS-B31发酵条件优化及活性物质分离纯化

摘要
摘要
链霉菌是一类资源丰富的微生物类群，能够产生多种次生代谢产物。

海洋链霉菌在低温，高盐，高压和寡营养的特殊环境中生存，这样的特殊环境使其能产生结构新颖的活性物质。

本研究针对前期筛选得到的一株海洋链霉菌HS-B31，通过对该菌株培养基及培养条件进行优化，增加活性物质的产量，并对发酵液提取物进行分离纯化及初步鉴定，以期发现结构新颖的活性化合物。

研究结果如下：
（1）在原始培养基的基础上，以菌株HS-B31为出发菌株进行摇瓶发酵条件优化。

首先通过单因素实验方法，以发酵上清液的抑菌活性为指标，筛选出最适碳源为玉米淀粉，最适氮源为蛋白胨，复合无机盐为K2HPO4•3H2O，MgSO4•7H2O和CaCO3。

再通过正交试验对上述5个单因子进行配方优化筛选，采用L18(37)正交表，利用极差分析法得到最优培养基组成为：玉米淀粉25.0 g/L，蛋白胨1.0 g/L，K2HPO4•3H2O 0.3 g/L，MgSO4•7H2O 0.3 g/L和CaCO3 0.4 g/L。

最后对菌株HS-B31培养条件进行优化，确定最适发酵条件为初始发酵液pH 7.2，温度28 ︒C，转速220 r/min和发酵时间7 d。

优化后菌株HS-B31发酵产物对金黄色葡萄球菌的抑菌效果提高了29.6%，对副溶血性弧菌的抑菌效果提高了35.1%。

（2）对发酵液中活性物质的热稳定性和酸碱稳定性进行了研究，结果表明活性物质在10～60 ︒C范围内具有良好的稳定性，在pH 3～11范围内具有良好的稳定性。

（3）进一步向菌株HS-B31的发酵液中加入等体积的乙酸乙酯进行萃取，萃取后将有机相经过减压浓缩蒸干后，得到该发酵液的提取物。

利用硅胶柱层析方法对提取物进行分离纯化，得到四个单一组分，即A1，A2，A3和A4。

然后对各个组分进行抑菌活性检测，结果表明组分A1，A2和A3具有抑菌活性，其中A2和A3的抑菌效果明显。

最后对活性组分进行高效液相色谱分析，结果显示纯度都较高。

本研究为下一步中试放大培养及活性组分A1，A2和A3物质结构鉴定奠定了基础。

关键词：链霉菌；发酵；正交试验；抑菌活性；分离纯化
Abstract
Streptomyces are a group of microorganisms, and they can produce a variety of secondary metabolites. The antibiotics isolated from Streptomyces are the most widely used and studied in practice. Marine microorganisms live in a special environment with low temperature, high salt, high pressure and oligotrophic conditions, and such a special environment enabling them to produce novel active substances. In this study, the culture medium and culture conditions were optimized to increase the production of active substances of marine Streptomyces HS-B31, and the extracts of fermentation broth were isolated, purified and preliminarily identified in order to find novel active compounds. The results are as follows:
（1）On the basis of the original medium, the strain HS-B31 was used as the original strain for shaking flask fermentation. Firstly,the antimicrobial activity of fermentation broth was taken as the index, and the composition of the medium was selected by single factor experiment. The optimal carbon source was corn starch, the optimal nitrogen source was peptone, and the compound inorganic salts were K2HPO4•3H2O, MgSO4•7H2O and CaCO3. The above five single factors were optimized by orthogonal test. The L18 (37) orthogonal table was used to obtain the optimal medium composition by the range analysis method. The results showed that the optimized medium were corn starch 25 g/L, peptone 1 g/L, K2HPO4•3H2O 0.3 g/L, MgSO4•7H2O 0.3 g/L and CaCO3 0.4 g/L. As a result, the antimicrobial activity of fermentation products of strain HS-B31 against Staphylococcus aureus increased by 29.6%, and the antimicrobial activity of fermentation products of strain HS-B31 against Vibrio parahaemolyticus increased by 35.1%.
（2）On the basis of optimized media, the culture temperature of the strain HS-B31, the initial pH of the medium and the fermentation time were optimized by single factor experiment method. The optimal fermentation conditions were obtained as follows: initial fermentation broth pH 7.2, temperature 28 C, rotation rate 220 r/min, fermentation time 7 days. Then the thermal stability and acid-base stability of the antibacterial active substances
were studied. The results showed that the antibacterial active substances had good stability at pH 3~11, and had good stability at 10~60 C.
（3）The fermentation broth of the strain HS-B31 was extracted with ethyl acetate, and the organic phase was concentrated to dryness under reduced pressure, and then dissolved with a small amount of methanol to obtain the extract of the fermentation broth. Tricine-SDS-PAGE analysis of the crude extract showed that the molecular weight of the crude extract of strain HS-B31 was less than 3.3 kDa. Four components A1, A2, A3 and A4, were separated from the extract of strain HS-B31 by TLC and column chromatography. The bacteriostasis experiments were carried out on four components by the filter paper method with Vibrio parahaemolyticus as indicator bacteria. The results showed that the components A1, A2 and A3 had antibacterial activity,and the effects of A2 and A3 were obvious. This study laid a foundation for further pilot fermentation and structural identification of active components A1, A2 and A3.
Key words: Streptomyces; fermentation; orthogonal test; antibacterial active; separation and purification
目录
摘要 (I)
Abstract (II)
第一章绪论 (1)
1.1 放线菌概述 (1)
1.1.1 关于放线菌 (1)
1.1.2 常见放线菌种类 (1)
1.1.3 放线菌主要分布 (2)
1.2 海洋链霉菌活性次级代谢产物 (4)
1.2.1 (4)
1.2.2 萜类 (5)
1.2.3 大环内酯类 (6)
1.2.4 聚酮类 (7)
1.2.5 聚肽类化合物 (8)
1.3 微生物次级代谢途径 (8)
1.3.1 聚酮途径 (9)
1.3.2甲羟戊酸途径 (9)
1.3.3 莽草酸途径 (10)
1.3.4 外源添加前体和抑制剂对次级代谢产物的调控 (11)
1.3.5 基因的调控对次级代谢产物的影响 (12)
1.4 次级代谢产物产量提高的方法 (12)
1.4.1 培养基优化 (12)
1.4.2 发酵培养条件控制 (13)
1.5 活性物质的提取方法 (13)
1.5.1 有机溶剂提取法 (13)
1.5.2 大孔树脂吸附法 (14)
1.5.3 硅胶柱层析法 (14)
1.5.4 高效液相色谱法 (14)
1.6 本课题研究及技术路线 (15)
1.6.1 研究内容 (15)
1.6.2 技术路线 (16)
第二章材料与方法 (17)
2.1 实验材料 (17)
2.1.1 供试菌株 (17)
2.1.2 实验药品与试剂 (17)
2.1.3 实验仪器与设备 (18)
2.1.4 主要培养基 (19)
2.2 菌株HS-B31发酵培养 (20)
2.2.1 菌株培养条件 (20)
2.2.2 菌种保藏方法 (20)
2.2.3 染色及形态观察方法 (20)
2.3 培养基优化方法 (21)
2.3.1 抑菌试验方法 (21)
2.3.2 单因素优化实验 (21)
2.3.3 正交试验设计 (22)
2.4 培养条件优化方法 (22)
2.4.1 培养温度测定 (22)
2.4.2 初始pH测定 (22)
2.4.3 发酵时间选择 (23)
2.5 活性物质稳定性研究 (23)
2.5.1 pH稳定性测定 (23)
2.5.2 热稳定性测定 (23)
2.6 活性物质的分离纯化 (23)
2.6.1 有机溶剂萃取条件 (23)
2.6.2 薄层层析方法 (24)
2.6.3 硅胶柱层析方法 (24)
2.6.4 高效液相色谱检测条件 (25)
第三章结果与讨论 (27)
3.1 菌株HS-B31发酵及形态观察 (27)
3.2 单因素选择结果 (28)
3.2.1 碳源筛选结果 (28)
3.2.2 氮源筛选结果 (29)
3.2.3 无机盐筛选结果 (30)
3.3 正交试验结果 (31)
3.4 培养条件优化结果 (32)
3.4.1 初始pH确定 (33)
3.4.2 发酵温度确定 (33)
3.4.3 发酵时间确定 (34)
3.5 活性物质稳定性研究结果 (35)
3.5.1 热稳定性分析 (35)
3.5.2 酸碱稳定性分析 (36)
3.6 优化前后抑菌效果比较 (38)
3.7 发酵液提取结果分析 (39)
3.8 提取物薄层色谱分析 (39)
3.9 提取物硅胶柱层析分离 (40)
3.10高效液相色谱分析 (42)
第四章结论 (44)
第五章展望 (45)
参考文献 (46)
硕士期间论文发表情况 (49)
致谢 (50)
第一章绪论
1.1放线菌概述
1.1.1关于放线菌
放线菌是一种原核生物，具有较强的陆地特征和丰富的资源。

菌丝在固体培养基上径向生长，并且增殖是以孢子的形式增殖[1]。

它是一种具有重要经济价值和生物研究价值的微生物资源[2]。

放线菌可以产生抗生素等次级代谢产物，这些次级代谢产物对植物病害的生物防治具有重要作用[3]。

自然界中的放线菌种类多样，即使在高温，高盐和强酸碱的极端环境中也能发现放线菌，其孢子或菌丝是最常见的，但也有可能以其他方式存在[4]。

放线菌的栖息场所也多种多样，土壤是最重要的一种栖息，放线菌所产的次级代谢产物大多数具有其特别的泥泞味道。

目前研究所发现的大多数不同种类的放线菌也是从土壤中分离出来的。

随着研究的不断扩大和深化，单纯依靠土壤环境所发现的放线菌远远不能满足研究和生产的需要[5]。

因此，海洋放线菌，植物内生放线菌和极端环境放线菌的发现也取得了越来越大的进展[6]。

放线菌具有丰富的种类，到目前为止在生物防治中常见的有链霉菌（Streptomyces），诺卡氏菌（Nocardia），小单孢菌（Micromonospora）和链孢囊菌（Streptosporangium）等[7]。

1.1.2常见放线菌种类
（1）链霉菌
在已发现的链霉菌属放线菌中，很大一部分生长在含水量低，通气良好的土壤中，少部分存在于淡水和海洋中。

研究显示，到目前为止已发现的抗生素中由放线菌产生的抗生素占所有抗生素的60%以上，其中由链霉菌产生的抗生素占了放线菌产抗生素的90% [8]。

链霉菌的次级代谢产物有链霉素，土霉素，制霉菌素和井冈霉素等，制霉菌素可以抗真菌，井冈霉素可以有效防治水稻纹枯病。

链霉菌液在生物防治中有重要作用，可以用于农业植物病害防治[9]。

例如：陈杰等[10]筛选得到的多产色链霉菌
(S.polychromogenes)对马铃薯土传病原真菌具有显著的抑制效果。

（2）诺卡氏菌
诺卡氏菌属放线菌大部分分布在土壤中，其中主要为好气性腐生菌，仅有一部分为厌气性寄生菌，诺卡氏菌属可以吸收多种碳水化合物，有的甚至可以利用碳氢化合物和纤维素等。

据报道，现在已经发现了100余种诺卡氏菌，这些诺卡氏菌能产生的抗生素有30多种。

例如：通常用于医学治疗的利福霉素，以及对植物白叶枯病致病细菌有明显抑制作用的间型霉素等[4]。

（3）链孢囊菌
链孢囊菌属放线菌最重要的特征是能够形成孢囊和孢囊孢子，链孢囊菌属只有少量的十几种，其中一些种属可以产生抗生素，且产生的抗生素具有广谱抑菌活性。

例如：粉红链孢囊菌能够产生多霉素，多霉素在抑制细菌和病毒等方面有重要作用，绿灰链孢囊菌能够产生绿菌素，绿菌素在抑制细菌，霉菌和酵母菌等方面都有显著作用[4]。

（4）小单孢菌
小单孢菌属放线菌最重要的栖息地是土壤和湖底泥土中，也存在于堆肥的厩肥中，大部分为好气性腐生菌，通常情况下可以利用氮化物。

据报道，现在已经发现的有约30多种，其中大部分可以产生如庆大霉素等的多种抗生素，具有很不错的潜力。

1.1.3放线菌主要分布
自青霉素被发现以后，迄今为止已经有23000多种天然产物被人们发掘，其中超过60%的天然产物都发现于放线菌的代谢产物，其中的一部分已经应用于生产实践中[11]。

通常情况下，微生物的天然次级代谢产物经过一些化学修饰后可以作为药物[12]，甚至有些微生物天然次级代谢产物不经过任何的化学修饰就可以作为药物[13]。

在1940年发现链霉素后[14]，世界各地的药物制造商基本上都开始从次级代谢产物中寻找新的活性药物前体[15]，希望能够寻找到新药[16]。

根据生存环境的差异可将放线菌分为土壤放线菌，植物内生放线菌和海洋放线菌[17]。

（1）土壤放线菌
迄今为止，研究人员已从土壤中筛选出多种放线菌，其中大部分都具有生物活性。

在早期天然产物的的筛选过程中，土壤链霉菌最为重要。

研究人员从中筛选出很多的活性化合物，其中的一些成为了早期药物的前体[13]。

随着时间的推移，人们加深了土壤放线菌资源在世界各地的不同种类的研究，发现
由于频繁的物种之间的基因交换，相同的抗生素很容易再发现，而一个新的化合物是挖掘所需的周期也越来越长，困难是变得越来越大[13]。

由于科学技术的进一步发展，对于以往难以分离培养的放线菌，学者们更改了它们的培养环境，使它可以被分离培养。

如卡毕斯特制药公司使用巨大的海藻酸钙球作为发酵容器，筛选出了数万种放线菌。

另外，因为基因测序技术的进步，研究人员通过激活放线菌中沉默的基因簇，得到原本在放线菌中很少表达的产物[18]。

（2）植物内生菌
植物组织中含有许多可以互利共生的微生物。

这些微生物在生长过程中，它们随着自然环境的不断变化而进化。

因此这些微生物的次级代谢产物与土壤放线菌的次级代谢产物具有不同的结构和功能。

中国国土面积大，具有很多种的野生植物种类。

所以，在中国可以从不同地方的植物中提取内生菌，再从这些菌的次级代谢产物中寻找具有活性的新型化合物[19]。

紫杉醇就是一个很好的例子，它是一种在内生植物次生代谢产物中发现的抗癌药物。

紫杉醇最初是从红豆杉的树皮中分离得到的，但是树皮中的紫杉醇含量较低不能满足需求，因此研究人员将目光转向微生物，并成功筛选出能产生紫杉醇的放线菌。

近年来，随着科学技术的进一步发展，更多的植物内生菌被筛选发现，这些植物内生菌的次级代谢产物包含生物碱，甾体和萜类化合物[20]。

（3
地球面积中70%使海洋。

海洋中含有大量丰富的微生物资源。

但是，因为海洋高压，厌氧甚至酸蚀的特殊环境，海洋中的微生物很难被开发出来。

正因为这样的特殊环境使海洋微生物与陆地微生物有很多不同，可能会产生新型结构的活性化合物。

迄今为止，从海洋放线菌产生的次级代谢产物包括聚酮，脂肪酸，生物碱，多肽，类固醇，萜类，糖苷和各种结构类型的其他化合物。

这些次级代谢产物具有多种活性，如抗癌，抗菌和抗氧化。

例如从深海放线菌株Streptomyces strain CNQ-418的次级代谢产物中分离得到6个吡咯类化合物，其对耐甲氧苯青霉素金黄色葡萄球菌（Menthicillin-resistant Staphylococcus aureus）的増长有显著抑制作用[21]。

1.2海洋链霉菌活性次级代谢产物
链霉菌属是中最重要的一个放线菌属，具有产生多种具有生物活性的次生代谢产物的能力。

链霉菌具有巨大的合成活性物质的潜力，是其他微生物无法比拟的。

链霉菌资源的多样性，吸引了许多学者去探索发现[22]。

海洋链霉菌能够产生多种类型的次级代谢产物，依据各个类型的结构不同可以大致分为以下这几类：
1.2.1醌类
醌类化合物是天然产物中相对重要的一类活性成分，它们是天然有机化合物，具有不饱和环三酮结构（醌式结构）或容易转变成这样结构的化合物[23]。

大多数醌类化合物都是非芳香的化合物，具有颜色，都含有α，β-不饱和酮。

天然醌类化合物主要分为四类：苯醌，萘醌，菲醌和蒽醌[24]。

醌类化合物具有多方面的生物活性，包括止泻作用，抗菌作用，止血作用，抗肿瘤作用，对异常高的免疫反应有强烈的拮抗作用[25]。

海洋链霉菌富含的醌类化合物都具有较高的生物活性[26]。

从毛里求斯海岸淤泥中发现的海洋链霉菌Streptomyces sp.6921能够产生糖苷类化合物Himalomycins A，该化合物是蒽环类抗生素的前体，具有蒽醌结构发色团，这样的结构使该化合物具有细胞毒活性[27]，如图1-1所示。

图1-1 醌类化合物
Figure 1-1 Quinones compounds
1.2.2萜类
萜类化合物是碳氢化合物的一个非常大的分支，并且作为几乎每个生物体中的生物合成的模块化单元存在，在生物合成方面，萜类化合物由分子式为C5H8的异戊二烯衍生而来，均为具有多个异戊二烯单元的烃类和含氧衍生物。

通常情况下萜类化合物根据分子结构中异戊二烯单元的数量进行分类，如单萜（香叶醇），倍半萜（金合欢醇），二萜（植物醇）等[28]。

萜类化合物包括类胡萝卜素，类胡萝卜素被应用生产实践中。

来源于阿拉斯加海岸沉积物中的海洋链霉菌Streptomyces sp. NPS008187能够合成新的吡咯并半倍萜化合物Glyciapyrroles B，这类化合物具有抗细菌活性，如图1-2所示。

图1-2 萜类化合物
Figure 1-2 Terpenoids compounds
1.2.3大环内酯类
1950年从链霉菌菌株中分离出第一种大环内酯类抗生素。

大环内酯类抗生素的名称来源于大环内酯环，大多是大环内酯含有氨基糖和中性糖部分，连接在内酯环上。

根据环的大小分为14，15，16元环大环内酯类抗生素[29]。

最著名14 元大环内酯类抗生素是红霉素，从赤链霉菌中分离出来[30]。

阿奇霉素是15元环大环内酯类抗生素[31]。

麦迪霉素及其衍生物是16元环大环内酯类抗生素[32]。

大环内酯类抗生素在微生物合成的量非常少，其中红霉素的产量相对较高，最适合工业发酵生产[33]。

海洋链霉菌Streptomyces sp. M491能够产生Chalcomycin，海洋链霉菌Streptomycete sp.B7064可以合成Chalcomycin B，这类化合物具有抗细菌活性[34]，如图1-3所示。

1.2.4聚酮类
聚酮化合物是由低级羧酸的连续缩合反应合成，在细菌，真菌和植物中产生的一大类天然产物。

它包括大量的具有抑制细菌(如红霉素和四环素)，真菌(如灰黄霉素和两性霉素)，寄生虫(如Avermectin和奈马克丁)，癌症(如多柔比星和Enediynes)等活性的化合物，一种活性化合物真菌聚酮，还具有免疫抑制剂的活性。

它被普遍的应用于生活实践的各个领域[35]。

聚酮作为一种天然产物，具有复杂的功能和多样化的结构。

它们的合成包括一系列酰基辅酶A活化的羧酸的醛缩反应，形成一定长度的聚酮链骨架，然后环化或芳构化或与脱氧糖等结构单元连接。

虽然聚酮化合物的结构和特性变化很大，各不相同，但一般来说它可以分为两大类：芳香族聚酮化合物和复合聚酮化合物。

大多数聚酮类化合物在制药工业中发挥着重要作用，海洋链霉Streptomyces strain CNQ-08 能够产生Daryamides A，这类化合物能够抑制HCT-116细胞系[36]，如图1-4所示。

图1-3 大环内酯类化合物Figure 1-3 Macrolactones compounds
图1-4 聚酮类化合物
Figure 1-4 Polyketide compounds
1.2.5聚肽类化合物
肽类化合物都是含有肽键的链状分子，肽键是由氨基酸的胺基(-NH2)和羧基(-COOH)经过脱水缩合反应形成。

大部分肽类化合物都有一定的活性，例如Cyclomarin A是由海洋链霉菌产生的活性化合物，具有抗炎症的活性[37]。

Salinamides A是由菌株Streptomyces B-091产生的，它具有不错的抗细菌活性[38]，如图1-5所示。

图1-5 聚肽类化合物
Figure 1-5 Polypeptides compounds
1.3微生物次级代谢途径
次级代谢产物是由微生物在发酵中后期产生的对微生物生长不是必须的一类小分子活性物质，但这类次级代谢产物在人类生产实践过程中有重要影响。

一般情况下，微生物在营养过剩的环境中会大量生长，长期处于对数生长期，只有当微生物过渡到稳定期或者环境中营养不足时，才会产生次级代谢产物[39]。

次级代谢产物有多种形成途径，常见的有莽草酸途径，甲羟戊酸途径，聚酮途径和混合生源途径。

混合生源途径是指在一个微生物的次级代谢产物形成过程中可能有两种或者多种途径共存。

1.3.1聚酮途径
聚酮化合物是微生物常见的一类次级代谢产物，具有多种结构。

许多聚酮化合物可以作为药物应用在生产实践中，如红霉素和四环素（抗细菌），柔红霉素和埃博霉素（抗癌），雷帕霉素（免疫抑制剂），洛伐他汀（抗高胆固醇）。

这些聚酮化合物虽然在结构上有些差异，但合成途径基本相同。

聚酮化合物都是通过克莱森酯缩合反应来延长化合物的碳链，莱森酯缩合反应是指由简单的丙二酸酯前体和酰基硫代酯发生缩合反应。

1.3.2甲羟戊酸途径
甲羟戊酸途径指由乙酰辅酶A开始经过一系列酶促反应，生成异戊二烯焦磷酸和二甲烯丙基焦磷酸的过程。

由乙酰辅酶A在HMG-CoA合酶作用下合成3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A，再在HMG-CoA还原酶作用下生成甲羟戊酸，再在甲羟戊酸激酶作用下生成5-甲羟戊酸磷酸，接着在磷酸甲羟戊酸激酶作用下合成5-甲羟戊酸焦磷酸，再在5-焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶作用下生成异戊二烯焦磷酸，再在异戊二烯焦磷酸异构酶作用下生成二甲烯丙基焦磷酸。

整个过程中最重要的限速酶是HMG-CoA还原酶，甲羟戊酸激酶是整个过程中的第二重要的酶。

细胞中缺少异戊二烯焦磷酸时，HMG-CoA还原酶的基因被激活，还有一些机制也可以增加HMG-CoA还原酶的活性。

限速酶也都受到其合成产物的反馈抑制[40]，如图1-6所示。

1.3.3莽草酸途径
微生物借助莽草酸途径来生成初级代谢中必须的芳香族氨基酸，维生素K ，辅酶Q 等芳香类化合物，若微生物缺少莽草酸途径中的某一基因或者因为其他原因到这莽草酸途径无法正常进行时，微生物就无法存活。

莽草酸途径是指将4-磷酸赤藓糖和磷酸烯醇式丙酮酸转化为分支酸的过程。

由葡萄糖进过不同途径生成4-磷酸赤藓糖和磷酸烯醇式丙酮酸，再在酶作用下生成3-脱氧-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸，再在酶作用下生成3-脱氢奎尼酸，再在酶作用下生成3-脱氢莽草酸，再在酶作用下生成莽草酸，再在酶作用下生成莽草酸-3-磷酸，再在酶作用下生成5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸，最后在酶作用下生成分支酸。

分质酸可以作为前体合成芳香类化合物。

整个途径由7种酶催化反应的进行，每种酶都受到其合成产物的反馈抑制
[41]。

莽草酸途径如图1-7所示。

图1-6甲羟戊酸途径 Figure 1-6 Mevalonate pathways
图1-7莽草酸途径
Figure 1-7 Shikimate acid pathways
1.3.4外源添加前体和抑制剂对次级代谢产物的调控
微生物的次级代谢需要必须的酶以及一些小分子化合物，这类化合物就称为前体。

不同的微生物的次级代谢途径需要不同的前体，增加前体的量可以促进次级代谢反应向次级代谢产物的方向进行。

对于次级代谢过程所需的酶，尤其是某些步骤的限速酶来说，添加抑制剂可以有效的限制次级代谢途径中某些步骤的反应速度，从而降低次级代谢产物的产量。

这两种方法对控制次级代谢产物表达量的增加或减少有非常好的效果[42]。

1.3.5基因的调控对次级代谢产物的影响
微生物的次级代谢对微生物本身的生长没有影响，次级代谢是微生物对环境变化等因素的应答，控制微生物次级代谢过程的基因在微生物生长期是沉默不表达的，微生物到了稳定期之后这些基因才会进行表达[43]。

随着科学技术的发展，学者对某些次级代谢过程中的基因做了很好的研究，通过基因改造等手段使某些基因大量表达，从而增加了次级代谢产物的产量，也可以通过降低某些抗性基因的表达，增加微生物对次级代谢产物的耐受性，减少反馈抑制，从而增加次级代谢产物的产量[44]。

1.4次级代谢产物产量提高的方法
次级代谢是指微生物在生长稳定性产生的一类小分子活性物质。

微生物可以产生多种次级代谢产物，主要有抗生素类，生长激素，维生素类，色素类，生物碱和毒素类等[45]。

可以通过培养基优化，发酵培养条件优化和代谢调控等方法增加微生物次级代谢产物产量。

1.4.1培养基优化
微生物生长需要碳源，氮源，微量元素，维生素和氨基酸等，不同的微生物所需要的成分不同。

同种微生物在菌体生长过程和次级代谢过程中所需的营养也有差异。

通常根据培养基作用的不同分为种子培养基和生产培养基，种子培养基主要用于微生物菌体生长阶段，生产培养基主要用于菌体稳定期次级代谢阶段。

生产实践中最常用的培养基是复合培养基，复合培养基的成分比较复杂，包含多种来源的复合物。

其优点是成本较低，营养成分充足，可以保证大部分微生物的生长，缺点是成分难以定性定量，不方便规模化，并且对次级代谢产物的加工有影响。

随着对科学技术的发展，出现了合成培养基，合成培养基的优点有成分明确清晰，方便大规模生产，利于发酵过程中的控制及下游处理，缺点是成本比复合培养基高[46]。

培养基的优化过程一般为先采用单因素试验法，依次选择最适的碳源，氮源，微量元素等，再采用正交实验设计，Plackett-Burman设计和响应面法等研究各因素之间相互作用，筛选出显著影响因素，最终确定出最佳培养基组成。

1.4.2发酵培养条件控制
微生物发酵过程中，不只受到培养基的影响还受到各种环境因素的影响。

通过了解分析发酵过程中各个因素对微生物菌体生长及次级代谢过程的影响，可以经过调控这些因素的变化来更好地掌控微生物的菌体生长及次级代谢产物积累。

最主要的培养条件包括温度，转速，pH值等[47]。

在微生物的菌体生长阶段和次级代谢阶段的最适温度一般是不同的。

培养温度的变化会影响菌体的代谢，正常来说温度升高，酶活性增加，菌体的生长变快，会较快进去生长稳定期，但温度过高菌体会老化，导致次级代谢产物产量降低。

因此，可以通过分阶段的温度来控制菌体生长和次级代谢阶段。

优化生长，提高次生代谢产物的产量。

pH在微生物菌体生长阶段和次级代谢阶段都有重要的影响。

pH对很多酶促反应的限速酶都有很大影响，甚至影响微生物次级代谢产物的种类。

因此在不同阶段确定不同的最适pH对微生物生物量的增加及次级代谢产物的积累都极为重要。

对好氧微生物和兼性好氧微生物来说，氧气的含量在微生物菌体生长阶段及次级代谢阶段可能有着不同的需求。

一般微生物菌体生长阶段需要足够的氧气来保证菌体生长，但在次级代谢阶段氧气量的不同可能导致次级代谢产物的不同，因此需要根据实验目的来合理控制氧气的供应。

1.5活性物质的提取方法
1.5.1 有机溶剂提取法
有机溶剂提取法[48]也称为萃取法，原理是依据溶液中各个成分在不同极性的溶剂中的溶解程度不同将物质分离出来的方法。

首先判断活性成分在哪种溶剂中溶解度比较大，将这种溶剂加入发酵液中，置于磁力搅拌器上充分混匀，使活性成分尽可能的溶解到所选溶剂中，而不需要的成分留在发酵液中的方法。

根据相似相溶原理，利用不同成分在互不相溶的两种溶剂里溶解度的差异，用一种溶剂把活性成分从发酵液中提取出来[49]。

当溶剂加到发酵液中时，通过不断的搅拌混匀，直至两种溶剂中溶液浓度达到动态平衡后，使用分液漏斗将两种溶剂分离开，如果活性成分还没有完全提取出来，继续多次加入新溶剂，就可以把活性成分近于完全溶出或大部溶出。

在萃取中，如果两相溶剂中各组分的分配系数差异较大，则分离效率会更高。

若发。