巴马小型猪主要细胞因子的克隆及序列分析

巴马小型猪主要细胞因子的克隆及序列分析
李连峰;姜骞;林欢;李红;刘家森;郭东春;原冬伟;崔玉东;曲连东
【摘要】为了丰富广西巴马小型猪细胞因子生物学数据,本试验采取广西巴马小型猪的外周血,分离淋巴细胞,提取总RNA,利用设计的引物进行RT-PCR扩增,将克隆
出的与目的基因大小相符的片段回收,再与T载体连接,转化到大肠杆菌DH5α中,
筛选阳性克隆,将重组菌测序后提交NCBI,比较克隆序列与已知序列的同源性,并利
用软件对克隆序列进行分析.结果表明,已克隆出的巴马小型猪细胞因子IL-2、IL-12、IFN-γ、TNF-α基因序列长度分别为338、377、380、402 bp,测序结果均与目
的基因预期估计值吻合.序列分析结果发现与已知的家猪或野猪的相应基因同源性
较高,IL-2、IL-12、IFN-γ、TNF-α序列同源性分别为98.9％、99.5％、99.2％、100％.研究巴马小型猪细胞因子基因序列不仅丰富了生物学数据,而且为细胞因子
的功能研究提供了依据,也为细胞因子的定量检测奠定了基础.%In order to enrich the cytokine biological data of Guangxi Bama miniature pig, the lymphocytes of Bama miniature pig was separated from peripheral blood and the total RNA was extracted from the peripheral blood lymphocytes, respectively. The target genes of cytokine were amplified by RT-PCR and cloned into pMD18-T vector and transformed into E. Coli DH5a, respectively. We chose positive clones and submitted them to the NCBI after sequencing the recorabinant strain. Comparing homology of the cloned sequence with the known sequence, and using the software to analysis the cloned sequence. The results showed that the gene length of cloned cytokines IL-2, IL-12, IFN-γ, TNF-α of Bama miniature pig were 338, 377, 380, 402 bp,respectively. It was consistent with the expected length of
target gene. The sequences analysis showed that the homology of the cloned genes was relatively high with known domestic pigs or wild boars. The sequence homology of IL-2, IL-12, IFN-γ,TNF-α were 98. 9%, 99.5%, 99.2%, 100%, respectively. The research on cytokine gene sequence of Bama miniature pigs not only enriched the biological data of Bama miniature pigs, but also laid the foundation for research of the cytokine function. It also provided the basis for the quantitative detection of cytokine.
【期刊名称】《中国畜牧兽医》
【年(卷),期】2012(039)011
【总页数】6页(P56-61)
【关键词】巴马小型猪;细胞因子;克隆;序列分析
【作者】李连峰;姜骞;林欢;李红;刘家森;郭东春;原冬伟;崔玉东;曲连东
【作者单位】黑龙江八一农垦大学动物科技学院,黑龙江大庆163319;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江哈尔滨150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江哈尔滨150001;黑龙江八一农垦大学动物科技学院,黑龙江大庆163319;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江哈尔滨150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江哈尔滨150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江哈尔滨150001;黑龙江八一农垦大学动物科技学院,黑龙江大庆163319;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江哈尔滨150001
【正文语种】中文
【中图分类】Q785
细胞因子是由免疫细胞及相关细胞产生的一类多功能蛋白质多肽分子，其种类繁多，有白细胞介素（interleukin，IL）、干扰素（interferon，IFN）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）等。

细胞因子可发挥免疫调节、抗病毒、介导
炎症反应和造血等多种生物学功能（杨汉春等，2003）。

CD4＋TH细胞经抗原刺激后可进一步分化为TH1和TH2。

TH1细胞分泌IL－2、IL－12和IFN－γ等是
介导细胞免疫的主要效应因子（Wulf等，2009；Yamamoto等，2009）。

TH2细胞产生IL－4、IL－10和 TNF－α等，主要调节体液免疫反应（郑洁等，2003）。

IL－2主要由CD4＋T细胞（TH1）产生，是引起T细胞增殖分化的主
要细胞因子，也是最早发现的具有广泛活性的细胞因子，参与免疫应答的调节（Allen等，1990；Flexner等，1987）。

IL－12主要由巨噬细胞和B细胞产生，已经证明IL－12诱导TH1型免疫应答在细菌或病毒感染控制中发挥重要作用（Trinchieri等，1995），可引起 IFN－γ的生成（Chan 等，1991）。

IFN
－γ是由TH1型淋巴细胞和NK细胞产生的一种很重要的细胞因子，与病毒感染
的防护和清除有关，IFN－γ通过调节一些参与抗原加工、递呈的重要辅助分子的
表达来调节免疫应答（Boehm等，1997）。

TNF－α主要由活化的单核巨噬细胞产生，参与机体防御反应，是重要的促炎症因子和免疫调节分子。

20世纪80年代初，中国开始对小型猪资源进行调查和实验动物化研究，主要集
中在研究人类重大疾病，建立了许多动物模型（吴艳花等，2010）。

但是，用于
猪病的研究报道还很少，因此很有必要构建研究猪病的小型猪实验动物模型。

广西巴马小型猪呈两头乌、毛色整齐的封闭群，作为实验动物，具备体型矮小、性成熟
早、遗传性稳定（Chen等，2003；Wu等，2002）、繁殖性能强、性情温驯等优势。

由于巴马小型猪的很多生物学数据仍不明确，为了搞清楚巴马小型猪细胞因子的生物学信息，以及在基因水平与家猪是否存在差异，开展了本研究。

1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验材料封闭群广西巴马小型猪的血液组织由哈尔滨兽医研究所实验动物研究室提供。

1.1.2 试验试剂淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物制品科技有限责任公司；M－MLV反转录酶、dNTP Mixture、RNase抑制剂、随机引物（6mer）、EX Taq HS 酶、pMD18－T 载体、限制性内切酶XbaⅠ和SalⅠ均购自TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司；DNA胶回收纯化试剂盒、质粒小量提取试剂盒、总RNA小量制备试剂盒均购自AXYGEN爱思进生物技术（杭州）有限公司。

1.2 方法
1.2.1 引物设计与合成参照Spagnuolo－Weaver等（1999）、Shi等（2010）发表的文章，根据 GenBank中登录的IL－2、IL－12、IFN－γ、TNF－α基因设计引物，引物序列见表1。

引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

表1 引物设计基因引物序列（5′→3′）片段大小（bp） GenBank登录号IL －2 F：GATTTACAGTTGCTTTTGAA 338 X56750 R：GTTGAGTAGATGCTTTGACA IL－12 F：GATGCTGGCCAGTACACC 377
U08317 R：TCCAGCACGACCTCAATG IFN－γ F：CAGCTTTGCGTGACTTTGTG 380 X53085 R：GATGAGTTCACTGATGGCTTT TNF－α F：CGTTGTAGCCAATGTCAAAGCC 402 X54859 R：TGCCCAGATTCAGCAAAGTCCA
1.2.2 淋巴细胞总RNA提取及反转录巴马小型猪前腔静脉采血5mL，放于肝素钠
抗凝管中备用。

无菌将1份抗凝血与1份灭菌PBS混匀，将其缓慢的贴壁加入等
体积的猪淋巴细胞分离液中，水平离心机2000r/min离心30min，无菌取中间环状乳白色层淋巴细胞，用灭菌PBS洗，1000r/min离心10min，重复2次，最后将淋巴细胞吸入到无菌的EP管中，直接提取淋巴细胞总RNA。

淋巴细胞总RNA
的提取依据AXYGEN爱思进生物技术（杭州）有限公司的总RNA小量制备试剂
盒提供的方法进行，提取的总RNA经1%非变性凝胶电泳观察RNA的完整性。

RNA反转录体系：总RNA6μL，随机引物（6mer）1μL，5×M－MLV Buffer
2μL，dNTP（Mix 10mmol/L）0.5μL，MMLV 酶（200U/μL）0.25μL，RNase 抑制剂（40 U/μL）0.25μL；反转录程序：30 ℃ 10min，42 ℃60min，
70℃15min。

反转录产物于－20℃保存。

1.2.3 细胞因子 RT－PCR扩增取反转录产物3μL，上、下游引物（10pmol/L）
各1μL，10×Buffer 2.5μL，dNTP 2.5μL，Ex Taq HS 0.2μL，ddH2O 14.8μL。

反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。

PCR产物在2%琼脂糖凝胶中电泳观察结果。

1.2.4 细胞因子的克隆 RT－PCR产物的回收提纯按照AXYGEN爱思进生物技术（杭州）有限公司DNA胶回收纯化试剂盒说明书提供的方法进行。

纯化后目的产物5μL，SolutionⅠ4.5μL，T载体0.5μL，用封口膜密封后16℃连接过夜，获得重组质粒。

将重组质粒转化到E.coli DH5α中，Amp抗性LB固体培养基筛选阳
性菌落，挑取单克隆37℃培养。

1.2.5 重组质粒酶切鉴定重组质粒提取按AXYGEN爱思进生物技术（杭州）有限
公司的质粒提取小量制备试剂盒提供的方法进行。

酶切10μL体系：重组质粒4μL，10×T Buffer 1.5μL，XbaⅠ和SalⅠ各0.5μL，灭菌ddH2O 3.5μL，37℃3h。

酶切产物在2%琼脂糖凝胶中电泳观察结果。

1.2.6 测序及序列分析将酶切鉴定正确的阳性菌，取1mL送于上海英骏生物技术
有限公司测序。

测序结果通过DNAStar软件进行分析，研究细胞因子在基因水平上的差异，找出碱基突变或缺失的地方，并分析氨基酸的变化情况。

1.2.7 同源性分析登录GenBank中下载同一种属猪（家猪、野猪）及不同种属动物（人、犬、猫、牛、马）的IL－2、IL－12、IFN－γ、TNF－α这4种细胞因子的基因序列，再通过软件Meg Align与测序所得的基因序列分别进行比对。

2 结果与分析
2.1 总RNA电泳分离巴马小型猪淋巴细胞，提取总RNA，取5μL总RNA，加
4μL DEPC水，混于1μL 10×Loading Buffer，经非变性琼脂糖凝胶电泳，可见
28S、18S两条带明亮，证明提取的总RNA比较完整，质量较高，符合试验要求（图1）。

图1 总RNA的非变性琼脂糖凝胶电泳图
2.2 巴马小猪细胞因子RT－PCR扩增以巴马小猪外周血淋巴细胞总RNA为模板，按照特异引物进行RT－PCR扩增，在250～500bp之间能扩增出明显的条带，与预期值338、377、380、402bp基本吻合（图2）。

图2 IL－2、IL－12、IFN－γ及TNF－α基因的RT－PCR 鉴定图注：M 为
DL2000DNA Marker；1、3、5、7分别为IL－2、IL－12、IFN－γ、TNF－α的阴性对照；2、4、6、8为IL－2、IL－12、IFN－γ、TNF－α的扩增产物。

2.3 巴马小猪细胞因子重组质粒酶切鉴定分别提取重组质粒后，用XbaⅠ和SalⅠ进行双酶切鉴定，酶切产物电泳出现预期大小的目的片段和pMD18－T载体两个条带（图3）。

2.4 巴马小型猪细胞因子测序结果分析将酶切鉴定的阳性菌，由上海英骏生物技
术有限公司进行测序，得到细胞因子cDNA序列。

测序结果通过DNAStar软件进行分析，巴马小猪IL－2、IL－12、IFN－γ、TNF－α基因序列长度分别为 338、377、380、402bp，各自编码93、125、127、132个氨基酸。

巴马小型猪细胞
因子IL－2cDNA序列与参考序列（登录号：X56750）相比，有3处碱基突变：70bp处（G－A）相应氨基酸由赖氨酸变为谷氨酸：96bp处（G－A）为同义突
变均为苏氨酸，280bp处（C－G）氨基酸由缬氨酸变为亮氨酸；IL－12cDNA序列与参考序列（登录号：U08317）相比，有2处碱基突变：181bp处（T－C）
色氨酸变为精氨酸，239bp处（C－T）苏氨酸变为异亮氨酸；IFN－γcDNA序列与参考序列（登录号：X53085）相比，339bp处丢失碱基G；TNF－α的序列与参考序列（登录号：X54859）相比，氨基酸无变化。

图3 IL－2、IL－12、IFN－γ及TNF－α基因的重组质粒酶切鉴定图注：M 为
DL2000DNA Marker；1为IL－2；2为IL－12；3为IFN－γ；4为 TNF－α。

2.5 巴马小型猪细胞因子同源性分析
2.5.1 细胞因子IL－2同源性分析与家猪、野猪、猫、犬、牛、马细胞因子IL－2
核苷酸序列、氨基酸同源性分析，结果见表2。

根据软件Meg Align对序列分析
可知，克隆所得的巴马小型猪细胞因子IL－2，与家猪或野猪的核苷酸同源性较高，高达98.9%，与猫、犬等相比同源性较低，低于87%。

在氨基酸水平上，与同种
属猪相比同源性较高，不同种属动物低于77%。

进化树分析结果显示，在进化过
程中，巴马小型猪细胞因子IL－2与家猪、野猪的IL－2氨基酸同源性较高。

除此之外，与犬、猫、马的同源性较低（图4）。

2.5.2 巴马小型猪细胞因子IL－12同源性分析与人、野猪、猫、犬、牛、马细胞
因子IL－12核苷酸序列、氨基酸同源性分析结果见表3。

根据软件Meg Align对序列分析可知，克隆所得的巴马小型猪细胞因子IL－12，与野猪核苷酸同源性高
达99.5%，其次与马的同源性最高。

在氨基酸水平上，与野猪的同源性较高，达
到100%；与人、猫、犬、马同源性较低，低于88%。

进化树分析结果显示，巴
马小型猪细胞因子IL－12与野猪的IL－12氨基酸同源性最高。

除此之外，与牛的同源性较高（图5）。

表2 IL－2核苷酸和氨基酸序列同源性分析（%）IL－2 家猪X58428野猪
AB194099AY294018EU139160EU249805FJ543109NM＿213861X56750猫AY878358犬CFU11689牛EF067918马L06009核苷酸同源性 98.9 98.2 98.9 98.9 98.9 98.6 98.9 98.9 86.8 83.3 85.1 81.5氨基酸同源性97.8 95.7 97.8 97.8 97.8 96.8 97.8 97.8 76.3 71.0 71.0 69.9
图4 IL－2编码氨基酸的进化树分析
表3 IL－12核苷酸和氨基酸序列同源性分析（%）IL－12 人AF180563野猪NM＿214013 SSU08317猫FCU83184犬AF349536牛EU276076马NM＿001082516核苷酸同源性 87.3 99.5 99.5 87.3 75.6 87.5 90.2氨基酸同源性 82.4 100 100 84.8 74.4 85.6 88.0
图5 IL－12编码氨基酸的进化树分析
2.5.3 巴马小型猪细胞因子IFN－γ同源性分析与人、野猪、牛、马细胞因子IFN －γ核苷酸序列、氨基酸同源性分析结果见表4。

根据软件Meg Align对序列分析可知，克隆所得的巴马小型猪细胞因子IFN－γ，与野猪的核苷酸同源性较高，高达99.7%，与人的同源性为75.1%，与牛、马的同源性相比，低于87%。

在氨基酸水平上，与野猪相比同源性最高。

进化树分析结果显示，巴马小型猪细胞因子IFN－γ与野猪IFN－γ的氨基酸同源性最高。

除此之外，与牛的同源性较高（图6）。

表4 IFN－γ核苷酸和氨基酸序列同源性分析（%）IFN－γ人AB451324野猪EU118363AF493993AY293733DQ666352DQ839398DQ913893EU249804GU 433229牛FJ263670马EU000433核苷酸同源性 75.1 99.2 99.7 99.7 99.7 99.5 99.5 99.7 99.5 86.6 81.4氨基酸同源性 59.8 97.6 99.2 99.2 99.2 98.4 98.4 99.2 98.4 76.4 70.1
图6 IFN－γ编码氨基酸的进化树分析
2.5.4 巴马小型猪TNF－α细胞因子同源性分析与人、家猪、野猪、犬、牛细胞因子TNF－α核苷酸序列、氨基酸同源性分析结果见表5。

根据软件Meg Align对
序列分析可知，克隆所得的巴马小型猪细胞因子TNF－α与野猪的核苷酸、氨基
酸同源性最高，均为100%。

与人、犬、牛的核苷酸、氨基酸同源性较低，均低于89%。

进化树分析结果显示，巴马小型猪细胞因子TNF－α氨基酸同源性与家猪、野猪的最高（图7）。

表5 TNF－α核苷酸和氨基酸序列同源性分析（%）TNF－α人HQ201306家猪M29079 X54859野猪EU682384JF831365NM＿214022X57321犬
EU249361牛EU276079核苷酸同源性 87.8 99 100 100 100 100 100 88.8 87.3氨基酸同源性 88.6 100 100 100 100 100 100 87.9 84.8 图7 编码TNF－α氨基酸的进化树分析
3 讨论
本试验参考Spagnuolo－Weaver等（1999）、Shi等（2010）设计特异性引物，以广西巴马小型猪外周血淋巴细胞mRNA为模板，成功扩增和克隆出巴马小猪细胞因子IL－2、IL－12、IFN－γ、TNF－α，大小分别为338、377、380、402bp，扩增出的片段为保守区域，可以用于核苷酸、氨基酸序列同源性分析。

细胞因子作为机体天然免疫的主要效应分子之一，由巨噬细胞、NK细胞等分泌（杨汉春等，2003），介导和调节抵抗非特异性病原微生物免疫应答，免疫效应
在很短时间内启动，由于其具有无抗原特异性和MHC限制的特点，在机体防御机制中具有重要作用。

本试验克隆出的TH1型细胞因子IL－2、IL－12和IFN－γ，主要介导机体的细胞免疫应答，刺激T细胞增殖分化，与病毒或细菌感染的防护
和清除有关。

TH2型细胞因子TNF－α，主要调节体液免疫反应，参与机体防御
反应，是重要的促炎症因子。

无论在天然免疫中，还是在特异性免疫中，细胞因子参与介导、调节体液免疫和细胞免疫，细胞因子的水平可以反映调节体液免疫和细
胞免疫的水平。

本研究通过核苷酸、氨基酸同源性序列分析，结果显示巴马小型猪与家猪、野猪表现较高的同源性，与人、犬、猫、牛、马表现较低的同源性，说明广西巴马小型猪虽然为独特的品种，但其基因仍能稳定地遗传，与家猪的亲缘关系最近，在机体的天然免疫过程中，其细胞因子水平也能反映调节体液免疫和细胞免疫的水平。

中国拥有广西巴马小型猪资源，已建立了巴马小型猪基础群近10个，由于具备体型小、便于应用和与人更接近的生物学特性在医学及药学研究中广泛应用，建立了心血管疾病、糖尿病治疗、异种器官移植等人类重大疾病的动物模型（吴艳花等，2010），是极具潜力的实验动物。

近年来，巴马小型猪也可代替家猪，作为实验动物用于家猪感染性疾病的研究。

本实验室以巴马小型猪作为实验动物建立了猪繁殖与呼吸障碍综合症（PRRS）、猪瘟（CSF）的感染模型（Sun等，2011），成功复制出巴马小型猪感染PRRS、CSF的实验动物模型，并用于PRRS和CSF的研究。

本试验通过核苷酸、氨基酸序列同源性分析，发现巴马小型猪的细胞因子与家猪高度同源，表明巴马小型猪和家猪的体液免疫和细胞免疫的水平相当，这与上述巴马小型猪感染性疾病的研究结果是一致的，揭示出巴马小型猪可作为实验模型动物代替家猪进行感染性试验。

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