多肽

对多肽的认识
一般肽中含有的氨基酸的数目为二到九,根据肽中氨基酸的数量的不同,肽有多种不同的称呼：由两个氨基酸分子脱水缩合而成的化合物叫做二肽，同理类推还有三肽、四肽、五肽等,一直到九肽。

通常由10~100氨基酸分子脱水缩合而成的化合物叫多肽，它们的分子量低于10,000Da（Dalton，道尔顿），能透过半透膜，不被三氯乙酸及硫酸铵所沉淀。

也有文献把由2~10个氨基酸组成的肽称为寡肽（小分子肽）；10~50个氨基酸组成的肽称为多肽；由50个以上的氨基酸组成的肽就称为蛋白质,换言之,蛋白质有时也被称为多肽。

多肽有生物活性多肽和人工合成多肽两种。

生物提取的多肽具有很强的活性，所以叫做活性肽!只有活性的肽才能对人体产生很好的效果!
但是人工合成的多肽有很多是没有活性的，是需要筛选的，只有活性肽才能被人体安全使用! 活性肽是人体极其重要的活性物质，不夸张的说，它的增减对人类的生.老.病.死.具有极其的重要性!
多肽的合成
多肽的化学合成有固相合成和液相合成之分,其主要的区别在于是否使用固相载体。

多肽的化学合成包括液相和固相两种方法。

液相合成方法有BOC和Z两种,固相合成方法现在主要采用Fmoc和Boc两种方法。

液相合成法具有保护基选择多,成本低,易于放大合成规模等优势,但是由于在合成过程中需要对中间体进行提纯,导致操作繁琐且耗时,因此,液相合成法主要用于合成氨基酸个数小于10的多肽。

固相合成方法简便易行,可快速抽滤、洗涤中间体,易实现自动化,一次性合成多肽的氨基酸数可达30个左右。

但直接合成的序列短、所需时间长、合成的效率和纯度低、成本高等，这些问题都限制了多肽固相合成法的应用范围。

多肽的生物合成过程,就是将DNA传递给mRNA的遗传信息,再具体的解译为多肽中氨基酸排列顺序的过程,这一过程也被称为翻译。

生物基因表达一次性得到的多肽量少,不适用于多肽药物的大量生产。

在生物合成多肽方面,除了常用的发酵法、酶解法外,随着生物工程技术的发展,DNA重组技术也被应用于合成多肽。

酶法多肽具有以下优点:酶解不降低蛋白质的营养价值,可获得比原食品蛋白质更多的功能;可保持多肽营养纯天然绿色属性,不含任何化学物质等。

但酶解得到的是一系列多肽,分离纯化难度较大,因此不适于合成单一的多肽。

另外,肽酶的催化具有专一性,因此,寻找合适的肽酶也是该方法的一个难点。

基因工程法合成多肽具有表达定向性强、产品安全卫生、原料来源广泛和成本低等优点,可以得到质量高、疗效好且具有天然活性的多肽类药物,但存在高效表达等技术难题,分离困难,产率低,成本昂贵,难以用于规模生产。

发酵法是从培养的微生物产生的代谢产物中提取多肽的方法。

目前,微生物能够独立合成的聚氨基酸只有聚赖氨酸、聚谷氨酸和聚(L-精氨酸-L-天冬氨酸)(蓝细菌肽)。

发酵法的优点是工业化成本低,但是产物范围窄,且产物提纯复杂。

多肽的应用
目前,多肽的应用主要集中在多肽药物、多肽药物载体、组织工程材料和多肽营养食品等方面。

1、抗肿瘤多肽
肿瘤的发生是多种原因作用的结果，但最终都要涉及及癌基因的表达调控。

不同的肿瘤产生时所需要的酶等调控因子不同，选择特异性小肽作小于肿瘤发生时所需的调控因子等，封闭其活性位点，可防止肿瘤发生。

现在已发现很多肿瘤相关基因及肿瘤产生调控因子，筛选与这些靶点特异结合的多肽，已成为寻找抗癌药物的新热点。

2、抗病毒多肽
病毒感染后一般要经历吸附(宿主细胞)、穿入、脱壳、核酸复制，转录翻译，包装等多个阶段。

阻止任一过程均可防止病毒复制。

最有效的抗病毒药物应该是作用在病毒吸附及核酸复制两个阶段，因此筛选抗病毒药物主要集中在病毒复制的这两个阶段。

病毒通过与宿主细胞上的特异受体结合吸附细胞，依赖其自身的特异蛋白酶进行蛋白加工及核酸复制。

因此可从肽库内筛选与宿主细胞受体结合的多肽或能与病毒蛋白酶等活性位点结合的多肽，用于抗病毒的治疗。

3、多肽药物载体
多肽用作药物载体,既可以用作药物载体的修饰剂,也可以作为药物载体的主要组成部分。

4、组织工程材料
一些不具有生物活性的高分子多肽,如聚天冬氨酸、聚赖氨酸、聚谷氨酸等,由于具有良好的生物相容性、可控生物降解速率、可修饰性、设计的可塑性、结构的可控性等优点,逐渐成为组织工程中极具应用前景的一类新型材料。

5、多肽营养食品
活性肽类食品作为一种新型保健食品或食品添加剂,具有独到的特性和功能,在营养学上也有着许多优点,在食品工业中具有广阔的应用前景。

6、化妆品多肽
三肽是生长因子，四肽有消炎效果，五肽可促进胶原蛋白增加皮肤厚度，六肽是类肉毒杆菌素，可放松皱纹，至于九肽则可阻断促黑激素，有美白效果。

标题：为提高疗效和安全性降低多肽纳米凝胶的敏感性传递抗肿瘤药物。

纳米凝胶是由亲水性或两亲性高分子链组成的三维网状结构，它能显著的溶胀于水但是不溶解于水，由于水和凝胶网络的亲和性，水可能以键合水、束缚水和自由水等形式存在于高分子网络中而失去流动性，因此纳米凝胶能够保持一定的形状。

它们可以作为一种药物载体，而且也可以通过盐键，氢键或者疏水作用自发的结合一些生物活性分子。

高分子电解质的纳米凝胶可以稳定地结合带相反电荷的小分子药物和生物大分子，比如寡或多聚核苷酸（siDNA，DNA）和蛋白质。

纳米凝胶可以很好的作为药物运输载体是因为它们有很高的负载能力，高的稳定性，更重要的是相对于普通的药物纳米载体，它们对环境敏感，比如离子强度，pH和温度。

还原敏感性材料是通过在高分子材料的主链、侧链或者交联结构中引入二硫键合成得到的。

由于细胞内外谷胱甘肽等还原性物质的浓度相差较大,形成了巨大的还原势能梯度,还原敏感性材料作为药物输送的载体,能够在循环系统和细胞外液中保持稳定,而进入细胞后在高浓度的还原性物质作用下迅速降解、释放药物,从而显著提高核酸药物转染效率,降低高分子材料的毒性,有望作为理想的核酸药物载体。

摘要
当下，化疗在恶性肿瘤治疗上有着不可取代的地位。

然而传统的化疗药物制剂缺少靶向性，会对正常的组织造成严重的损伤，很难达到预期的疗效。

为了解决这种情况，我们的研究用了一种易于制备的还原反应多肽纳米胶作为载体靶向地向细胞内肿瘤呈递抗癌药物。

阿霉素（DOX）是一种典型的治疗肿瘤药物，通过连续的分散和透析方法与纳米胶结合，药物装载效率（DLE）达到56.8%。

被装载的DOX呈现出一种流体性质，半径在56.1±3.5nm，其中谷胱甘肽加速DOX的释放，能有效的被肿瘤细胞吸收并且能有效的抑制肿瘤细胞的增值。

此外，在肝癌细胞（HepG2）移植的肝癌BALB/c裸鼠中，对比了包装了的DOX和未包装的DOX，被纳米胶包装的DOX能上调肝癌聚集并且能有效靶向抑制肿瘤。

我们进一步用组织病理学和免疫组化分析确定了纳米胶包装的DOX能增强对肿瘤的抑制效果。

进一步的，我们通过各种监测，如体重，组织病理学分析实验，骨髓细胞微核实验（BMMR）和白细胞数目（WBCs），器官和血液的临床数据都表明纳米胶包装的DOX在活体内出色的安全性。

并且，无论在活体还是在体外，具有可控制的大规模的制备和优良的性能。

还原反应多肽纳米胶在呈递抗肿瘤药物和临床化疗方面都具有巨大的潜力与前景。

研究意义
传统的化疗药物制剂缺少靶向性，会对正常的组织造成严重的损伤，很难达到预期的疗效。

为了解决这种情况，我们的研究用了一种易于制备的还原反应多肽纳米胶作为载体靶向地向细胞内肿瘤呈递抗癌药物。

在静脉注射后，装载了药物的纳米胶能保持药物的完整性并且在体内循环的时候，只有很少的抗癌药物溢出，并且释放药物引起的负载能引起体内的谷胱甘肽浓度变高，在体内和体外都呈现出了良好的抑制肿瘤性质和安全性。

此外，一些其他疏水的抗肿瘤药物也能被纳米胶包装。

综上所有的优点都展现出还原反应纳米胶在恶性肿瘤化疗上巨大的前景。

引言
目前，化疗仍然是众多治疗肿瘤的方法中最重要的一种方法。

虽然现在人们仍不断开发各种抗癌的药物，但是化疗仍然存在严重的缺陷，比如抗肿瘤药物在人体内自由扩散从而对正常组织产生严重的影响。

21世纪纳米技术的发展极大的推进了科学技术的新高度，极大的促进了药学的发展。

最近，越来越多的研究人员使用各种聚合物纳米颗粒，例如，胶束、囊泡以及纳米凝胶，通过临床诊断来控制抗肿瘤药的作用。

智能药物输送系统可以延长在血液中循环的时间，提高对肿瘤内堆积物的选择，来增强过滤的效果，从而提高治疗的效果和降低药物对系统的毒性。

（为什么研究）
鉴于肿瘤细胞核正常细胞的代谢速度和途径的不同，在微观环境中，肿瘤组织呈现低氧、低糖和较低的PH值。

更有趣的是，在微观环境中，恶性细胞和正常细胞内都呈现酸性和还原性。

也就是说，细胞内外之间的PH值和谷胱甘肽的浓度存在显著的差异。

详细的来说，细胞内的PH为5-6.5，而谷胱甘肽的数量却是细胞外的50-1000倍。

因此，刺激响应的强度吸引了聚合物纳米颗粒更加关注对抗癌药物的药物传输领域。

所有的聚合物纳米粒子，纳米凝胶表现出的良好的应用前景，可实际应用于化学和三维物理组合的稳定、和谐，有益于微观外环境对于刺激的反应以及载药能力的大小。

为了制备加载药物的纳米凝胶，小分子抗癌药物首先分散到纳米凝胶的芯，然后通过透析过滤掉外面的游离药物。

静脉注射到体内后，通过实体瘤的高通透性和滞留效应将载药纳米凝胶选择性地聚集到病变组织。

只要载体纳米凝胶由通过内吞作用的肿瘤细胞摄取，就能在细胞内微环境内有效载荷瞬时释放出载体。

在过去的三年里，一系列细胞内微环境敏感性凝胶法制备了在我们组[ 3,15,29–智能抗肿瘤药物的输运33 ]。

特别是，还原反应的多肽纳米凝胶可调性能用一步法合成轻快开环聚合（ROP）的单官能团和双功能肽的N-羧酸酐（NCA）[ 3,29 ]。

简单和有效的合成工艺，
可调大小和响应能力，具有良好的生物降解性和生物相容性，并具有较高的药物负载能力赋予上述还原反应的多肽迷人的潜在的临床应用的纳米凝胶。

不过，验证了改进的有效性和安全性载药纳米凝胶在体内尚未披露。

（前人的研究）
在初步研究的基础上，还原敏感性甲氧基聚（乙二醇）聚L-苯丙氨酸聚L-胱氨酸（mpegp （LP联合LC））的合成是纳米凝胶为选择性内LP NCA和LC NCA开环聚合体外抗肿瘤药物的体外抗肿瘤作用及其在体内的研究（计划1）。

通常，阿霉素（DOX）装入纳米凝胶
作为临床应用抗肿瘤药物的模型。

DOX纳米凝胶（简称NG／DOX）显示减少依赖释放行为和有效的细胞增殖能力体外抑制。

更重要的是，改进后的瘤内积累，阿霉素载体纳米凝胶作为临床化疗恶性肿瘤的新型智能配方，与释放盐酸阿霉素(DOXHCl)相比,阿霉素载体纳米凝胶在生物体内安全调节上和增强肿瘤生长抑制表现出良好的前景。

（引出阿霉素载体纳米凝胶，并说明其优势）
2.2阿霉素封装
通过序列分散与透析法将DOX加载到凝胶。

纳米凝胶（50毫克）首先被分散在
20毫升的N，N-二甲基甲酰胺（DMF），然后盐酸阿霉素（10毫克）溶于上述溶液中，并为12小时，在室温下。

随后，2毫升磷酸盐缓冲生理盐水（PBS；0.01米）和18毫升的MilliQ 水缓慢加入上述混合物。

最后混合溶液在室温下搅拌12小时，随后透析在MilliQ水24 h（截留分子量（MWCO）= 3500大）。

的MilliQ水取代每2小时。

最后过滤后冷冻干燥得到了阿霉素载体纳米凝胶。

检测载药量（DLC）和载药效率（DLE），1毫克的载药纳米凝胶溶解10毫升DMF和搅拌12小时室温。

和然后，通过检测荧光药物纳米凝胶重量在光子技术国际（PTI）荧光光谱菲利克斯4.1.0软件的主系统（PTI，劳伦斯维尔，NJ，USA；Kex = 480 nm）。

DLC和DLE 通过公式进行计算后
2.3表征
通过一个jem-1011传输电子显微镜（透射电镜；JEOL，东京，日本）检测阿霉素载体纳米凝胶的形态。

阿霉素载体纳米凝胶的水动力半径（RHS）在磷酸盐缓冲生理盐水中浓度是0.2毫克1或在10毫米谷胱甘肽动态激光光散射（DLS）在wyattqels测量仪器（黎明的女神，怀雅特技术公司，圣塔巴巴拉，美国加利福尼亚州），散射角是在90。

用MilliQ水通过粒度分析仪（海文仪器有限公司，霍尔茨维尔，NY，USA）测定Zeta电位为0.2毫克/ bi-90plus 粒子浓度。

2.4阿霉素的释放
确定DOX的释放曲线，称重悬浮在10毫升无PBS或10毫米的谷胱甘肽冷冻干燥的阿霉素载体纳米凝胶，然后转移到透析袋（截留分子量为3500 Da）。

释放实验是由放置端密封透析袋成100毫升释放介质在37摄氏度以恒定的晃动在75转。

在预选的时间间隔，2毫升的释放介质中取出，用等体积的新鲜培养基补充。

这个释放量采用荧光分光光度计测定阿霉素（Kex = 480 nm）。

2.5细胞培养
人肝癌HepG2细胞在高糖DMEM培养基（培养液）培养，添加10%（v/v）胎牛血清（FBS）、青霉素（50 IU，1）和链霉素（50单位1）度在5%（V/V）二氧化碳（二氧化碳）。

2.6细胞内阿霉素的释放
细胞摄取和细胞内阿霉素载体纳米凝胶释放阿霉素用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）和流式细胞仪（FCM）对HepG2细胞检测。

2.7. Cytotoxicity assays
The cytotoxicities of free DOX_HCl and NG/DOX were evaluated by a MTT assay. 8000 HepG2 cells
per well were seeded in 96-well plates in 200.0 lL of complete HG-DMEM, incubated for 24 h, and then pretreated with 10.0 mM GSH for 2 h. The cells without GSH pretreatment were used as control. The culture medium was removed, and the cells were washed three times with PBS. And then, 200.0 lL of fresh media containing free DOX_HCl or NG/DOX at different DOX_HCl doses from 10.0 to 0.16 lgmL_1 were added into each well. The cells were subjected to MTT assay after being incubated for another 24, 48, or 72 h. The absorbance of above solution at 490 nm was measured on an ELx808 microplate reader (Bio-Tek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA). The relative cell viability was calculated by comparing the absorbance with control well without any DOX formulations (Eq. (3)).
2.7 细胞毒性实验
DOX-HCL和NG/DOC（游离的盐酸阿霉素以及阿霉素载体凝胶）在细胞系中的毒性是由MTT 法【MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。

其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能】进行评估。

设置每孔8000 HepG2细胞在96孔板中接种。

于200微升HG-DMEM中培养24小时，然后用10.0毫摩尔的谷胱甘肽预处理2小时。

设置未经谷胱甘肽预处理的细胞用作对照。

将细胞除去，用PBS洗涤培养基三次。

然后，从0.16到10.0毫克每毫升设置不同剂量的游离盐酸阿霉素或是阿霉素载体凝胶作为200微升新鲜培养基的成分加入到每个孔中。

另外，将细胞培养24，48，或72小时后进行MTT测定。

在ELx808酶标仪（BIO-Tek的仪器公司，威努斯基，VT，USA）上设定490nm以上的波长测定溶液的吸光度。

通过比较对照组样品的吸光度能够发现细胞存活率良好。

2.8. Animal procedures
5-week-old male BALB/c nude mice weighting 16 ± 0.2 g were provided by the Animal Center of Jinlin University (Changchun,PR China). All animal experiments were conducted in accordance with the Guidelines for Animal Care and Use of Jilin University, and all efforts were made to minimize the suffering. The tumorxenografted nude mouse model was prepared by the subcutaneous injection in the armpits of right anterior limbs with 100.0 lL of cell suspension containing 1.5 _ 106 HepG2 cells in PBS.
2.8 动物实验流程
选取由吉林大学动物中心（长春，PR中国）提供的5周龄雄鼠（重量在16±0.2克之间）作为实验材料。

【本实验中的一切操作均按照动物实验要求严格进行并尽一切努力，尽量减少实验对象的痛苦】。

针对小鼠模型异种移植物的制备是通过在右前肢体的腋下带进行皮下注射100.0微升1.5*106 HepG2的细胞悬浮液。

2.9. Tissue distribution assays
The tissue distribution of DOX after intravenous injection of different formulations was qualitatively or semi-quantitatively assessed by ex vivo DOX fluorescence imaging of major internal organs and tumor. When the tumor grew up to about 300 mm3, NS, or free DOX_HCl or NG/DOX at a DOX_HCl dose of 6.0 mg per kg body weight (mg (kg BW)_1) was injected intravenously. The nude mice were sacrificed at 6 or 12 h post-injection, and major organs consisting of heart, liver, spleen, lung, and kidney, and tumor were excised and washed with PBS. The ex vivo DOX fluorescence imaging was obtained using the Maestro in vivo Imaging System (Cambridge Research & Instrumentation Inc., Woburn, MA, USA). In addition, the average signals were also semi-quantitatively analyzed using MaestroTM 2.4 software from the same company. 2.9组织分布测定
不同阿霉素制剂静脉注射后的的组织分布是定性或半定量由主要内部器官和肿瘤的离体的荧光成像进行评估。

按照6.0毫克每千克（小鼠体重）的剂量将游离DOX-HCL静脉注射在小鼠体。

当肿瘤长到大约300 mm3时，将小鼠在6或12小时后注射处死，并且将其心脏，肝，脾，肺，肾和肿瘤等主要器官切除并用PBS洗涤。

用体内成像系统（剑桥研究与仪表公司，沃本，MA，USA）获得DOX荧光成像。

此外，该信号也使用MaestroTM2.4软件从同一公司进行定量分析。

2.10. In vivo antitumor assessments
From the second day after the inoculation of HepG2 hepatoma (that is, Day 1), the tumor volumes and body weights were monitored every two days. At 11 days after inoculation, the tumor volume grew to around 90 mm3, and then the nude mice were randomly divided into 5 groups (n = 10), i.e., normal saline (NS), DOX_HCl, or NG/DOX at a DOX_HCl dose of 3.0 or 6.0 mg (kg BW)_1. The DOX formulations were noted as DOX/3.0, DOX/6.0, NG/DOX/3.0, and NG/DOX/6.0, respectively. At the same time, the treatments were started, i.e., 100.0 lL of NS and various DOX formulations in NS were injected into tail vein for 4 times every 5 days. The antitumor efficacy and security in vivo were evaluated by detecting the tumor volumes (Eq. (4)) and body weights. 2.10 体内抗肿瘤能力评估
从肝癌HepG2试剂接种（此时为第一天）后的第二天开始，对小鼠体内的肿瘤体积及其体重每两天进行一次监测。

在接种后的第11天，小鼠体内肿瘤体积增长到约90 mm3时，将小鼠随机分为5组，将阿霉素制剂分别标记为DOX/3.0，DOX/6.0，NG/ DOX/3.0和NG / DOX/6.0的不同浓度梯度对小鼠进行注射。

实验开始后，分别注入尾静脉，频率为每5天注射一组，一组注射4次。

体内的抗肿瘤功效和安全性均通过检测肿瘤体积（公式（4））和体重评估。

公式(4)为：V(mm3)=(L*S2)/2
2.11. Histopathological and immunohistochemical analyses of tumor tissues
The HepG2 hepatoma-xenografted BALB/c nude mice were sacrificed by cervical dislocation on Day 29, i.e., 3 days after the last injections. The tumors were isolated and fixed in 4% (W/V) paraformaldehyde for 24 h, and followed by dehydration, clearing, wax infiltration, and embedding. About 5 lm thick paraffin sections were prepared for hematoxylin and eosin (H&E) staining, and _3 lm thick paraffin sections were prepared for immunohistochemical staining, including caspase-3, survivin, Bax, and Bcl-2, to assess the pathological and immunological changes in tumor tissues, respectively. The used instruments were Leica RM 2245 paraffin machine (Leica, Germany), Leica HI1220 booth machine (Leica, Germany),
2.11肿瘤组织病理学和免疫组化分析
将上述的肝癌HepG2-异种移植的后的小鼠通过颈脱位法在第29天处死，即最后一次注射后的第3天。

肿瘤分离并固定在4％（w / v）多聚甲醛中24小时，并随后脱水，灭菌，蜡渗透，和固定。

进行苏木精和曙红（H＆E）染色制备，制成5毫米厚石蜡切片；并且制备用于免疫组织化学染色的3毫米厚的石蜡切片。

整个过程中需要胱天蛋白酶-3，和Bcl-2试剂，以分别评估肿瘤组织中的病理学和免疫学变化。

所使用的仪器是徕卡RM2245石蜡机（德国徕卡），徕卡HI1220展位机（德国徕卡）奥林巴斯BX51显微镜（Olympus，日本）以及Motic图像分析系统（麦克奥迪实业集团有限公司;厦门，中国）。

2.12. Histopathological and biochemical analyses of organs
Besides tumor tissues, other major internal organs and tissues, i.e., heart, liver, spleen, lung, kidney, and sternum, were also collected simultaneously. The organs from normal nude mice were used as control. All the organs were divided into two parts: (i) one part except sternum was fixed with 4% (W/V) PBS-buffered paraformaldehyde for the histopathological analyses through
H&E staining with a similar protocol as tumor tissue; (ii) the other part was prepared to detect the organ function-related biochemical indicators, including CK-MB, LDH, ALT, AST, BUN, and Cr, by ELISA in accordance with the instructions of manufacturer. The histopathological and immunohistochemical results were detected by Olympus BX51 microscope and analyzed with Motic image analysis system.
2.12器官的病理组织学和生化分析
除了肿瘤组织，其他主要内脏器官和组织，即心脏，肝，脾，肺，肾和胸骨，也同时被收集，将其与正常小鼠器官作为对照。

所有的器官被分为两部分：（ⅰ）除了胸骨，一部分用4％（w / v）的PBS缓冲的多聚甲醛溶液对肿瘤组织做H＆E染色处理来进行组织病理学分析; （ⅱ）材料的另一部分用作检测器官功能相关的生化指标，通过ELISA法严格按照标准进行包括CK-MB，LDH，ALT，AST，BUN和Cr等相关成分的分析。

再通过奥林巴斯BX51显微镜针对组织病理学和免疫组化结果进行检测，并与麦克奥迪图像分析系统对照分析。

2.1
3. Histopathological assays of sternums and detections of bone marrow cell micronucleus rates (BMMRs)
In addition, a part of sternum from BALB/c nude mice was placed in 10% (V/V) formic acid-formalin solution, decalcified, and fixed for 10 days. The data from normal nude mice were used as control. And then, the tissues were dehydrated, and followed by clearing, wax infiltration, and embedding. 4 paraffin sections with a thickness of _5 lm for each sternum were collected for H&E staining. The BMMR was evaluated from the H&E-stained section.
2.13胸骨组织病理学检测和骨髓细胞微核率检测（BMMRs）
此外，将BALB / c小鼠胸骨的一部分固定在10％（V / V）甲酸- 甲醛溶液中，进行脱钙处理，固定10天。

设置正常小鼠的相关实验作为对照。

然后，将组织脱水，并随后通过清除，蜡渗透，和嵌入制成厚度为5mm的胸骨石蜡切片进行H＆E染色。

该胸骨组织病理学检测和骨髓细胞微核率检测（BMMR）通过H＆E染色部分进行评估。

2.14. White blood cell (WBC) count and blood biochemical analyses
On Day 29, 20.0 lL of anticoagulated blood from each nude mouse through enucleation method was taken to count the WBCs. The other 300.0 lL of blood without anticoagulant was centrifuged at 3000 rpm for 10 min. The serum was collected to detect the clinical biochemical parameters: CK-MB, LDH, ALT, AST, BUN, and Cr, by ELISA according to the instructions of manufacturer. The data from normal nude mice were used as control.
2.14白细胞（WBC）计数和血液生化分析
在第29天，通过小鼠眼球摘除方法将添加抗凝剂的20微升血液添加到白细胞中。

再将不添加抗凝剂的300微升血液以3000rpm离心10分钟。

收集血清以检测临床生化参数：CK-MB，LDH，ALT，AST，BUN和Cr，严格按照ELISA法要求实验。

以正常小鼠中的相关实验数据用
来作为对照。

2.15. Statistical analyses
All tests were implemented at least three times, and the data were expressed as mean ± standard deviation (SD). Statistical analysis was performed using SPSS 13.0 for Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, USA), P < 0.05 was considered statistically significant, and P < 0.01 and P < 0.001 were considered significant differences
2.15统计分析
所有平行实验均进行至少三次，并且将数据表示为平均值±标准偏差（SD）。

采用Windows 的SPSS13.0软件进行统计分析（SPSS公司，芝加哥，IL，USA），P<0.05为差异显著，和P <0.01或P <0.001为差异及显著。

3.1实验结果
阿霉素封装和阿霉素载体纳米凝胶表征所制备的还原反应凝胶组成的亲水性和疏水性的甲氧基聚（乙二醇）聚L-苯丙氨酸聚L-胱氨酸。

甲氧基聚（乙二醇）的成分是指给纳米凝胶的'隐形”功能和其扩展纳米凝胶在血液循环中的半衰期。

LP的部分能增强纳米内核的亲水性，从而上调纳米载药能力并提高了其稳定性。

LC组成的二硫键段并赋予还原反应纳米凝胶阿霉素，一个模型疏水性抗肿瘤药物，装入纳米核心通过连续的分散和透析技术（方案1）。

分别为10.2%和56.8%重量的DLC和DLE阿霉素载体纳米凝胶。

如图1a所描绘的，阿霉素载体纳米凝胶具有球形形态和表观直径约在60 nm。

检测到阿霉素载体纳米凝胶的水动力半径56.1±3.5 nm（图1B）。

阿霉素载体纳米凝胶水动力大小近两次从电镜检测归因于在水下膨胀的状态，。

显然，一个适当的大小有利于阿霉素载体纳米凝胶在肿瘤部位的选择性聚集通过实体瘤的高通透性和滞留效应效应。

此外，阿霉素载体纳米凝胶的还原敏感性首先经谷胱甘肽的水动力变化在试验介质后的补充。

如图1c所示，水动力阿霉素载体纳米凝胶在磷酸盐缓冲液没有谷胱甘肽保持在56纳米，而增加从56.5±5.6到97±8.5 nm与谷胱甘肽的培养基孵育时间从0增加到43小时了，谷胱甘肽首先扩散到拉登纳米核心并减少二硫键（_s_s_）两个巯基（_sh）。

作为一个结果，观察肿加载纳米凝胶。

值得注意的是，二硫键的降解没有造成纳米凝胶的拆卸。

这种现象应归因于共聚物降解后残留性。

正如之前所报道的，结果间接证明阿霉素载体纳米凝胶[ 3 ]还原反应。

此外，测得约1.5毫伏是纳克/ DOX 的Zeta电位。

微弱的正电荷应归因于装载阿霉素分子中的含有氨基成分。

3.3
上图是对主要的内脏器官和肿瘤组织注射阿霉素载体纳米凝胶或游离盐酸阿霉素{剂量为6.0毫克（kg体重）}后6小时和12小时的离体DOX荧光图像（A）和平均荧光强度的半定量分析（B）。

如图A所示，在肿瘤部位注射NG/DOX后6小时和12小时的效果都比注射游离DOXHCl{剂量为6.0毫克（kg体重）}有效。

这样的结果是由于NG / DOX对肿瘤组织产生了EPR效应。

此外，在注射后6~12小时的时间区间内，随着时间的推移，我们观察到NG/DOX 组中的异常DOX逐步积累，而DOXHCl组却发生了相反的结果，这是因为在DOXHCl组中使用的游离药物的代谢速率更快。

除了肿瘤组织，在肾脏和肝脏的DOX制剂中也观察到相对较强的DOX荧光，这种现象表明，该药物主要由肾脏和肝脏代谢。

如图B所示，NG / DOX组中的异常DOX积累增加至原来的1.3倍，而在注射后6~12小时的时间区间内，随着时间的推移，其又逐步降低至原来的0.7倍。

以6.0毫克（kg体重）的剂量注射后12小时，DOX组的异常信号较游离DOXHCl组平均高出2.1倍。

更有趣的是，异常的积累/ DOX显然在与该自由DOXHCl，分别为（P <0.001）的比较，下调至肾0.8-和0.9倍在6和12小时后注射。

以上数据表明，NG/DOX在正常器官中较游离DOXHCl表现出更强。